Name: Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais com alta sensibilidade e precisão. Este método avançado permite detectar moléculas de baixa abundância sem necessidade de genes de referência.

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Este trabalho foi apoiado por financiamento intramural do Instituto de Ciências da Vida, a bolsa de pesquisa DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e a Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] concedida a Amaresh C. Panda. Agradecemos a outros membros do laboratório pela revisão do artigo.

O RNA é sensível às RNases; portanto, todos os reagentes, instrumentos e espaços de trabalho devem ser livres de RNase e manuseados com cuidado.
1. Desenho do primer divergente para o circRNA (ver Figura 1)
<ol><li>Recupere a sequência madura a partir de dados de anotação de circRNA usando BEDTools ou do navegador do genoma UCSC, unindo a sequência de éxons/íntrons presente entre as coordenadas da junção de backsplice18,19.</li>
	<li>Prepare uma sequência de modelo de PCR de 200 nucleotídeos de comprimento, unindo os últimos 100 nucleotídeos do comprimento total da sequência de circRNA aos primeiros 100 nucleotídeos da sequência de circRNA10. NOTA: Se o comprimento do circRNA for inferior a 200 nucleotídeos, divida-o em duas metades iguais e junte-se aos nucleotídeos da última metade até o início da primeira metade.</li>
	<li>Use a sequência de modelo acima para o design do primer usando a ferramenta web Primer3 e definindo um comprimento de produto de PCR variando de 120-180 nucleotídeos em comprimento20.</li>
	<li>Use as configurações padrão do Primer3 para outros parâmetros, como Tm e comprimento do primer. As sequências de primer para circBnc2 estão listadas na Tabela 1.</li>
	<li>Ordene as sequências de primer divergentes para síntese de qualquer empresa de síntese oligo.</li>
</ol>2. Isolamento de RNA
NOTA: Isole o RNA total das células C2C12 do rato utilizando quaisquer kits comercialmente disponíveis ou método de isolamento de ARN interno. O método interno de isolamento de RNA aqui utilizado já foi descrito anteriormente21. As esferas de sílica magnética são preparadas em laboratório utilizando o protocolo previamente publicado22. Essas contas magnéticas também podem ser adquiridas de vários fornecedores.
<ol><li>Tome um prato de 10 cm contendo cerca de 5 x 106 células mioblásticas C2C12 proliferantes e um miotubo C2C12 diferenciado de 4 dias para isolamento de RNA.</li>
	<li>Lave as células com 10 mL de 1x PBS três vezes e descarte o PBS usando uma pipeta.</li>
	<li>Raspar as células em 1 mL de PBS 1x usando um raspador de células, centrifugar-as a 4 °C por 5 min a 750 x g e descartar o PBS usando uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de reagente de isolamento de RNA (RIR) e lisar as células por pipetagem vigorosa21.</li>
	<li>Adicionar 200 μL (1/5 do volume de RIR) de clorofórmio e vórtice durante 15 s. Centrifugar o tubo a 4 °C durante 10 min a 12.000 x g.</li>
	<li>Pegue 400 μL da camada aquosa superior, carregue-a em uma coluna de sílica e centrifuga-se por 1 min a 12.000 x g à temperatura ambiente. Leve o fluxo para um novo tubo e adicione 600 μL de etanol a 100%.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de grânulos de sílica magnética e colocar o tubo num misturador ajustado a 25 °C e a 1.200 rpm durante 5 minutos. NOTA: O volume do grânulo pode ser aumentado ou diminuído dependendo do número inicial de células tomadas para lise. As contas de sílica magnética podem ser adquiridas de fornecedores comerciais.</li>
	<li>Coloque o tubo num suporte magnético durante 30 s ou até que a solução fique límpida. Descarte o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta.</li>
	<li>Ressuscite as esferas de sílica magnética em um tampão de lavagem de 500 μL contendo etanol a 90%. Coloque o tubo no suporte magnético por 30 s. Gire o tubo duas vezes no suporte magnético para lavar as contas. Deixe as contas se assentarem em direção ao ímã e descarte o buffer usando uma pipeta.</li>
	<li>Repita a etapa 2.9 duas vezes. Após a lavagem, gire brevemente o tubo e coloque-o de volta no suporte magnético por 30 s. Descarte o buffer de lavagem restante. Seque o tubo a 50 °C a 50 °C durante 3 minutos numa termófora, mantendo a tampa aberta.</li>
	<li>Adicione 20 μL de água isenta de nuclease e ressuspenda as contas. NOTA: O volume de eluição de RNA pode ser reduzido para 10 μL para aumentar a concentração de RNA.</li>
	<li>Coloque os tubos por 2-3 min à temperatura ambiente. Coloque o tubo de volta no suporte magnético e deixe-o descansar por 30 s. Coletar o RNA dissolvido em um novo tubo para avaliação de quantidade e qualidade usando um espectrofotômetro. NOTA: O RNA pode ser armazenado a -20 °C ou -80 °C para armazenamento a longo prazo. Para obter um resultado ideal, recomenda-se prosseguir com a etapa de síntese de cDNA no dia seguinte.</li>
