Name: Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprenda a isolar epitélio uterino de alta pureza de útero de rato para cultivo de organoides endometriais 3D. Este método utiliza dissociação enzimática e mecânica para estudar sinalização endometrial e doenças uterinas.

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Agradecemos à Dra. Stephanie Pangas e ao Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) pela leitura crítica e edição do nosso manuscrito. Os estudos foram apoiados pelas bolsas R00-HD00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) e R01-HD110038 (M.M.M.), e pelo NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. possui um Prêmio de Gravidez de Próxima Geração do Burroughs Wellcome Fund.

O manejo de camundongos e estudos experimentais foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine e diretrizes estabelecidas pelo NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Isolamento do epitélio uterino de camundongos usando métodos enzimáticos e mecânicos
NOTA: Esta seção descreve as etapas necessárias para estabelecer, passar, congelar e descongelar organoides endometriais epiteliais de camundongos usando um andaime de matriz de gel. Estudos anteriores determinaram que culturas ótimas de organoides endometriais de camundongos são estabelecidas a partir de camundongos durante a fase4 do cio, o que pode ser determinado pelo exame citológico de um swab vaginal15. Camundongos WT fêmeas adultas (6-8 semanas de idade, híbrido C57BL/6J e 129S5/SvEvBrd) foram utilizados para todos os experimentos. Os camundongos foram humanamente eutanasiados de acordo com as diretrizes aprovadas pela IACUC usando sedação de isoflurano seguida de desarticulação cervical. Uma vez que os ratos são sacrificados, os seguintes passos devem ser seguidos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais e soluções utilizados neste protocolo.
<ol><li>Deixe a matriz de gel descongelar no gelo por aproximadamente 1-2 h antes do uso.</li>
	<li>Para dissecar o rato, use uma tesoura para fazer uma incisão de linha média no abdômen e descasque suavemente a pele para expor a camada peritoneal subjacente. Use fórceps para segurar a camada peritoneal e fazer incisões laterais com a tesoura para expor o conteúdo abdominal.<ol><li>Localize os chifres uterinos movendo suavemente as almofadas de gordura abdominal para o lado. Disseque-os primeiro segurando-os na junção cervical e usando uma tesoura para cortar ao longo da gordura mesentérica. Após a dissecção do útero do rato, remova completamente o tecido adiposo do chifre uterino com uma pequena tesoura. NOTA: Mantenha a esterilidade durante o isolamento celular, esterilizando todas as ferramentas de cirurgia antes do uso, pulverize o abdômen do rato com etanol a 70% e execute todas as etapas após a dissecção sob um capuz de cultura de tecido estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Corte cada chifre uterino em pequenos fragmentos, cada um medindo aproximadamente 4-5 mm.</li>
	<li>Coloque todos os fragmentos uterinos de um útero em um poço de uma placa de 24 poços contendo 0,5 mL de tripsina a 1%. Permita que a solução enzimática entre no lúmen uterino, causando separação enzimática do epitélio endometrial do estroma subjacente.</li>
	<li>Incubar a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C por aproximadamente 1 h.</li>
	<li>Após a incubação de 1 h, transferir os fragmentos uterinos para uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 1 mL de solução tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco.</li>
	<li>Sob um microscópio de dissecção, use pinça fina e uma pipeta de 1 mL para separar mecanicamente o epitélio uterino do tubo uterino. Enquanto segura uma extremidade de um fragmento uterino com a pinça, passe suavemente a ponta da pipeta longitudinalmente através do fragmento, espremendo o epitélio para fora da outra extremidade do tubo uterino. Observe as folhas epiteliais separadas do fragmento uterino sob o microscópio de dissecção.</li>
	<li>Use a pipeta de 1 mL para coletar e transferir suavemente as folhas epiteliais para um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Repita o processo para os fragmentos uterinos restantes, transferindo todas as folhas epiteliais para o mesmo tubo de coleta.</li>
	<li>Pellet as folhas epiteliais dissociadas por centrifugação por 5 min a 375 × g.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante para evitar perturbar a pastilha celular.</li>
	<li>Ressuscite o pellet celular em 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenase + 2 mg/mL de solução de DNase. Pipetar para cima e para baixo aproximadamente 10x, ou até que uma suspensão de célula única seja alcançada.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de DMEM/F12 + 10% de soro fetal bovino (FBS) + antibióticos e centrifugar as células por 5 min a 375 × g. NOTA: Para obter informações adicionais sobre o antibiótico de amplo espectro utilizado para a cultura de células, consulte a Tabela de Materiais.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar as células durante 5 minutos a 375 × g.</li>
