Name: Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas de longa e curta duração usando o sistema reporter Hoxb5 em camundongos. Este método permite estudar mecanismos de renovação celular e heterogeneidade no compartimento de CTHs.

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Agradecemos a Hiroshi Kiyonari pelo cuidado com os animais e por fornecer camundongos receptores na RIKEN BDR, bem como Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi pela gestão do laboratório na Universidade de Kobe. Os autores também apreciam muito o apoio contínuo a este trabalho. Masanori Miyanishi foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, e AMED-PRIME, AMED sob o número de concessão JP18gm6110020. Taro Sakamaki é suportado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 e JP22K16334 e foi apoiado por o Programa Core-to-Core da JSPS e o Programa Associado de Pesquisa Júnior RIKEN. Katsuyuki Nishi foi apoiado pelo JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Pré-condicionamento dos camundongos receptores
<ol><li>Preparar camundongos machos C57BL/6 congênicos com idade entre 8-10 semanas de idade como camundongos receptores. O número de camundongos receptores depende do protocolo experimental. Normalmente, preparamos de 10 a 20 camundongos para cada condição.<ol><li>Alimentar os camundongos com água esterilizada suplementada com enrofloxacina (170 mg/L). Como os camundongos receptores irradiados são altamente suscetíveis à infecção, mantenha as gaiolas o mais limpas possível. NOTA: A suplementação com antibióticos começa 24 h antes da irradiação e continua por 3 semanas após o transplante para evitar infecções.</li>
	</ol></li>
	<li>Irradiação corporal total<ol><li>A irradiação corporal total destrói as células da medula óssea receptora para garantir o enxerto das células do doador. Transfira os camundongos receptores para uma gaiola de irradiação. Irradiar letalmente os camundongos receptores com dose única de 8,7 Gy em 12-16 h antes do transplante. NOTA: A dose e o tempo de radiação podem variar dependendo do equipamento. A dose letal de radiação deve ser confirmada com o irradiador do pesquisador e a cepa do camundongo.</li>
		<li>Devolvê-los às suas gaiolas após a irradiação total do corpo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coleta das células da medula óssea do doador
<ol><li>Preparar um camundongo Hoxb5-tri-mCherry macho com 12 semanas de idade e eutanasiar o camundongo por exposição ao CO2 seguida de deslocamento cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local. Observação : O volume de reagente por mouse é descrito nas etapas a seguir.</li>
	<li>Sob condições estéreis, remova a pele e exponha os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero). Corte os principais músculos e tire os ossos (fêmur, tíbia, pelve, úmero) do rato. Coloque-os em placas de cultura celular estéril com Ca 2+ e Mg2+-free, PBS gelado.</li>
	<li>Corte os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças, pequenas tesouras e lenços umedecidos para evitar a contaminação. Tenha cuidado para não quebrar os ossos durante esta etapa. Descarte os ossos quebrados para manter a esterilidade.</li>
	<li>Esterilizar uma argamassa e pilão com etanol 70% (EtOH), e deixá-los secar completamente. Equilibre com tampão de coloração celular (PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com FBS inativado pelo calor a 2%, EDTA 2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL).</li>
	<li>Coloque os ossos na argamassa e adicione 3 mL de tampão de coloração celular. Esmague os ossos abertos com o pilão. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave e transferir a suspensão celular através de um filtro celular de 100 μm para um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Repita o passo 2.5 até que a solução fique límpida. Normalmente, três vezes é suficiente.</li>
</ol>3. Separação das células c-kit+ por classificação magnética
<ol><li>Coloração de anticorpos para classificação magnética<ol><li>Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular. Adicionar 10 μL de IgG de rato (5 mg/mL) para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos e pipetar suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.</li>
		<li>Adicionar o anticorpo c-Kit (clone 2B8) na concentração de 4 μg/mL e misturar com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.</li>
		<li>Adicione 5 mL de tampão de coloração celular e misture bem. Centrifugar as amostras a 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de tampão de coloração celular.</li>
		<li>Adicione 35 μL de microesferas anti-APC para enriquecer as células c-Kit+ e misture com uma pipeta P1.000. Incubar no gelo por 15 min.</li>