</ol>3. cDNA síntese
<ol><li>Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro e tome 1 μg de RNA para a síntese de cDNA.</li>
	<li>Misture 1 μg de RNA total com 1 μL de mistura de dNTP (10 mM cada de dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 4 μL de 5x tampão de transcriptase reversa (RT), 2 μL de primer aleatório 10x RT, 0,25 μL de enzima transcriptase reversa (200 U/μL) e 0,5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) e compense o volume até 20 μL usando água livre de nuclease. NOTA: O volume da enzima transcriptase reversa pode ser alterado dependendo da concentração inicial de RNA tomada para a síntese de cDNA.</li>
	<li>Bata no tubo para misturar a reação e gire brevemente. Colocar o tubo a 25 °C durante 10 minutos, seguido de 50 °C durante 1 h.</li>
	<li>Para inactivar a enzima, coloque o tubo a 85 °C durante 5 minutos.</li>
	<li>Gelo resfrie o tubo por 2 min e adicione 480 μL de água livre de nuclease ao tubo para fazer a concentração de cDNA para 2 ng / μL. NOTA: o cDNA pode ser armazenado a -20 °C ou usado imediatamente para análise de dd-PCR.</li>
</ol>4. Fluxo de trabalho digital de PCR droplet (dd-PCR)
NOTA: O fluxo de trabalho do dd-PCR envolve várias etapas, começando pela preparação da amostra, seguida pela geração de gotículas, amplificação de PCR, contagem de gotículas e análise de dados. Cada etapa é crucial para a geração precisa de dados, pois a dd-PCR envolve a quantificação absoluta dos produtos e não precisa de nenhuma curva padrão. Assim, cada uma das diferentes etapas do dd-PCR foi descrita abaixo.
<ol><li>Preparação da reação dd-PCR.<ol><li>Configure a reação de PCR de 22 μL em tubos ou tiras de PCR de 0,2 mL, juntamente com um tubo de controle negativo e tubos NTC (controle não modelo). NOTA: Cada par de iniciadores divergentes diferentes para a detecção de diferentes circRNAs deve ter uma reação NTC junto com amostras de teste.</li>
		<li>Adicione 11 μL de master-mix dd-PCR (por exemplo, EvaGreen Supermix) e 11 μL de água livre de nuclease para configurar o tubo de reação de controle negativo. NOTA: Descongele a master-mix dd-PCR à temperatura ambiente, seguida de um breve vórtice para formar uma mistura homogénea. Use a mesma água livre de nuclease para configurar o tubo de reação de controle negativo e os tubos NTC que foram usados para diluir o cDNA.</li>
		<li>Adicione 11 μL de master-mix dd-PCR, 5,5 μL de mistura específica de primer para frente e para trás específica de circRNA de concentração de 1 μM e 5,5 μL de água livre de nuclease para configurar os tubos de reação NTC. NOTA: Diluir os primers divergentes circulares de RNA para a frente e para trás de 100 μM de estoque de 100 μM e misturar para preparar uma concentração de trabalho de 1 μM de mistura de primer de circRNA para frente e para trás; assim, a concentração final do primer é de 250 nM na reação de 22 μL.</li>
		<li>Adicionar 11 μL de master-mix dd-PCR, 5,5 μL de mistura específica de primer para frente e para trás específica de circRNA de concentração de 1 μM e 5,5 μL de cDNA (2 ng/μL) para configurar os tubos de reação de ensaio.</li>
		<li>Vórtice completamente seguido de uma breve centrifugação de todos os tubos de reação para obter uma mistura de reação homogênea no fundo dos tubos.</li>
	</ol></li>
	<li>Geração de gotículas.<ol><li>Transfira os 20 μL de mistura de PCR de tubos de PCR de 0,2 mL para os poços de amostra do cartucho gerador de gotículas.</li>
		<li>Adicione 70 μL de óleo de geração de gotículas aos poços de petróleo do cartucho gerador de gotículas cuidadosamente usando uma pipeta multicanal. NOTA: Incubar o óleo de geração de gotículas à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da utilização.</li>
		<li>Cubra o cartucho do gerador de gotas com a junta de borracha e coloque-o na máquina geradora de gotas para obter a mistura de gotas de amostra de óleo, gerada nos poços de gotículas do cartucho.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificação por PCR.<ol><li>Transfira 40 μL da mistura de gotículas de óleo de amostra dos poços de gotículas do cartucho gerador de gotas para uma placa de PCR de 96 poços usando uma pipeta multicanal. NOTA: Transfira cuidadosamente a mistura de gotículas de óleo de amostra enquanto faz um ângulo para os poços através das pontas da pipeta multicanal para evitar quebrar as gotículas ao transferi-las para a placa dd-PCR de 96 poços.</li>
		<li>Sele a placa de PCR de 96 poços com o selador de folha de alumínio, coloque-a no bloco da máquina seladora de placas pré-aquecido a 80 °C e clique na vedação para selar a placa de PCR.</li>