</ol>2. Processamento do compartimento estromal
NOTA: Esta seção descreve os protocolos necessários para isolar o compartimento estromal do endométrio de camundongos. Dado o crescente interesse em experimentos de co-cultura epitelial/estromal, é importante ser capaz de processar as populações de células estromais, além das células epiteliais que gerarão organoides.
<ol><li>Uma vez que todo o epitélio tenha sido separado enzimática e mecanicamente dos fragmentos uterinos, as estruturas remanescentes semelhantes a tubos são os compartimentos "estromais/miometriais". Recolher este tecido numa colagenase de 2,5 mg/ml + DNase de 2 mg/ml em solução de HBSS.</li>
	<li>Incubar a amostra estromal/miometrial num agitador de 37 °C durante 15 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 500 μL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos por rato e filtre os fragmentos não dissociados através de um filtro de células de 40 μm.</li>
	<li>Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 375 × g.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos. Adicione a mistura gota a gota a 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibióticos em uma placa de cultura celular de 10 cm. Incubar a placa a 37 °C numa incubadora de cultura de células humidificadas.</li>
	<li>Para gerar coculturas de células epiteliais e estromais endometriais de camundongos, seguir os métodos descritos para organoides endometriais humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno ou livres de andaimes 6,8. NOTA: Embora essas técnicas ainda não tenham sido publicadas para camundongos, elas podem ser adaptadas com base nos protocolos publicados com endométrio humano.</li>
</ol>3. Encapsulamento do epitélio uterino em matriz de gel para estabelecer organoides
NOTA: Mantenha a matriz de gel no gelo até que esteja pronta para ser usada.
<ol><li>Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um volume de matriz de gel que seja 20x maior que o do pellet celular (ou seja, se o pellet celular for de 20 μL, ressuspenda as células com 400 μL de matriz de gel). Ressuspenda o pellet com cuidado para evitar a introdução de bolhas.</li>
	<li>Deixe a matriz de gel/suspensão celular assentar à temperatura ambiente por ~10 min.</li>
	<li>Uma vez que a matriz de gel/suspensão celular se torne um gel semissólido, use uma micropipeta P200 com uma ponta larga de 200 μL para aspirar suavemente 25 μL da matriz de gel/suspensão celular. Dispense três cúpulas separadas de 25 μL por poço de uma placa de 12 poços e permita que a matriz de gel cure por 15 minutos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C.</li>
	<li>Após a cura da matriz de gel, adicione 750 μL de meio organoide a cada poço contendo cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C numa incubadora de cultura de tecidos humidificada. NOTA: A formulação do meio organoide é anotada na Tabela de Materiais. Os organoides geralmente se formam dentro de 4 dias após a cultura inicial.</li>
</ol>4. Análise da expressão gênica de organoides endometriais após tratamento com estradiol
NOTA: Esta secção descreve os métodos utilizados para traçar o perfil da expressão génica de organoides epiteliais endometriais utilizando qPCR em tempo real após o tratamento com estradiol (E2; ver Tabela 1). Como o endométrio está sob o controle cíclico do hormônio ovariano E2, testar a capacidade de resposta dos organoides ao E2 é uma medida importante da função fisiológica. Obtivemos RNA de alta qualidade e geramos mRNA suficiente para traçar o perfil da expressão gênica usando qPCR e/ou sequenciamento de RNA de nossos organoides epiteliais endometriais. Esta seção descreve como coletar organoides e processá-los para análise a jusante da expressão gênica. O meio de tratamento selecionado reflete o utilizado para tratar células endometriais cultivadas. No entanto, deve-se ressaltar que esse meio de tratamento pode ser otimizado de acordo, como é feito para o tratamento de culturas 3D endometriais humanas com hormônios 8,16,17.
<ol><li>Cultive os organoides endometriais conforme descrito acima.</li>
	<li>Remova o meio organoide e substitua-o por 750 μL de meio de fome quatro dias após a semeadura. Incubar durante a noite.</li>
	<li>Na manhã seguinte, remova o meio de fome. Adicionar 750 μL de meio de tratamento contendo um veículo ou 10 nM E2. Incubar por 48 h.</li>
	<li>Prossiga com o isolamento de RNA seguindo o protocolo do fabricante do kit.</li>
</ol>5. Análise histológica dos organoides endometriais
NOTA: A imagem das características morfológicas dos organoides endometriais é fundamental para avaliar o efeito celular de fatores de crescimento, manipulações genéticas ou inibidores de pequenas moléculas. Esta seção descreve as técnicas utilizadas para fixar, processar e visualizar organoides epiteliais endometriais usando corantes histológicas e coloração imunofluorescente de anticorpos.
<ol><li>Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de paraformaldeído a 4% em 1x PBS. Coloque-os no gelo.</li>