		<li>Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão de coloração celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Classificando as células c-Kit+ magneticamente<ol><li>Siga as instruções do fabricante para classificar as células. Em resumo, prima uma coluna de classificação magnética com 3 mL de tampão de coloração celular. Filtrar a amostra (1 ml) através de um filtro celular de 40 μm e carregar a amostra na coluna de classificação magnética.</li>
		<li>Lavar adicionando três vezes 3 mL de tampão de coloração celular. Adicione o buffer de coloração de célula somente quando o reservatório da coluna estiver vazio.</li>
		<li>Coloque a coluna de classificação magnética em cima de um tubo gelado de 15 mL e adicione 5 mL de tampão de coloração celular. Limpe as células empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Mantenha o fluxo no gelo. OBS: Em caso de perda acidental da amostra, mantemos o fluxo-through até o final do experimento.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Coloração de células-tronco hematopoéticas
<ol><li>Centrifugar a amostra preparada na etapa 3.2.3 a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar o anticorpo CD34 (clone RAM34) na concentração de 50 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 60 min. NOTA: A preparação das células de suporte durante a primeira hora de incubação com CD34 é recomendada para encurtar o tempo de processamento.</li>
	<li>Preparar a mistura mestra de anticorpos de acordo com a Tabela 1. Adicionar 100 μL da mistura principal à amostra e incubar no gelo durante 30 minutos. O anticorpo para o antígeno CD34 (clone; RAM34) requer 90 min para coloração suficiente.</li>
	<li>Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Adicionar estreptavidina-BUV737 a uma concentração de 3 μg/mL ao pellet e incubar no gelo por 30 min.</li>
	<li>Adicionar 4-5 mL de tampão de coloração celular. Centrifugar a amostra a 400 x g e 4 °C durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 400 μL de tampão de coloração celular. Mantenha a amostra no gelo.</li>
</ol>5. Apoio à preparação celular
<ol><li>Preparar um camundongo CD45.1+ CD45.2+ congênico com 12 semanas de idade; O ideal é que este tenha a mesma idade do camundongo doador. Eutanásia do camundongo por exposição ao CO2 seguida de luxação cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local. NOTA: No exemplo fornecido, camundongos CD45.1+ CD45.2+ congênicos foram criados internamente cruzando B6. Camundongos CD45.1 congênicos com camundongos C57BL/6J16.</li>
	<li>Sob condições estéreis, pegue os fêmures e as tíbias e coloque-os em placas de cultura de células estéreis com PBS gelado sem Ca 2+ e Mg2+. Aparar os músculos e tecidos fibrosos dos ossos usando pinças e pequenas tesouras.</li>
	<li>Corte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura afiada e estéril. Use uma agulha de 23 G e uma seringa de 5 mL preenchida com tampão de suspensão de células geladas (PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com SFB inativado pelo calor a 2%, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 μg/mL) para liberar a medula óssea em uma placa de cultura celular estéril com tampão de suspensão celular. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm usando uma pipeta P1.000. Contar o número de células da suspensão celular usando um hemocitômetro e preparar uma suspensão de células da medula óssea contendo 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Transferir 200 μL da suspensão de células da medula óssea (2 x 105 células) para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Manter no gelo até o uso. NOTA: Placas de fundo redondo são recomendadas para facilitar a coleta de células.</li>
</ol>6. Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC classificação
<ol><li>Configuração do Gating<ol><li>Transferir 400 μL da amostra preparada na etapa 4.5 para um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo com uma tampa de encaixe do filtro de células de 35 μm. Preparar o reagente de coloração de células mortas e adicioná-lo à amostra antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Ligue um citômetro de fluxo e inicie o software de análise de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, pressione Carregar e adquira os dados. NOTA: Um citômetro de fluxo equipado com cinco lasers e um bico de 70 μm é recomendado para aumentar a pureza das células classificadas.</li>