		<li>Agora, coloque a placa no termociclador dd-PCR e defina o programa conforme mencionado na Tabela 2 com a temperatura da tampa definida em 105 °C e uma taxa de rampa de 2 °C/s.</li>
	</ol></li>
	<li>Contagem de gotículas.<ol><li>Quando a PCR terminar, coloque a placa na máquina conta-gotas dd-PCR com o suporte da placa na posição correta para contar as gotículas.</li>
		<li>Abra o software de análise de gotículas e configure a execução fornecendo entrada para as informações da amostra.</li>
		<li>Clique na opção de configuração. Em seguida, clique na opção de modelo para abrir um novo modelo.</li>
		<li>Defina cada poço colocando os detalhes do experimento, como o nome da amostra (cDNA usado ou controle negativo ou NTC), o nome do alvo (nome do primer circRNA) e o tipo (desconhecido) e o tipo do experimento como ABS (quantificação absoluta) e Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) usados, etc.</li>
		<li>Finalmente, salve o modelo e inicie a execução clicando na opção de execução e selecione a contagem por linha ou coluna. Permita que a máquina conclua a contagem de gotículas, que leva cerca de 1 min/poço.</li>
		<li>Clique no botão Analisar para analisar os dados após a conclusão da leitura da gota.</li>
		<li>Clique no botão Amplitude 1D para ver as gotículas positivas e negativas</li>
		<li>Para segregar as gotículas positivas das gotículas negativas, coloque uma linha de limiar comum para todas as amostras com o mesmo alvo. NOTA: O total de gotículas em cada amostra deve ser superior a 10.000 para ser considerado para quantificação absoluta. O NTC não deve mostrar contagens de gotículas positivas. A presença de gotículas positivas no NTC indica contaminação dos reagentes ou amplificação dos dímeros do primer. É difícil descobrir se as gotículas positivas têm dímeros de primer ou produtos não específicos em NTC. É aconselhável verificar os primers e evitar qualquer contaminação dos reagentes como uma prática geral para qualquer PCR, incluindo dd-PCR.</li>
		<li>Clique no botão Exportar para exportar os dados de contagem de circRNA como um arquivo .csv. Os dados exportados mostram o número de circRNAs presentes em cada amostra.</li>
		<li>Calcule manualmente o número de circRNAs em cada amostra por nanograma de RNA, considerando a quantidade total de cDNA usada em cada reação.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733(2012).</li>
<li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li>
<li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis%2C+biology+and+characterization+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li>
<li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+in+disease%3A+Basic+properties+and+biomedical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li>
<li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+translation%2C+a+path+to+hidden+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).</li>
<li>Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPanda%2C+AC+%22Circular+RNAs%3A+Biogenesis+and+Functions%22">Circular RNAs: Biogenesis and Functions</a>. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).</li>
<li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Non-Coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).</li>
<li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircRNAs%3A+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).</li>
<li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).</li>
<li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDas%2C+A+%22PCR+Primer+Design.+Methods+in+Molecular+Biology%22">PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology</a>. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic%2C+prognostic%2C+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+in+COVID-19+patients%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+database%3A+2022+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).</li>
<li>Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant%2C+soil+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42(2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR%3A+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A pesquisa de circRNA cresceu na última década com a descoberta de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento. Como resultado, tem sido considerada uma molécula potencial para futuras terapias de RNA. Além disso, sabe-se que atua como biomarcador em diversas doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares 4,8. No entanto, a identificação do circRNA é complicada devido à sua baixa abundância e possui apenas uma sequência específica de junção de backspli...

