Name: Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intracraniana de células de glioblastoma derivadas de GEM em camundongos imunocompetentes. Este modelo ortotópico reproduz características-chave do tumor humano e permite avaliar terapêuticas contra infiltração tumoral.

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Agradecemos ao Sr. Alan E. Kulaga pela excelente assistência técnica e à Sra. Michelle L. Gumprecht pelo refinamento das técnicas cirúrgicas. Agradecemos ao Dr. Philip L. Martin pela análise patológica e à Sra. Lilia Ileva e ao Dr. Joseph Kalen, do Programa de Imagem de Pequenos Animais do Laboratório Nacional de Frederick, por exames de ressonância magnética.
Este projeto foi financiado, no todo ou em parte, com recursos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o Contrato nº HHSN261201500003I. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica endosso do Governo dos EUA.

O protocolo de estudo aqui descrito foi aprovado pelo NCI do Frederick Animal Care and Use Committee. O NCI-Frederick é acreditado pela AAALAC International e segue a Política do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cuidados com os animais foram realizados de acordo com os procedimentos descritos no "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; A National Academies Press, Washington D.C.).
1. Preparação de células injetáveis
NOTA: Células primárias de tumor cerebral (MBRs) de camundongos usadas para este modelo foram originalmente isoladas de camundongos TRP GEM induzidos por tamoxifeno, como descrito em El Meskini et al.5. Detalhes sobre a preparação celular podem ser encontrados nesta referência.
<ol><li>Execute as etapas a seguir utilizando técnica estéril em um gabinete de biossegurança.</li>
	<li>Cultivar células tumorais cerebrais primárias in vitro até atingirem a fase de crescimento exponencial.</li>
	<li>Colher as células em tripsina 0,25% e, uma vez desprendidas, diluí-las com meio de crescimento para inativar a tripsina.</li>
	<li>Pellet as células por centrifugação a 400 x g e lavagem com meio sem soro. Repita uma vez antes da contagem.</li>
	<li>Conte as células manualmente ou com um contador de células automatizado. Ressuspender as células em metilcelulose estéril a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na concentração desejada, com base em um volume final de injeção de 2 μL. A concentração celular desejada pode variar de acordo com a linhagem celular e o modelo do tumor cerebral. Para células GBM GEM TRP, injetamos 2 μL de uma solução de 25 x 106 células/ml, ou 50.000 células.</li>
</ol>2. Tensão do rato
<ol><li>Reproduza ou compre uma cepa de camundongo apropriada que corresponda ao fundo da cepa das células tumorais cerebrais. Para células TRP, use camundongos B6D2F1/J de 9 semanas de idade (a partir de um cruzamento entre fêmeas C57BL/6J [B6] e machos DBA/2J [D2]) como receptores de células tumorais.</li>
</ol>3. Configuração da área cirúrgica
OBS: Todas as etapas cirúrgicas são realizadas por técnica asséptica em ambiente limpo e higienizado. Esfoliantes e equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, devem ser usados pelo cirurgião. As ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas termicamente antes do uso.
<ol><li>Coloque protetores de superfície sob o aparelho estereotáxico e sobre a superfície de trabalho.</li>
	<li>Conecte o tubo de vinil do aparelho de anestesia à porta IN da plataforma de anestesia a gás do aparelho estereotáxico e outro tubo à porta OUT.</li>
	<li>Conecte o display digital a uma fonte de alimentação e ao aparelho.</li>
	<li>Conecte o controlador da microbomba (Figura 1A) a uma fonte de alimentação e conecte a microbomba (Figura 1A) ao braço manipulador do aparelho (consulte também as instruções do fabricante).</li>
	<li>Ajuste a microbomba para 5,6 nL/s para a injeção de volume de 2.000 nL.</li>
	<li>Ligue o esterilizador de esferas quentes.</li>
	<li>Conecte a almofada de aquecimento do mouse ao controlador de temperatura e conecte-se a uma fonte de energia. Coloque a placa na plataforma do palco. Ajuste a temperatura da placa para 37 °C.</li>
