Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos

Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa enquanto análise metabolômica não-alvo. A técnica é muito simples e conveniente para a operação e mais tipos de exsudatos radiculares podem ser identificados. O que ajuda a construir a impressão digital metabolômica dos exsudatos radiculares das plantas.

Iniciar a esterilização das sementes de medicago sativa ou alfafa enxaguando as sementes com hipoclorito de sódio a 0,1% por 10 minutos. Seguido de lavagem com álcool etílico 75% por 30 minutos. Em seguida, enxágue as sementes esterilizadas várias vezes com água destilada.

E depois germina-los no papel de filtro úmido colocado em uma placa de Petri estéril. A 30 graus Celsius no escuro. Após a germinação, transfira 20 sementes grandes e volumosas germinadas uniformemente para uma cesta de enxertia em um frasco de cultura preenchido com solução nutritiva.

Coloque todos os frascos de cultura em uma câmara de crescimento com condições controladas. Após duas semanas, transferir 15 mudas uniformes de alfafa para uma nova garrafa de vidro para expô-las a um miligrama por quilograma e 10 miligramas por quilograma de estresse DEHP para o experimento de cultura. Embrulhar os frascos de vidro de tratamento e controle com folha de alumínio e parafilme para evitar fotólise e volatilização do DEHP.

Suplemente a solução nutritiva diariamente para manter o nível líquido. Coloque e gire aleatoriamente os frascos a cada dois dias para garantir condições consistentes de crescimento para as mudas de alfafa. Após sete dias de cultivo, retirar as mudas de alfafa das garrafas.

E lave-os com água ultrapura várias vezes para prepará-los para a coleta de exsudatos radiculares. Iniciar o experimento de coleta de exsudato radicular transferindo 10 mudas uniformes de alfafa para tubos de centrífuga preenchidos com 50 mililitros de água deionizada esterilizada. Para coletar os exsudatos radiculares, mantenha os tubos eretos por seis horas com as raízes submersas em água.

Uma vez feito, envolva os tubos de centrífuga com papel alumínio para proteger as raízes da luz. Remova as plantas e liofilize o líquido coletado para perfilagem de metabólitos. Prossiga com o experimento de extração adicionando 1,8 mililitros de solução de extração às amostras liofilizadas.

Em vórtice por 30 segundos. Em seguida, aplique as ondas de ultrassom nos tubos por 10 minutos em banho de água gelada. Antes de centrifugar as amostras.

Transfira cuidadosamente 200 microlitros de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aspirar 45 microlitros de sobrenadante do tubo da centrífuga e misturá-lo em amostras de controle de qualidade ou CQ em um volume final de 270 microlitros. Uma vez feito, liofilizar os extratos em um concentrador a vácuo.

Quando a secagem estiver completa, adicione cinco microlitros de ribonuclease padrão interna e continue secando. Após a evaporação, adicionar 30 microlitros de solução de cloridrato de metoxiaminação e incubar os tubos a 80 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicionar 40 microlitros de reagente BSTFA às amostras antes de colocar os tubos a 70 graus Celsius por 1,5 horas para derivatização.

Uma vez terminada a incubação e a amostra derivatizada atingida a temperatura ambiente, adicionar cinco microlitros de ésteres metílicos de ácidos graxos dissolvidos em clorofórmio às amostras derivatizadas. Usando uma coluna capilar medindo 30 metros por 250 micrômetros por 0,25 micrômetro, separe um microlitro do exsudato radicular com um gás transportador de hélio a uma taxa de fluxo de 1,0 mililitro por minuto. Ajuste a temperatura de injeção para 280 graus Celsius.

E mantenha a temperatura da linha de transferência em 280 graus Celsius. Ajuste o programa do forno para separação. Após separar os extratos, realizar espectrometria de massas em modo de colisão eletrônica com uma energia de menos 70 elétrons-volts.

Mantenha a temperatura da fonte de íons em 250 graus Celsius. Obtenha espectros de massa usando o modo de monitoramento de varredura completa com uma faixa de varredura de massa de 50 a 500 massas por carga a uma taxa de 12,5 espectros por segundo. Foram detectados 778 picos no cromatógrafo da amostra controle.

Dos quais 314 metabólitos foram identificados de acordo com os espectros de massa. Os ácidos foram subdivididos em ácidos graxos, aminoácidos, ácidos orgânicos e ácidos fenólicos. Além disso, algumas substâncias comuns geralmente presentes nos exsudatos radiculares também foram detectadas em exsudatos radiculares de alfafa, incluindo pirimidinas, hidroxipirimidinas, flavonoides, fenóis, cetonas, pirimidinas e diterpenos.

Um mapa de calor foi construído com base no escore VIP para visualizar a variação de metabólitos diferenciais entre os diferentes tratamentos com DEHP. Em comparação com as amostras controle, a exposição ao DEHP alterou significativamente o conteúdo de 50 metabólitos e exsudatos radiculares de alfafa. Principalmente incluindo alguns carboidratos e ácidos orgânicos de baixo peso molecular.

A análise das vias metabólicas mostrou que o DEHP inibiu significativamente o metabolismo dos carboidratos que são o produto da fotossíntese, indicando que o DEHP pode suprimir a fotossíntese da alfafa até certo ponto, o DEHP foi visto como promotor do metabolismo de ácidos graxos que ajudam a resistir ao estresse do DEHP. Pelo menos o exsudato radicular das sementes deve ser realizado para cada tratamento para garantir a análise precisa dos dados metabolômicos. Podemos determinar a metabolização diferencial e investigar as regras importantes no comportamento ambiental dos contaminantes.

As interações entre plantas e a comunidade biológica de campo mais ampla podem ser decifradas principalmente usando este método.