		<li>Depois de excluir duplos, células mortas e células positivas para linhagem, abra a fração Lineage−c-Kit+Sca-1+ . Em seguida, cancele a fração Flk2+ . Em seguida, gate Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSCs na fração CD150+CD34−/baixa (Figura 2). Realizar compensação para a sobreposição espectral no primeiro experimento. NOTA: Espera-se que as células positivas para Hoxb5 representem 20%-25% da fração Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/Flk2− baixa.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos ou Hoxb5neg pHSC classificação<ol><li>Preparar um tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína com 600 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ suplementado com FBS inativado pelo calor a 10%.</li>
		<li>Coloque o tubo de 1,5 mL de baixa ligação à proteína em um dispositivo de coleta de classificação e classifique ospHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg no tubo de 1,5 mL usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Na primeira classificação, use o rendimento do modo de precisão de classificação.</li>
		<li>Ajuste a placa de 96 poços com as células de suporte preparadas na etapa 5.5 no estágio da unidade de deposição celular automatizada (ACDU). Ajustar o tubo de ligação de 1,5 ml de baixa proteína preparado no passo 6.2.2 para a porta de carregamento de um citómetro de fluxo.</li>
		<li>Classifique ospHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg em uma placa de 96 poços com as células de suporte usando a estratégia de gating definida na etapa 6.1.3. Classifique 10pHSCs Hoxb5 pos ou Hoxb5neg para testar suas capacidades de autorrenovação. NOTA: Recomenda-se a dupla classificação para aumentar a pureza. Na segunda classificação, use a pureza como o modo de precisão de classificação recomendado.</li>
		<li>Normalmente, 500-1.000pHSCs Hoxb5 pos e 1.500-4.000 pHSCs Hoxb5neg são colhidos após dupla classificação. Prossiga com os procedimentos de transplante o mais rápido possível após a triagem do HSC para melhorar a viabilidade celular (idealmente dentro de 1-2 h).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Transplante
<ol><li>Coloque no gelo a placa de 96 poços preparada na etapa 6.2.4 classificada por HSC. Manuseie a placa de 96 poços classificada para HSC em condições estéreis, idealmente em uma capela celular.</li>
	<li>Anestesiar camundongo receptor com isoflurano a 2% em câmara de indução gasosa para anestesia. Assim que o animal estiver totalmente anestesiado, retire-o e coloque-o de lado. Para garantir anestesia suficiente, confirme que nenhum movimento em resposta a um estímulo nocivo.</li>
	<li>Após a confirmação da anestesia adequada, realize uma injeção retro-orbital o mais rápido possível para evitar que o camundongo recupere a consciência. A injeção retro-orbital leva menos de 30 s. NOTA: Como o tempo de injeção é curto, terminamos o procedimento sem aplicar pomada oftálmica nos olhos. No entanto, se o procedimento demorar mais, recomendamos o uso de pomada oftálmica.</li>
	<li>Pipetar suavemente as células na placa de 96 poços selecionada para HSC para misturá-las. Recolher as células do dador na placa de triagem utilizando uma seringa de insulina de 30 G e injetá-las no plexo venoso retro-orbital dos ratinhos receptores. O volume injetável recomendado é de ≤200 μL.</li>
	<li>Observe até que os ratos estejam conscientes e se movendo em uma gaiola limpa. Devolva-os às suas gaiolas depois de confirmar a sua recuperação.</li>
</ol>8. Análise do sangue periférico
<ol><li>Coletar 50 μL de sangue periférico da veia caudal e ressuspendê-lo com 100 μL de PBS livre de Ca 2+ e Mg2+ com EDTA 2 mM. Transfira todas as amostras para uma placa de 96 poços. Centrifugar a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de lise de hemácias e incubar no gelo por 3 min. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Repita mais uma vez.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.</li>
	<li>Preparar a mistura mestre de anticorpos de acordo com a Tabela 2. Adicionar 50 μL de mistura mestra de anticorpos e incubar no gelo por 30 min.</li>
	<li>Adicionar 150 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de coloração celular. Centrifugar as amostras a 400 x g e 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de tampão de coloração celular e adicionar reagente de coloração de células mortas antes da análise de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Analise o quimerismo do sangue periférico por citômetro de fluxo conforme descrito anteriormente16. Coletar sangue em 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após o transplante para seguir a reconstituição de múltiplas linhagens. Gráficos representativos de citometria de fluxo são apresentados na Figura 3.</li>
</ol>