Avanços recentes em tecnologias de sequenciamento de RNA e novos algoritmos computacionais descobriram um novo membro da crescente família de RNAs não codificantes, chamado RNA circular (circRNA)1. Como o nome sugere, os circRNAs são uma família de moléculas de RNA de fita simples sem extremidades livres. Eles são formados por splicing não-canônico da cabeça à cauda chamado back-splicing, onde o local aceptor da emenda a montante se une covalentemente com o local doador da emenda a jusante para formar um círculo estável de RNA 1,2. Esse processo pode ser mediado por diversos fatores, incluindo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes no montante e a jusante de éxons circularizados, ou pode ser mediado por alguns fatores de splicing ou proteínas de ligação de RNA (RBPs)2,3. Os RNAs circulares gerados exclusivamente a partir da sequência exônica ou intrônica são classificados como circRNA exônico e RNAs intrônicos circulares ou ci-RNAs, enquanto alguns circRNAs exônicos retêm o íntron e são chamados de circRNAs de íntron éxon (EIcircRNAs)3,4. As funções dos circRNAs são multifacetadas, incluindo a esponja de miRNA e/ou RBP, regulando a transcrição e regulando a função celular por meio da tradução em peptídeos 3,5,6,7. Vários relatos têm destacado a importância dos circRNAs em diversas doenças e processos fisiológicos8. Além disso, os padrões de expressão tecidual específicos e a resistência à digestão da exonuclease a tornam um biomarcador funcional para o diagnóstico da doença e também podem ser utilizados como alvo terapêutico adequado8. Considerando sua importância na regulação da saúde e das doenças, a quantificação precisa da expressão do circRNA é a necessidade da hora.
Vários métodos bioquímicos têm sido desenvolvidos para quantificar circRNAs em amostras biológicas9. Um dos métodos mais convenientes e amplamente aceitos para a quantificação do circRNA é a transcrição reversa, seguida pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR) usando pares de iniciadores divergentes10. No entanto, a maioria dos circRNAs está em baixa abundância em comparação com os mRNAs lineares, o que torna difícil quantificá-los11. Para superar esse problema, buscou-se utilizar a PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificar com precisão o número de circRNAs em uma determinada amostra. O dd-PCR é uma tecnologia avançada de PCR que segue o princípio da microfluídica; gera múltiplas gotículas aquosas no óleo, e a PCR ocorre em cada gota como uma reação individual12. A reação ocorre em gotículas individuais e é analisada por meio de um leitor de gotículas, que fornece o número de gotículas positivas ou negativas para o gene de interesse12. É a técnica mais sensível para quantificar com precisão um gene de interesse, mesmo que haja apenas uma única cópia em uma determinada amostra. A diminuição da sensibilidade aos inibidores, a melhor precisão e a omissão do gene de referência para quantificação o tornam mais vantajoso do que a qPCR convencional13,14,15. Tem sido amplamente utilizado como ferramenta de pesquisa e diagnóstico para a quantificação absoluta de um gene de interesse16,17. Aqui, descrevemos o protocolo detalhado de dd-PCR para quantificação de circRNA na diferenciação de miotubos C2C12 de camundongos e mioblastos C2C12 de camundongos proliferantes usando primers divergentes.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentifuge de 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo de 0,2 ml com tampa</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada sem DNase/RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cell sucateiro</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>Diluente de DNA</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Primers aleatórios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP conjunto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase murino</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverso transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas para Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Placa de vedação térmica, folha, perfurável</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartuchos e juntas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartucho suporte</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Gerador de Gotículas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 Poços</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Seladora de Placas</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch com 96&ndash; Módulo de Reação de Poço Profundo</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Leitor de Gotículas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Sílica</td><td>Guarda-chuva</td><td>Ciências da Vida 38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