	<li>Backload uma seringa de precisão de 30 G, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Insira o êmbolo e prenda a agulha. Certifique-se de segurar a agulha apenas pelo cubo. Pressione o êmbolo até que uma gota da mistura de células metilcelulose se distribua através da agulha. Limpe a agulha com uma almofada de preparação de álcool a 70%, limpando cuidadosamente as laterais da agulha ou colocando uma compressa de gaze estéril na superfície de trabalho e manchando-a. Tome cuidado para não dobrar ou quebrar a agulha.</li>
	<li>Conecte a seringa de precisão à microbomba e gire o braço manipulador para longe do palco, para evitar o deslocamento da seringa-agulha antes de colocar o mouse no palco.</li>
</ol>4. Preparando o mouse para a cirurgia
<ol><li>Anestesiar o camundongo colocando-o na câmara de indução com vaporizador de isoflurano regulado para 2,5%, ou de acordo com diretrizes institucionais. Ligue o fluxo de isoflurano para o cone nasal.</li>
	<li>Transfira o mouse para o aparelho estereotáxico e fixe no cone nasal, com os dentes superiores posicionados sobre o suporte do cone nasal (Figura 1B, 9). Aperte o botão no cone nasal para fixar (Figura 1B). Garanta um nível adequado de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé para verificar se há reflexo.<ol><li>Monitore as orelhas, pés e membranas mucosas para cor (rosa) para garantir a oxigenação adequada. Além disso, monitorar a frequência respiratória (um aumento ou diminuição pode indicar a necessidade de ajustar os níveis de isoflurano).</li>
	</ol></li>
	<li>Insira as barras auriculares (Figura 1B) em ambas as orelhas e aperte o botão para prender a cabeça.</li>
	<li>Aplique pomada ocular para lubrificar os olhos enquanto o rato está sob anestesia.</li>
	<li>Use pinças curvas para arrancar o cabelo na cabeça do rato para uma área cerca de 150% maior do que a incisão planejada, para garantir condições assépticas adequadas.</li>
	<li>Injetar 0,5-1 mg/kg de buprenorfina SR analgesia por via subcutânea ou usar outro analgésico aprovado pelo protocolo.</li>
	<li>Posicione a sonda retal do mouse para monitorar a temperatura interna e evitar hipotermia devido à anestesia. Mantenha a temperatura corporal do rato entre 36,5 e 38,5 °C.</li>
	<li>Higienizar o campo cirúrgico utilizando círculos externos, alternando três vezes a paramentação cirúrgica e o etanol.</li>
	<li>Usando pinças para puxar a pele tensa, faça uma incisão de aproximadamente 1 cm com a lâmina do bisturi, começando entre os olhos. O bregma deve ser visível através da incisão. NOTA: Para uma técnica estéril adequada, toque no local cirúrgico apenas com as pontas de ferramentas esterilizadas e coloque as pontas das ferramentas apenas em uma superfície estéril (como o interior de um pacote de ferramentas autoclavado).</li>
	<li>Use a extremidade de madeira do aplicador com ponta de algodão para raspar o excesso de tecido conjuntivo e, em seguida, a extremidade de algodão de outro aplicador para secar.</li>
</ol>5. Injeção de células
<ol><li>Devolva o braço do manipulador com o acessório da seringa sobre o mouse, apertando o botão para fixar. Use os botões X e Y no plano horizontal para mover a montagem da seringa sobre o bregma. Abaixe a agulha usando o botão Z para confirmar a posição do bregma. Defina o console de leitura digital como zero.</li>
	<li>Use os botões X e Y e a leitura digital correspondente para mover a agulha para a posição desejada. Para a localização do córtex cortical, as coordenadas apropriadas são 3 mm posteriores, 2 mm laterais à direita do bregma e 2 mm de profundidade da dura-máter. Use o botão Z para mover a agulha para a superfície do crânio.</li>
	<li>Puncione um orifício no crânio usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G acoplada. Coloque o bisel da agulha em direção à seringa e agulha de precisão de 30 G e gire cuidadosamente o braço do manipulador para o lado. Usando o polegar e o dedo, role a agulha para frente e para trás lentamente com pressão suave até que a ponta da agulha apenas perfure a calota craniana.</li>