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<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse associados a este estudo.

Tradicionalmente, as CTHs definidas por marcadores de superfície celular têm sido preparadas para estudar as funções das CTHs, como a capacidade de autorrenovação e a multipotência19,20,21. Entretanto, a fração HSC imunofenotipicamente definida (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contém duas populações discretas de HSC: LT-HSCs e ST-HSCs 9,10...

As células-tronco hematopoéticas (CTH), que possuem capacidade de autorrenovação e multipotência, residem no ápice da hierarquia hematopoética 1,2. Em 1988, Weissman e colaboradores demonstraram pela primeira vez que o isolamento de HSCs de camundongos poderia ser obtido usando citometria de fluxo3. Posteriormente, uma fração definida por uma combinação de marcadores de superfície celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, foi relatada como contendo todas as CTHs em camundongos 4,5,6,7,8.
As HSCs imunofenotipicamente definidas (Linhagem−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) (doravante, pHSCs) foram previamente consideradas funcionalmente homogêneas. No entanto, análises recentes de células únicas têm revelado que as pHSCs ainda exibem heterogeneidade em relação à sua capacidade de autorrenovação 9,10 e multipotência11,12. Especificamente, duas populações parecem existir na fração pHSC no que diz respeito à sua capacidade de autorrenovação: as células-tronco hematopoéticas de longa duração (CTH-LT), que têm capacidade de auto-renovação contínua, e as células-tronco hematopoéticas de curto prazo (CTH-ST), que têm capacidade de autorrenovação transitória 9,10.
Até o momento, os mecanismos moleculares da capacidade de auto-renovação que distinguem LT-HSCs e ST-HSCs permanecem pouco compreendidos. É crucial isolar ambas as populações celulares com base em suas capacidades de auto-renovação e descobrir mecanismos moleculares subjacentes. Vários sistemas repórteres também foram introduzidos para purificar LT-HSCs13,14,15; no entanto, a pureza LT-HSC definida por cada sistema repórter é variável, e a purificação exclusiva de LT-HSC não foi alcançada até o momento.
Portanto, o desenvolvimento de um sistema de isolamento para LT-HSCs e ST-HSCs acelerará as pesquisas sobre a capacidade de auto-renovação na fração pHSC. No isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs, um estudo utilizando triagem em várias etapas e sem viés identificou um único gene, Hoxb5, que é heterogeneamente expresso na fração pHSC16. Além disso, a análise da medula óssea dos camundongos repórteres Hoxb5 revelou que aproximadamente 20%-25% da fração pHSC consiste de células Hoxb5 pos. Um ensaio competitivo de transplante usando pHSCs Hoxb5 pos e pHSCs Hoxb5 neg revelou que apenas as pHSCs Hoxb5pos possuem capacidade de auto-renovação de longo prazo, enquanto aspHSCs Hoxb5neg perdem sua capacidade de auto-renovação em um curto período, indicando que Hoxb5 identifica LT-HSCs na fraçãopHSC 16. 
Aqui, demonstramos um protocolo passo a passo para isolar LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de relatório Hoxb5 . Além disso, apresentamos um ensaio competitivo de transplante para avaliar a capacidade de autorrenovação das pHSCs Hoxb5pos/neg (Figura 1). Este sistema de reporte Hoxb5 nos permite isolar prospectivamente LT-HSCs e ST-HSCs e contribui para o entendimento das características específicas de LT-HSC.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL Tira de 8 Tubos, Tampa de Cúpula</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtro de Células M</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina 30G</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL, com Tampa de Pressão do Filtro de Célula</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Coloração de Viabilidade 7-AAD</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 poços U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador com armadilha frasco</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotina (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. Camundongos congênitos CD45.1</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II sistema de encomenda especial&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de coloração brilhante</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotina (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -Biotina (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 camundongos congênitos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Criados em nosso laboratório</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotina (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotina (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Centrífugo 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) sem Ca e Mg, líquido&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience</td><td></td> <td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versão 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Best theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotina (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mCherry (C57BL/6J background)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Criado em nosso Laboratório</td></tr><tr><td>IgG a partir de soro de rato, grau técnico, >=80% (SDS-PAGE), solução aquosa tamponada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca para Cultura de Tecidos (Para Célula de Adesão) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td>Gaiolas de</tr><tr><td>Torta de Rato</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada multiuso</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina Solução Mista</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Argamassa de Porcelana &phi; 120mm com Pestle</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Tubo LoBind de Proteína 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi de aço inoxidável</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer para camundongos padrão</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotina (TER-119)</td><td>Seringa</td> Concêntrica <td>Luer-Slip BioLegend 116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Hipodérmica Terumo 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

método de isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa e curta duração