quantificação de rnas circulares usando pcr de gotículas digitais

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

A reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd-PCR) é um dos métodos de quantificação mais sensíveis; ele fraciona a reação em quase 20.000 gotículas de água em óleo, e a PCR ocorre nas gotículas individuais. A dd-PCR tem várias vantagens sobre a qPCR convencional em tempo real, incluindo maior precisão na detecção de alvos de baixa abundância, omitindo genes de referência para quantificação, eliminando replicações técnicas para amostras e mostrando alta resiliência a inibidores nas amostras. Recentemente, o dd-PCR tornou-se um dos métodos mais populares para quantificar com precisão o DNA ou RNA alvo para análise e diagnóstico da expressão gênica. RNAs circulares (circRNAs) são uma grande família de moléculas de RNA covalentemente fechadas recentemente descobertas sem extremidades de 5' e 3'. Eles demonstraram regular a expressão gênica agindo como esponjas para proteínas de ligação ao RNA e microRNAs. Além disso, os circRNAs são secretados em fluidos corporais, e sua resistência às exonucleases faz com que eles sirvam como biomarcadores para o diagnóstico de doenças. Este artigo tem como objetivo mostrar como realizar o desenho de primer divergente, extração de RNA, síntese de cDNA e análise de dd-PCR para quantificar com precisão os níveis específicos de RNA circular (circRNA) nas células. Em conclusão, demonstramos a quantificação precisa de circRNAs usando dd-PCR.

O número absoluto de circRNAs em cada amostra pode ser derivado dos dados de dd-PCR exportados. A análise quantitativa em tempo real da PCR sugeriu expressão diferencial de circBnc2 nos miotubos C2C12 diferenciados (dados não mostrados). Aqui, queríamos verificar o número absoluto de cópias de circBnc2 em mioblastos e miotubos C2C12 proliferantes. Como a expressão de circBnc2 é comparada em duas condições, é realmente importante processar todas as amostras para isolamento de RNA, síntese de cDN...

Este protocolo descreve o método detalhado de PCR de gotículas digitais (dd-PCR) para quantificação precisa dos níveis de RNA circular (circRNA) em células usando primers divergentes.

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR é um método altamente sensível e preciso para quantificação absoluta de DNA ou RNA alvo. Ele tem sido usado para o diagnóstico de doenças onde outros métodos convencionais não conseguem dar resultados precisos. dd-PCR é a técnica mais sensível para detectar moléculas de ácido nucleico abundantes muito baixas.Ao contrário da PCR quantitativa, a dd-PCR não requer nenhum controle genético de limpeza para quantificação. Devido à sua sensibilidade e precisão, a dd-PCR pode ser usada como uma ferramenta para diagnóstico molecular e pesquisa envolvendo moléculas de RNA de baixa abundância, como micro RNAs e RNAs circulares. Antes de usar dd-PCR, deve-se realizar RT-PCR ou RT-qPCR para confirmar que os primers estão amplificando seus genes-alvo sem qualquer amplificação de PCR inespecífica.Para começar, prepare uma sequência de modelo de PCR de 200 nucleotídeos de comprimento, unindo os últimos 100 nucleotídeos do comprimento total da sequência circular de RNA aos primeiros 100 nucleotídeos da sequência circular de RNA. Use a sequência de modelos para primer, projetada pela ferramenta da Web Primer 3. Pegue um prato de 10 centímetros contendo cerca de 5 milhões de células mioblástic

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.

PCR digital para quantificar circulando MicroRNAs no infarto agudo do miocárdio e doença Cardiovascular

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.

Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Este estudo apresenta um método robusto para isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosas, possibilitando a separação total de neurônios vs. neuritos e a purificação de RNA. Combinado com o RTddPCR, a abordagem permite a quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia, facilitando estudos de transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade experimental.

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

Aprenda a quantificar RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais com alta sensibilidade e precisão. Este método avançado permite detectar moléculas de baixa abundância sem necessidade de genes de referência.

Quantificação de RNAs circulares usando PCR de gotículas digitais

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