Name: Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares pequenas de tecido de câncer hepático com ultracentrifugação diferencial otimizada. Este método simples oferece maior pureza que técnicas clássicas, apoiando pesquisas em biologia tumoral.

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Os autores agradecem ao Primeiro Hospital Afiliado da Gannan Medical University por apoiar este trabalho. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82260422).

O tecido de câncer de fígado humano foi coletado de pacientes diagnosticados com malignidade hepática no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Gannan. Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, e a coleta de amostras de tecido humano foi aprovada pelo comitê de ética do First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e softwares usados neste protocolo.
1. Preparo
<ol><li>Coloque o agitador descorante de transferência na incubadora e ajuste a temperatura em 37 °C. Consulte a Figura 1 para todos os outros equipamentos necessários.</li>
	<li>Limpe o bisturi e a pinça pulverizando-os com álcool a 75%.</li>
	<li>Preparar a solução digestiva medindo 6 mg de colagenase D (4 mg/mL) e 24 μL de DNase Ι (80 U/mL) e adicionando-os a 1,5 mL de meio básico RPMI-1640. Misture por inversão suave até que os aditivos estejam completamente dissolvidos.</li>
	<li>Previamente umedecer filtros celulares de 70 μm e 0,22 μm com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).</li>
	<li>Coloque uma placa de cultura de células estéril de 100 mm na caixa de gelo para segurar os tecidos do fígado após o descongelamento.</li>
	<li>Dentro de 15 minutos após o isolamento do tecido do carcinoma hepatocelular, lave o sangue na superfície do bloco de tecido com PBS, transfira o tecido para um tubo congelado estéril e armazene-o a -80 °C até o experimento por não mais de 2 semanas.</li>
</ol>2. Dissociação tecidual
<ol><li>Retire a amostra de tecido do congelador de -80 °C e coloque aproximadamente 400 mg do tecido - cortado em fragmentos de 2 mm x 2 mm x 2 mm - na placa de cultura celular de 10 cm na caixa de gelo.</li>
	<li>Mover o tecido para uma placa de 6 poços com 1,5 mL da solução digestiva; em seguida, colocar a placa no agitador descolorante de transferência (20 rpm/min) para incubar por 20 min a 37 °C para dissociação completa do tecido do câncer de fígado e liberação dos sEVs.</li>
	<li>Retire a placa de 6 poços da incubadora e coloque-a na caixa de gelo. Adicionar 80 μL de inibidor de fosfatase e 200 μL de solução completa de inibidor de protease para interromper a digestão.</li>
	<li>Transfira a solução digestiva para o filtro celular de 70 μm e filtre-a lentamente para remover quaisquer grandes detritos de tecido. Recolher o filtrado e colocá-lo num tubo de centrifugação de 2 ml.</li>
</ol>3. Ultracentrifugação diferencial
NOTA: Execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C.
<ol><li>Centrifugar o filtrado a 500 × g durante 10 min e recolher o sobrenadante num novo tubo de centrifugação de 2 ml. A maioria dos pequenos detritos de tecido pode então ser removida.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 3.000 × g por 20 min para remover detritos celulares. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga até que a ponta da pipeta esteja prestes a tocar a substância branca na superfície.</li>
	<li>Centrifugar o líquido restante a 3.000 × g por 3 min; Em seguida, aspirar o sobrenadante para facilitar a coleta das vesículas. Para garantir a pureza dos sEVs, certifique-se de que a substância branca não é aspirada.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante coletado a 12.000 × g por 20 min e transferir 900 μL do sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 4,7 mL. Centrifugar o líquido restante a 12.000 × g por 3 min e, em seguida, coletar e misturar ambos os sobrenadantes no mesmo tubo de ultracentrífuga. Encha o tubo completamente com PBS.</li>
	<li>Centrifugar os sobrenadantes a 100.000 × g por 60 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet enchendo o tubo ultracentrífugo com PBS e centrifugando novamente a 100.000 × g por 60 min. Ressuspender o pellet com 50 μL de PBS.</li>
	<li>Aspirar a suspensão de sEV usando uma seringa estéril de 1 mL e filtrá-la através de um filtro de membrana de 0,22 μm. Recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 600 μL e armazená-lo a -80 °C para análise posterior.</li>
</ol>4. Avaliação da qualidade do enriquecimento
<ol><li>Observar a morfologia dos sEVs sob microscópio eletrônico de transmissão.<ol><li>Em seguida, solte 10 μL da amostra de sEV em uma rede de cobre, incube à temperatura ambiente por 10 min e limpe-a com água destilada estéril, usando papel absorvente para remover o excesso de líquido.</li>
		<li>Lançar 10 μL de acetato de uranila a 2% sobre a rede de cobre para coloração negativa por 1 min. Use papel de filtro para absorver o líquido na superfície da rede de cobre e seque-o por 2 minutos sob uma lâmpada incandescente.</li>
		<li>Observe a tela de cobre sob microscópio eletrônico de transmissão e imagem a 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um citômetro de fluxo de nanopartículas para determinar a distribuição de tamanho e pureza dos sEVs.<ol><li>Antes da máquina ser ligada, prepare tubos contendo 200 μL de controle de qualidade, 200 μL de nanoesferas de sílica, 2 x 200 μL de água ultrapura, 2 x 200 μL de solução de limpeza e 200 μL de PBS. NOTA: Antes de testar as amostras de sEV, é necessário realizar o controle de qualidade no instrumento e testar o padrão de tamanho de partícula (a distribuição de tamanho deve ser calculada usando curvas padrão geradas com várias nanomicroesferas de diâmetros diferentes [68-155 nm] sob a mesma condição de detecção). Esferas de QC e nanoesferas de sílica foram diluídas 100x com água ultrapura em um volume total de 200 μL.</li>