	<li>Aspirar o meio dos poços da placa de 12 poços que contém os organoides.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de 1 mL com uma ponta de corte, transfira 500 μL de paraformaldeído a 4% para cada poço e desprenda suavemente as cúpulas da matriz de gel do fundo da placa.</li>
	<li>Aspirar suavemente todas as cúpulas da matriz de gel para a ponta da pipeta e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Fixar os organoides colocando-os num rotador a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Na manhã seguinte, centrifugar o tubo a 600 × g por 5 min para peletizar os organoides. Remova suavemente a solução de paraformaldeído a 4% com uma pipeta e descarte o produto. Lave os organoides 2x com etanol a 70%.</li>
	<li>Após a última lavagem, remova todos, exceto 50-100 μL de etanol do tubo. Deixe o tubo de lado.</li>
	<li>Coloque um tubo de gel de processamento de amostra em banho-maria e micro-ondas por ~ 30 s para derreter o gel. Certifique-se de que o gel de processamento da amostra não ferva monitorando a consistência do gel. NOTA: Uma vez que o gel de processamento da amostra é derretido, mas não fervendo quente, trabalhe rapidamente para encapsular os organoides.</li>
	<li>Transfira gel de processamento de amostra suficiente para cobrir toda a superfície do molde (aproximadamente 250 μL).</li>
	<li>Enquanto o gel de processamento da amostra ainda está fundido, transfira rapidamente os 50 μL de solução de etanol a 70% contendo os organoides. Certifique-se de que os organoides sejam afundados ou empurrados para a parte inferior do molde.</li>
	<li>Coloque o molde de histologia em um balde de gelo e permita que o gel de processamento da amostra esfrie e solidifique.</li>
	<li>Uma vez que o gel de processamento da amostra esteja completamente seco, transfira cuidadosamente o quadrado do gel de processamento da amostra para um saco de amostra, mantendo o controle do plano onde os organoides estão localizados.</li>
	<li>Colocar a bolsa em um histológico e processá-la utilizando métodos padronizados utilizados para fixação de formalina e incorporação de tecidos de parafina18.</li>
	<li>Após a fixação e incorporação em parafina, seção em seções de 5 μm usando um micrótomo19. Prossiga com os procedimentos padrão de coloração de hematoxilina e eosina (H & E) ou imunocoloração, conforme descrito abaixo.</li>
</ol>6. Coloração de hematoxilina e eosina
<ol><li>Desparafinizar as seções da seguinte forma: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% de etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min em hematoxilina; água da torneira (3 x 5 s); 1 min em eosina.</li>
	<li>Desidratar os cortes da seguinte forma: 60% de etanol, 3 min; 80% de etanol, 3 min; 95% de etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.</li>
	<li>Monte usando o meio de montagem.</li>
</ol>7. Coloração por imunofluorescência
<ol><li>Desparafinizar as seções conforme descrito na etapa 6.1.</li>
	<li>Realizar a recuperação de antígenos<ol><li>Submerja as lâminas em solução de recuperação de antígeno em um recipiente seguro para micro-ondas.</li>
		<li>Micro-ondas em fogo alto por 20 min, usando intervalos de 5 min para garantir que a solução não ferva.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a conclusão da etapa de recuperação de antígeno de 20 minutos, permita que as lâminas esfriem no gelo por 40 minutos enquanto ainda estão submersas no tampão de recuperação de antígenos.</li>
	<li>Lave as lâminas com 1x TBST por 3 min</li>
	<li>Bloquear as lâminas incubando em BSA a 3% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubação de anticorpos primários<ol><li>Diluir o anticorpo em BSA a 3% em TBST (1:50-1:1.000, dependendo de Ab).</li>
		<li>Incubar durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.</li>
		<li>Lave 3 x 5 min com TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubação secundária de anticorpos<ol><li>Diluir o anticorpo em 3% de BSA (em TBST) (1:250) ou em soro de burro normal a 5%.</li>
		<li>Incubar por 1 h à temperatura ambiente (RT) no escuro, uma vez que o anticorpo é conjugado a um fluoróforo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração nuclear<ol><li>Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 em TBST.</li>
		<li>Incubar por 5 min no RT.</li>
		<li>Lave 2 x 5 min com TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem<ol><li>Use uma gota de meio de montagem para montar a tampa.</li>
		<li>Sele a tampa usando esmalte no dia seguinte.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Aqui, descrevemos métodos para gerar organoides epiteliais endometriais a partir do endométrio de camundongos e os protocolos rotineiramente utilizados para sua análise a jusante. Os organoides endometriais são uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos que controlam doenças relacionadas ao endométrio, como endometriose, câncer de endométrio e falha de implantação. Estudos de referência publicados em 2017 relataram as condições para a cultura de culturas de longo prazo e renováveis de organoides endometriais de e...