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

A capacidade de autorrenovação e o potencial de diferenciação de múltiplas linhagens são geralmente considerados como as características definidoras das células-tronco hematopoéticas (CTH). No entanto, numerosos estudos têm sugerido que existe heterogeneidade funcional no compartimento das CTH. Análises recentes de célula única relataram clones de HSC com diferentes destinos celulares dentro do compartimento HSC, que são referidos como clones de HSC tendenciosos . Os mecanismos subjacentes aos resultados heterogêneos ou pouco reprodutíveis são pouco compreendidos, especialmente em relação ao tempo de auto-renovação quando frações purificadas de HSC são transplantadas por imunomarcação convencional. Portanto, estabelecer um método de isolamento reprodutível para HSCs de longa duração (CT-HSCs) e de curta duração (HSCs-ST), definido pelo tempo de sua auto-renovação, é crucial para superar essa questão. Usando triagem multi-etapa imparcial, identificamos um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de LT-HSCs no sistema hematopoiético de camundongos. Com base nesse achado, estabelecemos uma linhagem de camundongos repórteres Hoxb5 e isolamos com sucesso LT-HSCs e ST-HSCs. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de LT-HSCs e ST-HSCs usando o sistema de repórteres Hoxb5 . Este método de isolamento ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de auto-renovação e as bases biológicas para tal heterogeneidade no compartimento HSC.

Anteriormente, a capacidade de auto-renovação foi medida por meio de ensaios competitivos de transplante, nos quais acredita-se que as CTHs do doador retenham sua capacidade de auto-renovação apenas se forem observadas células de doadores de várias linhagens no sangue periférico do receptor17. Além disso, vários relatos definem LT-HSCs como células que continuam a produzir células do sangue periférico vários meses após o segundo transplante de medula óssea10,18<s...

Apresentamos um protocolo passo a passo para o isolamento de células-tronco hematopoéticas de longa duração (CT-HSCs) e CTHs de curta duração (CTH-ST) utilizando o sistema repórter Hoxb5.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