	<li>Use um aplicador com ponta de algodão para afastar qualquer sangue do orifício da agulha. Substitua o braço do manipulador para a posição apropriada com a agulha de seringa de precisão carregada acima do orifício. Alinhe a ponta da agulha com o orifício, usando o botão Z para abaixar a agulha até a dura-má-cérebro, e ajuste o console de leitura digital para zero.</li>
	<li>Usando o botão Z, abaixe a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até atingir a profundidade desejada (2 mm, conforme indicado). NOTA: A agulha é abaixada lentamente para evitar danos adicionais ao tecido cerebral circundante e ao refluxo da solução celular.</li>
	<li>Inicie a microbomba e, em seguida, monitore para garantir que a bomba pare quando 2 μL tiverem sido injetados. Este processo deve levar cerca de 6 min na velocidade indicada. Em seguida, aguarde 1 min antes de mover a agulha.</li>
</ol>6. Remoção da agulha e fechamento da ferida
<ol><li>Levante a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até que a agulha esteja completamente livre do crânio.</li>
	<li>Se necessário, use um aplicador com ponta de algodão para afastar o sangue do local da injeção.</li>
	<li>Usando a extremidade de madeira de um aplicador com ponta de algodão, pegue um pequeno pedaço de cera de osso (~1 mm) e modele-o em um cone. Coloque-o na abertura do crânio, empurrando a cera para dentro do buraco.</li>
	<li>Aqueça as pinças usando um esterilizador de contas e use-as para derreter a cera restante no crânio e alisá-lo.</li>
	<li>Coloque aproximadamente duas gotas de solução de bupivacaína (anestésico) na incisão e use pinças para unir as bordas da pele.</li>
	<li>Puxe a pele tensa e coloque um ou dois clipes para fechar a pele.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento em uma área livre de correntes de ar e observe atentamente o mouse. Permita que o rato acorde completamente da anestesia, retomando a atividade normal, antes de devolvê-lo ao alojamento normal.</li>
	<li>Verifique o mouse diariamente após o procedimento cirúrgico e administre o controle da dor, de acordo com as diretrizes institucionais.<ol><li>Se a buprenorfina SR (Passo 4.6) for utilizada para analgesia, a fórmula de liberação sustentada dura 72 h. Repita a injeção apenas se houver dor ou desconforto visíveis após 72 horas. Quando realizada corretamente, os camundongos se recuperam bem das injeções intracranianas e não é necessária analgesia adicional.</li>
		<li>Remova os grampos 7-10 dias após a cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitorar o crescimento do tumor por imagens de animais vivos (RM).<ol><li>Eutanasiar os camundongos quando os desfechos humanos forem atingidos (ou seja, se o animal perder 20% do peso corporal ou se tornar hipotérmico).</li>
		<li>Devido à natureza invasiva desses tumores cerebrais, observe os camundongos quanto a sintomas neurológicos, como marcha irregular, paralisia parcial, rotação ou inclinação da cabeça. Eutanásia de um camundongo se algum desses sinais clínicos de crescimento avançado do tumor for observado.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTamimi%2C+AF+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. , (2017).</li>
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<li>Wierzbicki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+therapeutic+monitoring+of+H3K27M-mutant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma.</a> Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Modelos pré-clínicos são essenciais para a avaliação de novos alvos terapêuticos e novas estratégias de tratamento no GBM. Modelos de camundongos geneticamente modificados para GBM têm a vantagem da ocorrência de tumores no sítio autóctone, mas muitas vezes com longa latência e crescimento tumoralimprevisível13. Os tumores modelo GEM exibem uma latência de 4-5 meses, e a janela de tempo ideal para imagem, recrutamento e tratamento é variável entre camundongos individuais. O modelo ortotópico tem u...