		<li>Verificar o volume da solução de limpeza (>10 mL) e observar a diferença entre os níveis do líquido da bainha e do líquido residual (20-30 cm).</li>
		<li>Desligue a fonte de alimentação principal do instrumento; Após 20 s, ligue o computador e aguarde os sinais sonoros indicando que o instrumento está conectado corretamente para executar o software.</li>
		<li>Clique em Iniciar para ligar a câmera, o laser e a bomba de ar.</li>
		<li>Clique em Bainha Flow-Start Up e coloque água ultrapura na plataforma de carregamento. Após 4 min (contagem regressiva do instrumento), clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga.</li>
		<li>Após 30 s, coloque o tubo em branco na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting | Amostra-Descarga. Em seguida, coloque o tubo que segura a água ultrapura na plataforma de carregamento e, simultaneamente, clique em Sample-Boost | Bainha Flow-Purge.</li>
		<li>Clique em Operação Manual e coloque o tubo de concentração de partículas na plataforma de carregamento. Em seguida, clique em Sample-Boosting por 1 min e selecione simultaneamente o controle de qualidade de 250 nm Std FL SiNPs em "SAMP. Inf."</li>
		<li>Clique em Amostragem-Amostragem e ligue o detector clicando em SPCM. NOTA: Neste ponto, a forma de onda do sinal em tempo real pode ser vista.</li>
		<li>Clique em Auto Sampling e insira 1.0 em Sampling SET para fixar a pressão em 1 KPa. Clique na barra de ferramentas e selecione Sinal grande.</li>
		<li>Ajustar a posição horizontal do laser e ajustá-lo a 2 μm; em seguida, clique em L ou R para se certificar de que o sinal é forte e uniforme.</li>
		<li>Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e, após 1 min, clique em Sample-Unload. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.</li>
		<li>Coloque o tubo padrão de tamanho de partícula na plataforma de carregamento e clique em Sample-Boosting por 1 min.</li>
		<li>Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.</li>
		<li>Clique em Time to Record para coletar os dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminarem. Em seguida, salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boosting e clique em Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.</li>
		<li>Colocar o tubo PBS na plataforma de carga; clique em Sample-Boosting por 1 min.</li>
		<li>Selecione 68-155 nm Std FL SiNPs controle de qualidade em "SAMP. Inf" e clique em Amostragem-Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.</li>
		<li>Clique em Time to Record para coletar dados, que saltarão automaticamente para o Buffer quando terminar. Salve os dados em um arquivo Naf e clique em Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carregamento, clique em Sample-Boost e Sample-Unload após 1 min. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.</li>
		<li>Verifique as informações de amostra descritas anteriormente nas etapas 4.2.17-4.2.20; alterar o PBS (etapa 4.2.17) para a amostra de sEV e analisar os dados.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique ainda mais os sEVs por western blot.<ol><li>Determine as concentrações de proteínas dos sEVs e tecidos usando o kit de quantificação de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Calcule o volume de carga de sEVs (por exemplo, para 5 μg de proteína por poço) com base nesses resultados quantitativos. Adicione o tampão de carga na proporção de 1:4 e espalhe a mistura.</li>
		<li>Após a desnaturação em banho metálico a 100 °C (termostato seco) durante 10 minutos, separar a proteína num gel de poliacrilamida a 12% a 60 V durante 80 minutos.</li>
		<li>Transferir o gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno 0,22 μm a 220 mA por 2 h usando tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%).</li>
		<li>Bloquear a membrana com 5% de leite em pó desnatado em solução salina Tween tamponada com Tris (TBST) por 1 h à temperatura ambiente e incubar com anticorpo primário (anticorpo CD9 monoclonal de coelho, anticorpo CD63 monoclonal de coelho anti-humano, anticorpo anti-humano TSG101 monoclonal de coelho, anticorpo GM130 monoclonal de camundongo anti-humano) durante a noite a 4 °C. Diluir os anticorpos primários em leite desnatado a 5% a 1:1.000.</li>
		<li>Após três lavagens com TBST, incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado à horseradish peroxidase (HRP) à temperatura ambiente por 1 h.</li>
		<li>Detectar o anticorpo ligado à HRP usando o substrato de blotting ECL e, em seguida, coletar e analisar as imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo descreve um método repetível para extrair sEVs do tecido de câncer de fígado. Os sEVs de alta qualidade são obtidos por isolamento tecidual nítido, tratamento com enzimas digestivas, ultracentrifugação diferencial e filtração e purificação da membrana filtrante de 0,22 μm. Para a análise a jusante, é extremamente importante garantir a alta pureza dos sEVs. No processo de centrifugação diferencial, uma camada de substâncias brancas (composição desconhecida) aparecerá na superfície do sobrenadante. Como essa...