O endométrio - o tecido mucoso do revestimento interno da cavidade uterina - é um tecido único e altamente dinâmico que desempenha papéis críticos na saúde reprodutiva de uma mulher. Durante a vida reprodutiva, o endométrio tem o potencial de sofrer centenas de ciclos de proliferação, diferenciação e quebra, coordenados pela ação concertada dos hormônios ovarianos - estrogênio e progesterona. Estudos de camundongos geneticamente modificados descobriram mecanismos biológicos básicos que sustentam a resposta endometrial aos hormônios e o controle da implantação embrionária, a decidualização das células estromais e a gravidez1. Estudos in vitro, no entanto, têm sido limitados devido a dificuldades na manutenção de tecidos endometriais primários de camundongos não transformados em culturas tradicionais de células 2D 2,3. Avanços recentes na cultura de tecidos endometriais como sistemas de órgãos 3D, ou organoides, apresentam uma nova oportunidade para investigar vias biológicas que controlam a regeneração e diferenciação de células endometriais. Sistemas organoides endometriais de camundongos e humanos têm sido desenvolvidos a partir de epitélio endometrial puro encapsulado em várias matrizes4,5, enquanto o endométrio humano tem sido cultivado como coculturas epiteliais/estromais livres de andaimes 6,7 e, mais recentemente, como assembloides epiteliais/estromais encapsulados em colágeno8 . O crescimento e o potencial regenerativo das culturas organoides epiteliais são apoiados por um coquetel definido de fatores de crescimento e inibidores de pequenas moléculas que foram determinados empiricamente para maximizar o crescimento e a regeneração dos organoides 4,5,9. Além disso, a capacidade de congelar e descongelar organoides endometriais permite o banco a longo prazo de organoides endometriais de camundongos e humanos para estudos futuros.
Camundongos geneticamente modificados revelaram as complexas vias de sinalização que controlam a gravidez precoce e a decidualização, e têm sido usados como modelos de perda de gravidez, câncer de endométrio e endometriose. Esses estudos genéticos foram amplamente alcançados com a deleção específica de células de alelos ladeados por loxP ("floxed") usando cre recombinases que são especificamente ativas em tecidos reprodutivos femininos. Esses modelos de camundongos incluem o amplamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tem forte atividade de recombinase nos tecidos epiteliais e estromais endometriais, a lactoferrina i-cre, que induz a recombinação epitelial endometrial em camundongos adultos11, ou Wnt7a-cre, que desencadeia deleção epitelial-específica em tecidos derivados de Müller12 . A cultura de tecidos endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados como organoides 3D tem proporcionado uma excelente oportunidade para investigar a biologia endometrial e facilitar a identificação de fatores de crescimento e vias de sinalização que controlam a renovação e diferenciação celular endometrial13,14. Métodos para o isolamento e cultura de tecido endometrial de camundongos são descritos na literatura e relatam o uso de várias estratégias enzimáticas para o isolamento do epitélio uterino para posterior cultura de organoides epiteliais endometriais4. Embora a literatura anterior forneça uma estrutura crítica para protocolos de cultura de organoides epiteliais endometriais 4,5,6, este artigo fornece um método claro e abrangente para gerar, manter, processar e analisar esses organoides. A padronização dessas técnicas é importante para acelerar os avanços no campo da biologia reprodutiva das mulheres. Aqui, relatamos uma metodologia detalhada para a purificação enzimática e mecânica do tecido epitelial endometrial de camundongos para a subsequente cultura de organoides endometriais em um andaime de matriz de gel. Também descrevemos as metodologias para análises histológicas e moleculares a jusante dos organoides epiteliais endometriais de camundongos encapsulados em matriz de gel.

