Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

A citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ou ADCC para abreviar, pode ser mediada por células natural killer, que chamamos de células NK, granulócitos e macrófagos. Estas são as células efetoras do ADCC. Se um anticorpo como o trastuzumabe, que tem como alvo o receptor do fator de crescimento epidérmico, HER2, se liga às células tumorais, então essas células efetoras usam seus receptores FcyR para se ligar à região FC constante dos anticorpos.

O anticorpo faz a ponte entre as células tumorais e as células efetoras portadoras do receptor FcyR, desencadeando a liberação de seus grânulos citotóxicos. Isso leva à apoptose das células cancerosas. O ADCC pode ser eficaz contra tumores que não respondem aos efeitos antiproliferativos do trastuzumabe.

Para configurar o sistema ADCC, precisamos co-incubar as células de carcinoma de mama anti-HER2 positivo para JIMT-1 com a linhagem celular NK-92 na presença do trastuzumabe anticorpo anti-HER2. A linhagem celular JIMT-1 que usamos para o ensaio expressa de forma estável a proteína verde fluorescente. Primeiro, codifique a placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços com o meio JIMT.

Pipetar 50 microlitros de meio em cada poço da placa. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 por uma hora. O revestimento é crucial para a fixação das células JIMT-1 à superfície de vidro da placa.

Durante a etapa de revestimento, tripsinize as células JIMT-1. Lave as células com dois mililitros de PBS estéril. Em seguida, adicionar um mililitro de tripsina-EDTA ao balão.

Colocar o balão de volta numa incubadora de CO2 durante 10 minutos. Após a incubação, toque no balão para verificar se as células JIMT-1 se destacaram. Pare a digestão com dois mililitros de meio JIMT-1 e colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, conte as células JIMT-1 com azul de tripano em uma câmara fundida azul. Ajuste o número de células para 133.000 células por ml. Aspirar o meio de revestimento e, em seguida, adicionar 75 microlitros de suspensão celular a cada poço.

Permita que as células se liguem durante uma incubação noturna a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2. No dia seguinte, aspirar o meio e adicionar 50 microlitros de meio JIMT-1 fresco aos poços e transferir a placa para o laboratório de triagem de alto rendimento. O robô é usado para transferir os compostos de teste para as microplacas de triagem de alto conteúdo.

Com o braço robótico, o robô pega a unidade de ferramentas do pino, que é calibrada para transferir 25 nanolitros. Transfira um total de 100 nanolitros de compostos de teste da placa de biblioteca de compostos para a placa de ensaio em quatro etapas. Certifique-se de que a concentração final dos compostos de ensaio é de 20 micromolares.

Entre cada etapa, primeiro, lave a ferramenta do pino em DMSO 50% e, em seguida, em etanol 70%. Incubar a placa por uma hora em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius. Cultura de células NK em frascos de cultura de tecidos T25.

Enquanto o tratamento medicamentoso das células JIMT-1 está em andamento, colete as células NK de um frasco T25 para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Conte as células NK-92 com azul de tripano em uma câmara de contagem azul. Ajuste o número de células para 400.000 células por ml.

Centrifugar o volume da suspensão de células NK que contém 400 000 células por ml a 150 g durante três minutos à temperatura ambiente. Preparar o meio ADCC adicionando 20 microgramas por ml de trastuzumabe anticorpo anti-HER2 ao meio JIMT-1. Pipetar 20.000 células NK em meio ADCC de 50 microlitros para as células alvo JIMT-1 GFP.

O volume final é de 100 microlitros e a concentração final de trastuzumabe é de 10 microgramas por ml. Coloque a placa de ensaio no equipamento de análise de alto conteúdo, que tem uma incubadora embutida a 37 graus Celsius. As placas são fotografadas em dois momentos.

Primeiro, adquirimos imagens imediatamente após a adição das células efetoras às células-alvo, e o segundo conjunto de imagens é obtido três horas após a adição das células NK. Primeiro, selecione o tipo de microplaca. Use placas de triagem de alto conteúdo de 96 poços.

Selecione para escolher o foco porque o ensaio é realizado em placas com uma objetiva de 10x no modo não confocal. Escolha binning two para dobrar a relação sinal-ruído. Selecione os canais apropriados, o tempo de exposição, a potência do laser, o plano de foco e o comprimento de onda.

Pegue as imagens de campo brilhante em 650-760 nanômetros e detecte as células JIMT-1 transduzidas por EGFP com excitação de 488 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 500-550 nanômetros. Antes de iniciar a medição, tire imagens de amostra com a função de instantâneo para verificar as configurações corretas. Finalmente, defina o número de campos e o número de pontos de tempo para a geração de imagens.

Escolha, por exemplo, nove campos e dois pontos de tempo. Para analisar a eficiência do ADCC, conte as células viáveis do JIMT-1 no poço de controle do ADCC. Use o módulo de células finas para detectar regiões na imagem que correspondem às células.

Detecte cada célula como uma região na imagem que tem uma intensidade de fluorescência maior do que seu entorno. Selecione as células usando o algoritmo M embutido com 80 micrômetros de diâmetro. Defina a configuração de sensibilidade de divisão, que divide um objeto grande em objetos menores, para o valor 0,5.

Ajuste o limite comum, que é o nível mais baixo de intensidade de pixel, para zero. Exclua a detecção de área de fundo com alta intensidade de fluorescência EGFP em duas etapas. Primeiro, aplique a função calcular propriedades de intensidade para determinar a intensidade de fluorescência do EGFP na região das células previamente selecionadas.

Em seguida, defina um limite mínimo e máximo de intensidade usando a opção de população selecionada, para que obtenhamos o número de células-alvo viáveis de GFP JIMT-1 no final do ADCC. Calcule a eficiência do ADCC dividindo o número de células detectado após três horas pelo número de células detectado no tempo zero. Gostaríamos de demonstrar a aplicação prática do nosso método com resultados representativos.

Montamos uma placa de teste com 16 compostos retirados aleatoriamente das prateleiras. Também incluímos três compostos, colchicina, vincristina e podofilotoxina, com efeito inibitório esperado do ADCC. O DMSO foi utilizado como controle negativo.

Cada fármaco foi utilizado em quatro repetições na placa. A figura mostra o resultado da tela de teste. No grupo menos NK, a toxicidade das drogas sobre as células JIMT-1 foi testada.

No grupo mais NK foram adicionadas células NK e trastuzumabe, o que causou aproximadamente 50% de citotoxicidade. O efeito inibidor esperado do ADCC dos três compostos teste pôde ser detectado com o ensaio. Montamos um sistema de ensaio de co-cultura modelando a interação clinicamente relevante entre células de câncer de mama, células NK e o anticorpo monoclonal terapêutico trastuzumabe.

O ensaio é baseado em microscopia automatizada combinada com análise de imagem e é adequado para triagem de bibliotecas de compostos químicos para identificar drogas modificadoras do ADCC. O procedimento pode ser potencialmente usado para identificar moléculas adjuvantes que potencializam uma resposta antitumoral ou para identificar substâncias químicas com efeito adverso.