O glioblastoma (GBM; glioma grau IV) é o tumor cerebral mais comum e maligno, e as terapias atuais são ineficazes, resultando em uma sobrevida média de 15meses1. Modelos pré-clínicos confiáveis e precisos que representem as complexas vias de sinalização envolvidas no crescimento e patogênese de tumores cerebrais são essenciais para acelerar o progresso na avaliação de novos regimes terapêuticos para GBM. Modelos murinos nos quais linhagens celulares tumorais cerebrais humanas são implantadas subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos não refletem o ambiente imune nativo de tumores cerebrais, nem podem ser usados para avaliar a capacidade da terapêutica de atravessar a barreira hematoencefálica2. Idealmente, modelos pré-clínicos em camundongos também devem reproduzir de perto a histopatologia do GBM humano, incluindo o alto nível de invasividade no parênquima circundante3. Embora modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) desenvolvam tumores no contexto de um sistema imunológico intacto, esquemas de melhoramento complicados são frequentemente necessários, e os tumores podem se desenvolver lenta e inconsistentemente4. Os modelos de aloenxerto derivados do GEM são mais adequados para estudos terapêuticos pré-clínicos, onde grandes coortes de camundongos portadores de tumor são necessárias em um período de tempo mais curto.
Em um relato anterior, descrevemos um modelo ortotópico de GBM em camundongos derivado diretamente de tumores GEM. A tumorigênese no GEM é iniciada por eventos genéticos em populações celulares (principalmente astrócitos) expressando proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que resultam em progressão para GBM. Esses GEMs TRP abrigam um transgene (T) TgGZT121, que expressa T121 após exposição à recombinase Cre dirigida por GFAP. A expressão da proteína T121 resulta na supressão da atividade da proteína Rb (Rb1, p107 e p103). A co-expressão de um transgene Cre dirigido por GFAP (GFAP-CreERT2) tem como alvo a expressão para astrócitos adultos após indução com tamoxifeno. Camundongos TRP também abrigam um mutante Cre-dependente Kras (KrasG12D; R) alelos, para representar a ativação da via do receptor tirosina quinase, e são heterozigotos para a perda de Pten (P)5,6. Aberrações gênicas concomitantes nas redes de receptores tirosina quinase (RTK), PI3K e RB estão implicadas em 74% da patogênese do GBM7. Portanto, as vias de sinalização primárias alteradas no GBM humano são representadas pelas mutações projetadas em camundongos TRP, em particular tumores GBM, nos quais alvos compartilhados a jusante de RTKs sãoativados5.
O modelo ortotópico singênico derivado do GEM foi validado como um modelo que recapitula características de tumores cerebrais humanos, incluindo invasividade e presença de biomarcadores de subtipo, para uso como uma plataforma para avaliar a terapêutica do câncer visando vias aberrantes no GBM. As células foram cultivadas a partir de tumores colhidos de cérebros de TRP e reimplantadas no cérebro de camundongos pareados por cepas, usando equipamentos estereotáxicos para injeção intracraniana no córtex. Este modelo ortotópico pré-clínico em camundongos desenvolveu tumores de GBM altamente celulares, invasivos, pleomórficos com alta taxa mitótica, e exibiam focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa, como observado para GBM humano. O volume e o crescimento tumoral foram medidos por ressonância magnética (RM) in vivo .
Neste relato, descrevemos a técnica ideal para a injeção intracraniana de células GBM primárias ou linhagens celulares no cérebro selvagem de camundongos, usando tumores TRP como exemplo. O mesmo protocolo pode ser adaptado para camundongos imunocomprometidos e outras linhagens celulares GBM. Dicas cruciais são dadas para evitar armadilhas comuns, como preparação celular subótima ou vazamento celular no local da injeção, e para usar o equipamento estereotáxico corretamente para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo. Para fins translacionais, validamos o modelo por RM de detecção de crescimento de tumor cerebral em animais vivos, caracterização histológica, e apresentamos um exemplo de tratamento em camundongos portadores de tumor.