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) têm aproximadamente 30 nm a 150 nm de diâmetro e são secretadas por várias células1. Eles podem se comunicar com as células do tecido e regular o microambiente local ou distante, transportando moléculas biológicas importantes, como lipídios, proteínas, DNA e RNA para vários órgãos, tecidos, células e partes intracelulares. Assim, também podem alterar o comportamento das células receptoras 2,3. O isolamento e purificação de sEVs específicos é um pré-requisito essencial para estudar seu comportamento biológico durante o desenvolvimento e curso da doença. A ultracentrifugação diferencial, considerada padrão-ouro, é comumente usada para separar os EVs dos tecidos nos quais normalmente residem4. Restos teciduais, restos celulares, grandes vesículas e corpos apoptóticos podem ser removidos por essa técnica, restando apenas os sEVs.
Demonstrou-se que a colagenase D e a DNase I não afetam as características moleculares das células ou vesículas, sendo que as propriedades de ambas as enzimas contribuem para a liberação de vesículas na matriz extracelular 5. Essas enzimas têm sido utilizadas para extrair EVs de melanoma metastático humano, tecido de câncer de cólon e tecido da mucosa colônica 5,6,7. Entretanto, a concentração e o tempo de digestão da colagenase D e DNase I nesses métodos diferem, levando a conclusões inconsistentes. Para evitar a coprecipitação de outros subtipos de sEVs, pesquisadores removeram vesículas extracelulares maiores (0,1 μm ou 0,2 μm de diâmetro) por filtração e/ou centrifugação diferencial8. Dependendo do tecido fonte, diferentes métodos de isolamento e purificação podem ser necessários 9,10.
O uso do método tradicional de ultracentrifugação diferencial para extrair sEVs do tecido hepático resulta em uma camada de substância branca na superfície do sobrenadante, sem qualquer maneira de determinar suas propriedades. Em um estudo anterior11, essa camada de substância branca afetou a pureza dos sEVs. Embora o número de partículas e a concentração de proteínas das amostras isoladas pelo método tradicional tenham sido superiores aos do método atual, o coeficiente de variação foi grande, possivelmente porque muitos poluentes podem levar a uma baixa repetibilidade dos resultados. Ou seja, usando detergente (isto é, detectando a solubilidade de partículas em Triton X-100 a 1%), verificamos que a pureza dos sEVs obtidos por esse método foi maior. Assim, usamos este método para isolar e purificar sEVs derivados de tecido de câncer colorretal para pesquisa proteômica.
Atualmente, as pesquisas sobre sEVs no câncer de fígado estão focadas principalmente no soro, plasma e sobrenadante da cultura celular12,13,14. No entanto, os EVs derivados do tecido do câncer de fígado podem refletir com mais precisão a patologia fisiológica e o microambiente circundante do câncer de fígado e efetivamente evitar a degradação e a poluição de outros EVs15,16. Com o uso de ultracentrifugação diferencial, este método pode enriquecer o rendimento e obter sEVs de alta qualidade, fornecendo uma base importante para o estudo posterior do câncer de fígado. Este método permite que o tecido do câncer de fígado seja separado por separação nítida e seja dissociado pela colagenase D e DNase I. Em seguida, os debris celulares, as grandes vesículas e os corpos apoptóticos são removidos por filtração e ultracentrifugação diferencial. Finalmente, os sEVs são isolados e purificados para estudos posteriores.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Unidade de Filtro de Membrana</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Estéril de 1 mL</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2% Acetato de Uranila</td><td>Microscopia Ciências</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4,7 mL Tubo de Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>Placa de corte de célula de 6 poços</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Copo</td><td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultura de células</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Tubo de centrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>Kit de quantificação de proteína BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Solução de limpeza</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Rede de cobre</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Termostato seco</td><td>Hangzhou allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti humano CD9 Anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de camundongo acoplado à peroxidase de rábano de cabra (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de Rábano de Cabra (HRP) Acoplado a anticorpo secundário anti-coelho&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo de nanopartículas</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de fosfatase (PhosSTOP)</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de difluoreto de polivinilideno</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Contas QC</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio básico</td><td>Indústrias Biológicas&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td> C11875500BT <td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas de Sílica</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Transferência Descolorante Shaker TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr> Empresa <tr><td></td><td>LG01-105-4X</td><td></td> da <td>tecnologia de Guangzhou Lige</td></tr> da pinça de <tr><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td>do <td>anticorpo TSG101</td></tr></tbody></table>