<table><tbody><tr><td><forte>Formulação de mídia organoide</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</forte></td><td><forte>Concentração final</forte></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Fator de crescimento reduzido (TFG) Matriz de membrana basal, *Corning</td><td></td><td>354230</td><td>100%</td> livre de LDEV</tr><tr><td>Tripsina do Pâncreas Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; Suplemento (50X), menos vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 inibidor, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng / mL</td></tr><tr><td>Noggin humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rspondin-1 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Humano recombinante FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>HGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Outros suprimentos e reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Concentração final</td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ mL</td></tr><tr><td>de desoxirribonuclease I de pâncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Microplacas de Poliestireno (24-Poços)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Microplacas de Poliestireno (12 Poços)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Células Falcon, 40 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep de RNA Direto-zol (50 &micro; g)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES, sem vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal, carvão vegetal descascado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr> <tr><td>Estratiol (E2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>formaldeído 16% em aquoso solução, EM Grade</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia 1 de Tecido Ranurado</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Base de Encaixe em Aço Inoxidável Moldes</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 provas (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Montagem Média</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de Biópsia de Nylon Epredia</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Gel de Processamento de Amostras</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Eosina Y (amarelada) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Buffer, 20X, pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Ácido cítrico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI Solução (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>diluição 1:1000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montagem Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lâminas de microscópio Fisher</td><td> Óculos</td><td></td> de Cobertura Micro VWR da Scientific 22037246 <td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antibody (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>Diluição 1:50</td></tr><tr><td>Vimentina Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Burro anti-Rato IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>Burro anti-Rabbin IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscópio</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Microscópio de rotina invertido com câmera digital</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Lactoferrina (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTCTCATCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecendo organoides endometriais 3d do útero do rato