<table><tbody><tr><td>5% de metilcelulose em 1X PBS, autoclavada</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de Tuberculina de 1mL, ponta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão de 6"</td> Plataforma de palco ajustável <td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr> Pontas de barreira de aerossol <tr><td></td><td>modelo 901</td><td></td><td>da David Kopf Instruments</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool Estéril, Grande - 2.5 x 3 Polegadas</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2&nbsp; cepa de camundongo (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Jax #10006</td><td></td></tr><tr><td>Cera Óssea</td><td>Especialidades Cirúrgicas</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaína 0.25%</td><td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorfinaSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Vinil Transparente 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Lubrificante Pomada para os Olhos</td><td>CVS Farmácia</td><td>247881</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis Descartáveis, Bisturi de lâmina #10</td><td>Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia a gás com conexão de oxigênio e caixa de anestesia</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>O investigador pode usar o equipamento padrão facility </td></tr><tr><td>Gás plataforma de anestesia para camundongos</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Graphpad</td><td></td><td>Prism&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 9&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; versão 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Hamilton 30 g, &frac12; ", cubo pequeno, ponta pst 3</td><td></td><td></td> Seringa de microlitro de precisão Hamilton Special Order <td></td></tr><tr><td>Hamilton, 1701 RN, sem agulha 10 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de contas quentes com contas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Contador de Células Automatizado</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Preparação de Álcool Isopropílico</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (Versão 36.X, 2011- presente)</td> <td>Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) da Universidade da Pensilvânia e do Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) da Universidade de Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument com console de leitura digital</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, PVDF, Reto, Redutor de Mangueira, 1/4" ID x 1/8" ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento do mouse</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Sonda retal do mouse</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Protetores de superfície</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Esfoliante cirúrgico com iodopovidona</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de clipe de ferida Reflex 9 mm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Removedor de clipe de ferida Reflex de 9 mm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Clipes de ferida</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Semken, curva</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td>Seringa de Tuberculina <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>com agulha de 25g, ponta deslizante</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 com Controlador Micro2T</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modelo UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