O método de isolamento de células-tronco hematopoéticas ou HSC de longo e curto prazo ajudará os pesquisadores a entender melhor os mecanismos de renovação celular e a base biológica da heterogeneidade no compartimento de CTH. Um fator de transcrição, Hoxb5, que pode ser um marcador exclusivo de HSCs de longa duração, foi identificado. Com base nisso, uma linhagem de camundongos Hoxb5-repórter foi estabelecida e as HSCs de longo e curto prazo foram isoladas com sucesso.Para iniciar a coleta das células da medula óssea do doador, esterilize uma argamassa e pilão com etanol 70% e deixe-os secar completamente. Equilibre aqueles com tampão de coloração celular composto por suplementos contendo PBS livre de cálcio e magnésio. Coloque os ossos isolados do camundongo Hoxb5-tri-mCherry macho doador na argamassa e adicione três mililitros do tampão de coloração celular.Escove os ossos abertos com o pilão, depois desagregue os aglomerados celulares por pipetagem suave e transfira a suspensão celular através de um filtro de células de 100 mícrons para um tubo de 50 mililitros. Repita o processo com um tampão de coloração celular fresco até que a solução fique límpida. Normalmente, repetir três vezes é suficiente para produzir uma solução clara.Depois de isolar os fêmures e tíbias do camundongo CD45.1.2 congênico, corte ambas as extremidades dos ossos com uma tesoura estéril afiada. Usando uma agulha de calibre 23 equipada com uma seringa de cinco mililitros preenchida com tampão de suspensão de células geladas, lave a medula óssea em uma placa de cultura de células estéril contendo tampão de suspensão celular. Desagregar os aglomerados celulares por pipetagem suave e, em seguida, filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 mícrons usando uma pipeta P1000.Para a configuração do confinamento, prepare a amostra seguindo as instruções fornecidas no texto e transfira 400 microlitros dela para um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo com uma tampa de encaixe de filtro de células de 35 mícrons. Preparar e adicionar reagente de tensão de células mortas à amostra antes da análise, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, ligue o citômetro de fluxo e inicie o software de análise seguindo as instruções do fabricante.Em seguida, pressione Carregar para começar a adquirir os dados. Após a exclusão de duplos, células mortas e células positivas para linhagem, porta a linhagem negativa, a fração positiva para c-kit, Sca-1 positiva. Em seguida, libere a fração positiva para Flk2.Em seguida, portar pHSCs Hoxb5-positivo ou Hoxb5-negativo na fração CD150-positivo, CD34-negativo ou baixo. Em seguida, prepare um tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 milímetro com 600 microlitros de PBS livre de cálcio e magnésio, suplementado com FBS inativado pelo calor a 10%. Para realizar a classificação de pHSC Hoxb5-positivo ou Hoxb5-negativo, ajuste o tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitro preparado em um dispositivo de coleta de classificação e classifique as pHSCs Hoxb5-positivas ou Hoxb5-negativas no tubo usando a estratégia de gating mencionada anteriormente.Na primeira classificação, use o rendimento do modo de precisão de classificação. Ajuste a placa de 96 poços com as células de suporte previamente preparadas no estágio da unidade de deposição de células automatizada. Em seguida, ajuste o tubo de ligação de 1,5 mililitro de baixa proteína para a porta de carregamento do citômetro de fluxo.Classificar as pHSCs Hoxb5-positivas ou Hoxb5-negativas na placa de 96 poços com as células de suporte usando a estratégia de gating mencionada anteriormente. Classifique 10 pHSCs Hoxb5-positivos ou Hoxb5-negativos para testar suas capacidades de auto-renovação. Os gráficos de citometria de fluxo da análise da medula óssea dos camundongos doadores Hoxb5-tri-mCherry revelaram que aproximadamente 20 a 25% das células da fração pHSC definida por pHSCs positivas para linhagem-negativa, c-kit-positiva, Sca-1-positiva, CD150-positiva, CD34-negativa ou baixa, Flk2-negativa foram pHSCs Hoxb5-positivas.Aqui são mostrados os gráficos representativos de citometria de fluxo da análise do sangue periférico dos camundongos receptores. Além disso, a análise do sangue periférico dos camundongos receptores após o transplante primário revelou que, embora as pHSCs Hoxb5-positivas e Hoxb5-negativas apresentassem quimerismo semelhante do doador quatro semanas após o transplante, hematopoiese contínua foi observada apenas nos receptores de pHSC Hoxb5-positivos. As HSCs Hoxb5-negativas começaram a perder a capacidade de produzir células hematopoéticas oito semanas após o transplante.Na análise do transplante secundário, apenas os receptores de pHSC Hoxb5-positivos apresentaram hematopoese robusta. Em contraste, células doadoras foram pouco observadas nos camundongos receptores de pHSC Hoxb5-negativos, sugerindo que pHSCs Hoxb5-negativos perderam a capacidade de autorrenovação dentro de 16 semanas após o transplante primário. Esse protocolo geralmente leva de nove a 12 horas, por isso é importante manter a amostra a quatro graus Celsius durante todo o procedimento o máximo possível para manter a viabilidade celular.

isolation-method-for-long-term-and-short-term-hematopoietic-stem-cells

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Biology

Biologia

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

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Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

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Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

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Este protocolo permite a manutenção de células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes in vitro, imitando o microambiente de medula óssea usando ácidos graxos abundantes, colesterol, menores concentrações de citocinas e hipóxia.

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Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

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Descrevemos um protocolo para extrair núcleos de alta qualidade de tipos de células estromais/endoteliais e sanguíneas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por criopreservas, para apoiar análises de sequenciamento de próxima geração de núcleo único. A produção de núcleos intactos e de alta qualidade é imperativa para experimentos multiômicos, mas pode ser uma barreira à entrada no campo para alguns laboratórios.

Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

Aprenda a isolar células-tronco hematopoéticas de longa e curta duração usando o sistema reporter Hoxb5 em camundongos. Este método permite estudar mecanismos de renovação celular e heterogeneidade no compartimento de CTHs.

Método de Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas de Longa e Curta Duração

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