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

O tecido endometrial reveste a cavidade interna do útero e está sob o controle cíclico do estrogênio e da progesterona. É um tecido composto por epitélio luminal e glandular, um compartimento estromal, uma rede vascular e uma população complexa de células imunes. Modelos de camundongos têm sido uma ferramenta poderosa para estudar o endométrio, revelando mecanismos críticos que controlam a implantação, a placentação e o câncer. O recente desenvolvimento de culturas organoides endometriais 3D apresenta um modelo de última geração para dissecar as vias de sinalização subjacentes à biologia endometrial. Estabelecer organoides endometriais a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados, analisar seus transcriptomas e visualizar sua morfologia em uma resolução de célula única são ferramentas cruciais para o estudo de doenças endometriais. Este artigo descreve métodos para estabelecer culturas 3D de epitélio endometrial de camundongos e descreve técnicas para quantificar a expressão gênica e analisar a histologia dos organoides. O objetivo é fornecer um recurso que possa ser usado para estabelecer, cultivar e estudar a expressão gênica e as características morfológicas dos organoides epiteliais endometriais.

Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos Estabelecemos organoides do epitélio endometrial de camundongos WT, conforme descrito no protocolo anexado (ver diagrama na Figura 1). Após a dissociação enzimática do epitélio endometrial do rato, as folhas epiteliais foram separadas mecanicamente das células estromais uterinas e posteriormente dissociadas com colagenase para gerar uma suspensão unicelular. Se realizado corretamente, este método de se...

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Este protocolo é significativo, pois mostra uma metodologia passo-a-passo para isolar o epitélio uterino altamente puro do útero de camundongo para a cultura de organoides endometriais. Este método utiliza eficientemente dissociação enzimática e mecânica para isolar o epitélio uterino. As técnicas foram simplificadas para estabelecer, tratar e analisar organoides do epitélio endometrial derivados do epitélio isolado.Comece descongelando a matriz de gel no gelo por aproximadamente uma a duas horas antes do uso. Em seguida, disseque o rato eutanasiado fazendo uma incisão na linha média no abdômen usando uma tesoura e descascando suavemente a pele para expor a camada peritoneal subjacente. Localize os chifres uterinos movendo suavemente as almofadas de gordura abdominal para o lado e segure os chifres uterinos na junção cervical antes de cortá-los ao longo da gordura mesentérica.Após a dissecção do útero do rato, remova completamente o tecido adiposo do chifre uterino com uma pequena tesoura. Uma vez feito, corte cada chifre uterino em pequenos fragmentos, cada um medindo aproximadamente quatro a cinco milímetros. Coloque todos os fragmentos uterinos de um útero em um poço de uma placa de 24 poços contendo 0,5 mililitros de 1% de tripsina.Em seguida, incubar a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura de tecido umidificada de 37 graus Celsius por aproximadamente uma hora para separação enzimática do epitélio endometrial do estroma subjacente. Após a incubação, transfira os fragmentos uterinos para uma placa de cultura de tecido de 35 milímetros contendo um mililitro de solução tamponada com fosfato de Dulbecco ou DPBS. Em seguida, separe o epitélio uterino do tubo uterino sob um microscópio de dissecação, segurando uma extremidade de um fragmento uterino com a pinça e passando suavemente a ponta da pipeta longitudinalmente através do fragmento, espremendo o epitélio para fora da outra extremidade do tubo uterino.Em seguida, observe as folhas epiteliais separadas do fragmento uterino sob o microscópio de dissecção. Em seguida, transfira suavemente todas as folhas epiteliais para o mesmo tubo de 1,5 mililitro usando a pipeta de um mililitro. E pelotar as folhas epiteliais dissociadas por centrifugação a 375 x g por cinco minutos.Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e ressuspenda o pellet celular em 0,5 mililitros de 2,5 miligramas por mililitro de colagenase mais dois miligramas por mililitro de solução de DNA. Pipetar para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes ou até que uma única suspensão celular seja alcançada. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de DMEM F/12 mais 10% de soro fetal bovino ou FBS mais antibióticos e centrifugar as células por cinco minutos a 375 x g.Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de DMEM / F12 mais 10% FBS mais antibióticos e centrifugar as células. Coloque a matriz de gel no gelo até que esteja pronta. Em seguida, remova o sobrenadante das células centrífugas e ressuspenda o pellet celular usando 20 vezes o volume da matriz de gel sem introduzir as bolhas.Deixe a suspensão da célula da matriz de gel assentar à temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Uma vez que a suspensão de células da matriz de gel se torne um gel semissólido, use uma micropipeta P200 com uma ponta larga de 200 microlitros e aspire suavemente 25 microlitros da suspensão celular da matriz de gel. Dispense três cúpulas separadas de 25 microlitros por poço de uma placa de 12 poços e permita que a matriz de gel cure por 15 minutos e uma incubadora de cultura de tecidos umidificada de 37 graus Celsius.Depois que a matriz de gel for curada, adicione 750 microlitros de meio organoide a cada bem contendo cúpula de matriz de gel e incubadora a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada. Imagens de contraste de fase de organoides endometriais de camundongos mostraram que a separação epitelial e de células estromais produziu amostras com não mais de 10% a 15% de contaminação do tipo celular oposto. As células epiteliais endometriais foram montadas em organoides dentro de três a quatro dias.Os organoides endometriais embebidos em parafina fixa em formalina seccionados foram visualizados por coloração de hematoxilina e eosina, que exibiam a camada única de epitélio e os centros ocos, os lúmens dos organoides. A imagem do microscópio de fluorescência mostrou que todas as células dos organoides eram positivas para citoqueratina 8 e continham DAPI, indicando que a fixação, incorporação e processamento dos organoides endometriais é compatível com a imunocoloração baseada em anticorpos. A PCR quantitativa em tempo real mostrou que a estimulação com 10 nanomolares de estradiol aumentou a expressão de lipocalina 2, lactoferrina e receptor de progesterona nos organoides epiteliais, indicando que os organoides epiteliais endometriais podem ser usados com sucesso para medir as alterações na expressão gênica em resposta ao estradiol.É importante garantir que a separação clara do epitélio endometrial seja obtida durante a etapa de dissociação mecânica. Deve-se ser capaz de observar o epitélio emergindo do tubo uterino. Outros métodos incluem o estabelecimento dos organoides epiteliais por encapsulamento em uma matriz de gel.Se desejado, o compartimento estromal pode ser digerido para criar coculturas epiteliais estromais 3D. O método pode ajudar a responder a perguntas sobre os sinais que controlam a renovação do endométrio. Pode ajudar a tratar doenças em mulheres, como endometriose, perda de gravidez e câncer.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma descrição da indução cirúrgica de endometriose em camundongos e ratos por auto-transplante de tecido do útero para a cascata arterial do mesentério intestinal.