modelos ortotópicos translacionais de glioblastoma multiforme

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) para glioblastoma multiforme humano (GBM) são críticos para a compreensão do desenvolvimento e progressão de tumores cerebrais. Ao contrário dos tumores de xenoenxerto, nos GEMs, os tumores surgem no microambiente nativo em um camundongo imunocompetente. No entanto, o uso de GEMs GBM em estudos de tratamento pré-clínico é desafiador devido às longas latências tumorais, à heterogeneidade na frequência de neoplasias e ao momento do desenvolvimento de tumores de grau avançado. Camundongos induzidos por injeção ortotópica intracraniana são mais tratáveis para estudos pré-clínicos e mantêm características dos tumores GEM. Geramos um modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de um modelo de GEM com aberrações de Rb, Kras e p53 (TRP), que desenvolve tumores de GBM exibindo focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa análoga à GBM humana. Células derivadas de tumores GEM GBM são injetadas intracranialmente em camundongos selvagens e cepas compatíveis e reproduzem tumores de grau IV, contornando assim o longo período de latência tumoral em camundongos GEM e permitindo a criação de coortes grandes e reprodutíveis para estudos pré-clínicos. As características altamente proliferativas, invasivas e vasculares do modelo TRP GEM para GBM são recapituladas nos tumores ortotópicos, e os marcadores histopatológicos refletem subgrupos humanos de GBM. O crescimento do tumor é monitorado por exames seriados de RM. Devido à natureza invasiva dos tumores intracranianos em modelos imunocompetentes, seguir cuidadosamente o procedimento de injeção descrito aqui é essencial para prevenir o crescimento de tumores extracranianos.