Modelo do rato de endometriose cirurgicamente induzida pela Auto-transplante de tecido uterino

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

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Muitos modelos de roedores de endometriose são limitados pela complexidade técnica, reprodutibilidade e/ou necessidade de animais imunocomprometidos ou ratos repórteres especiais. Apresentamos um sistema simplificado de indução de lesão utilizando qualquer camundongo experimental com um sistema de pontuação objetiva e independentemente verificável e sem necessidade de cirurgia de ovariectomia ou sobrevivência.

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Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais (reESCs) de ratos, gerando organoides endometriais de ratos. Este método facilita estudos in vitro de doenças endometriais, permitindo a edição de genes e outras manipulações celulares.

Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Este artigo descreve um protocolo detalhado para produzir um endométrio fino confiável e reprodutível com uma taxa de mortalidade muito baixa e aderências intrauterinas mínimas, injetando etanol a 95% no útero de camundongo em 1-3 minutos.

Estabelecendo um modelo de endométrio fino em camundongos

Este protocolo detalha o desenvolvimento de modelos de camundongos com carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir da derivação de organoides das trompas de Falópio murina, sua modificação genética para recapitular a genética do HGSOC humano e sua introdução na bursa ovariana de camundongos singênicos para o desenvolvimento in vivo de tumores.

Desenvolvimento de Linhagens Organoides Derivadas de Camundongos a partir de Células Epiteliais da Trompa de Falópio para Modelagem de Carcinoma Seroso de Ovário de Alto Grau

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

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Injeção intravítrea para o Estabelecimento de Modelo de Doenças Ocular

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Aprenda a isolar epitélio uterino de alta pureza de útero de rato para cultivo de organoides endometriais 3D. Este método utiliza dissociação enzimática e mecânica para estudar sinalização endometrial e doenças uterinas.

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

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