Camundongos injetados com células tumorais cerebrais devem ser monitorados diariamente em busca de sinais de crescimento tumoral, como convulsões, ataxia ou perda de peso. O crescimento do tumor cerebral também pode ser monitorado por ressonância magnética em intervalos regulares. A RM semanal permite a visualização do aumento da carga tumoral no interior do encéfalo e das medidas de volume tumoral (Figura 1C). Em particular, os tumores de TRP exibem crescimento agressivo, e os volumes tumor...

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Descrevemos a técnica ideal para injeção intracraniana de células de glioblastoma derivadas do GEM em um cérebro de camundongo imunocompetente, resultando em tumores que recapitulam as principais características do glioblastoma humano. Esta técnica de injeção ortotópica de células TRP derivadas do GEM produz resultados altamente reprodutíveis, escaláveis e consistentes para tumores que se originam no córtex, mas mantêm a invasividade dos tumores GEM. Os tumores cerebrais de glioblastoma de camundongos apresentam crescimento agressivo e invadem o parênquima cerebral circundante.Portanto, pode ser usado para avaliar terapêuticas que possam suprimir a infiltração e migração tumoral em pacientes. Este protocolo pode ser personalizado para outros modelos de tumores cerebrais, vírus, terapêuticos ou adaptado para injeção em diferentes regiões cerebrais com os ajustes de coordenadas estereotáxicas. Quem demonstrará o procedimento será Devon Atkinson, pesquisador associado do meu laboratório.Para começar, coloque protetores de superfície sob o aparelho estereotáxico e na superfície de trabalho. Conecte o tubo de vinil do aparelho de anestesia à porta de entrada da plataforma de anestesia gasosa do aparelho estereotáxico e outro tubo à sua porta de saída. Conecte o display digital a uma fonte de alimentação e ao aparelho.Em seguida, conecte a microbomba ao braço manipulador do aparelho depois de conectar o controlador da microbomba à fonte de alimentação. Ajuste a microbomba para 5,6 nanolitros por segundo. Conecte a almofada de aquecimento do mouse ao controlador de temperatura e a uma fonte de alimentação.Recarregue uma seringa de precisão de calibre 30 com mistura de células metilmetilcelulose evitando bolhas. Depois de inserir o êmbolo, prenda a agulha e pressione o êmbolo até que a mistura de células carregada caia através da agulha. Limpe a agulha com uma almofada de preparação com álcool a 70%.Uma vez que a seringa de precisão esteja conectada à microbomba, gire o braço manipulador para longe do palco antes de colocar o mouse para evitar o deslocamento da agulha da seringa. Transfira o camundongo anestesiado para o instrumento estereotáxico e fixe-o ao cone nasal colocando os dentes superiores no suporte do cone nasal. Depois de apertar o cone do nariz com um botão, aperte um dedo do pé para verificar os reflexos para garantir a anestesia adequada.Em seguida, insira barras auriculares e aperte o botão para prender a cabeça. Aplique pomada ocular para lubrificar os olhos em condições anestesiadas. Injetar buprenorfina SR analgésica por via subcutânea e colocar uma sonda retal em camundongo para monitorar a temperatura interna.Esterilizar o campo cirúrgico em círculos externos, alternando três vezes a paramentação cirúrgica e o etanol. Puxe a pele tensa com pinça e use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão de aproximadamente 1 centímetro de comprimento entre os olhos. Para injeção de células, devolva o braço do manipulador com a seringa conectada ao mouse.Depois de apertar os botões, mova a seringa usando os botões X e Y no plano horizontal e monte-a sobre o bregma. Abaixe a agulha, usando o botão Z, para confirmar a posição do bregma e ajuste o console de leitura digital para zero. Em seguida, mova a agulha para a posição desejada, conforme descrito no manuscrito, usando os botões X e Y e a leitura digital correspondente, e use o botão Z para mover a agulha para a superfície do crânio.Puncione um orifício no crânio usando uma seringa de 1 mililitro com uma agulha de calibre 25 acoplada. Gire cuidadosamente o braço do manipulador para o lado, enquanto coloca o bisel da agulha em direção à seringa de precisão de calibre 30. Uma vez que o braço manipulador com a agulha de seringa de precisão carregada é posicionado sobre o orifício, alinhe a ponta da agulha com o orifício e use o botão Z para abaixar a agulha na dura-máter do cérebro.Depois de zerar o console de leitura digital, abaixe a agulha 1 milímetro com o botão Z e aguarde um minuto. Quando a profundidade de 2 milímetros for atingida, pare a microbomba e certifique-se de que a bomba pare quando 2 microlitros de suspensão celular tiverem sido injetados. Para remover a agulha do crânio, levante-a um milímetro e aguarde um minuto.Para o fechamento da ferida, usando a extremidade de madeira de um aplicador com ponta de algodão, pegue um pedaço de cera de osso e molde-o em um cone. Depois de colocar a cera na abertura do crânio, empurre-a para o buraco. Use a pinça esterilizada para derreter a cera restante no crânio.Uma vez liso, adicione duas gotas de solução anestésica de bupivacaína na incisão e puxe as bordas da pele juntas, usando pinças. Depois de puxar a pele tensa, usando um ou dois clipes de ferida, feche a pele, coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento em uma área livre de correntes de ar e observe atentamente o mouse. Exames semanais de ressonância magnética mostraram aumento da carga tumoral dentro do cérebro e medidas de volume tumoral.A medida do volume tumoral na RM revelou ausência de supressão do crescimento tumoral mesmo após o tratamento radioterápico, e a sobrevida dos camundongos tratados não foi aumentada. Os tumores GBM em modelos singênicos pareciam crescer agressivamente e romper o crânio pelo desfecho terminal. Se o crescimento extracraniano for observado nas imagens após o implante celular, isso indica vazamento de células durante o processo de injeção, e mais cuidado deve ser tomado durante a retirada da agulha de injeção.A histopatologia dos tumores ortotópicos do GBM TRP confirmou a presença de astrocitoma grau 4, incluindo a recapitulação das características distintivas em tumores como pseudopaliçada e necrose. Seja preciso ao definir o ponto zero no bregma para garantir as coordenadas corretas de injeção de células. Abaixar e elevar a agulha no cérebro deve ser lento para evitar trauma e refluxo.Após a injeção de células tumorais, exames semanais de ressonância magnética podem ser usados para determinar o tamanho basal do tumor antes de iniciar o tratamento e para visualizar a mudança da carga tumoral dentro do cérebro.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O objetivo deste artigo é descrever o uso de um modelo de glioblastoma ortotópico para estudos quimioradioterapia. Este artigo irá passar por transformação celular, implantação, e radioterapia do mouse através de um modelo intracraniana.

Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série...

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Aqui descrevemos um protocolo eficiente e versátil para induzir, monitorar e analisar novos glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que absorvem o plasmídeo, transformam-se, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Transposon Mediated Integração de DNA plasmídeo na zona subventricular de Neonatal Ratos para gerar modelos novela de Glioblastoma

As células de glioma GL261 fornecem um modelo animal imunocompetente útil de glioblastoma. Os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas adequadas para monitorar o crescimento do tumor intracraniano usando imagens de bioluminescência in vivo e verificar a utilidade das células GL261 modificadas com luciferase para estudar a imunologia tumoral e abordagens imunoterapêuticas para o tratamento do glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

O objetivo desse protocolo é fornecer aos pesquisadores uma técnica altamente reprodutível para implantações intracranianas.

Implantação intracraniana estereotáxica de linhagens celulares de xenoenxerto derivadas de Glioblastoma em Pacientes

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a técnica de injeção intracraniana de células de glioblastoma derivadas de GEM em camundongos imunocompetentes. Este modelo ortotópico reproduz características-chave do tumor humano e permite avaliar terapêuticas contra infiltração tumoral.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

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