um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) derivadas do tecido podem refletir o estado funcional das células-fonte e as características do espaço intersticial do tecido. O enriquecimento eficiente desses sEVs é um pré-requisito importante para o estudo de sua função biológica e uma chave para o desenvolvimento de técnicas de detecção clínica e tecnologia de carreadores terapêuticos. É difícil isolar os sEVs do tecido porque eles geralmente estão fortemente contaminados. Este estudo fornece um método para o enriquecimento rápido de sEVs de alta qualidade do tecido do cancro do fígado. O método envolve um processo de quatro etapas: incubação de enzimas digestivas (colagenase D e DNase Ι) com tecido, filtração através de filtro celular de 70 μm, ultracentrifugação diferencial e filtração através de filtro de membrana de 0,22 μm. Devido à otimização da etapa de ultracentrifugação diferencial e à adição de uma etapa de filtração, a pureza dos sEVs obtidos por este método é maior do que a obtida pela ultracentrifugação diferencial clássica. Ele fornece uma metodologia importante e dados de apoio para o estudo de sEVs derivados de tecido.

Os sEVs de tecidos de câncer de fígado humano têm desempenhado um papel crucial no diagnóstico, tratamento e prognóstico de pacientes com câncer de fígado. Este método usou instrumentos de laboratório comuns para isolar e purificar sEVs derivados de tecidos de câncer de fígado; isso pode fornecer suporte metodológico para o estudo de EVs. A Figura 2 ilustra o processo geral de enriquecimento de EVs de tecidos de câncer de fígado. Os sEVs nos espaços intercelulares dos tecidos são totalmente ...

Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.

Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Este método permite o isolamento de pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido do câncer de fígado com uma pureza maior do que a alcançada pela ultracentrifugação diferencial clássica. Essa tecnologia é simples, conveniente e de fácil operação, podendo fornecer suporte metodológico para o estudo de pequenas vesículas extracelulares. Para começar, retire a amostra de tecido do congelador de 80 graus Celsius.Coloque aproximadamente 400 miligramas do tecido em uma placa de cultura de células de 10 centímetros na caixa de gelo e pique finamente o tecido com um bisturi. Transfira o tecido para uma placa de seis poços com 1,5 mililitros da solução digestiva. Em seguida, coloque a placa no agitador descolorante de transferência e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos para dissociação completa do tecido do câncer de fígado e liberação das pequenas vesículas extracelulares, ou sEVs.Após a incubação, coloque a placa de seis poços na caixa de gelo. Adicione 80 microlitros de inibidor de fosfatase e 200 microlitros de solução completa de inibidor de protease para parar a digestão. Em seguida, transfira a solução digestiva para um filtro de células de 70 micrômetros colocado em um tubo de centrífuga de dois mililitros e filtre-o lentamente para remover quaisquer grandes detritos de tecido.Centrifugar o filtrado a 500 g por 10 minutos para remover os pequenos detritos de tecido e coletar o sobrenadante em um novo tubo centrífugo de dois mililitros. Centrifugar o sobrenadante a 3.000 g durante 20 minutos para remover os restos celulares. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga até que a ponta da pipeta esteja prestes a tocar os detritos brancos na parte inferior.Depois de repetir a centrifugação do líquido restante, coloque o sobrenadante no tubo sem perturbar os detritos. Centrifugar o sobrenadante coletado a 12.000 g por 20 minutos e transferir 900 microlitros do sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga de 4,7 milímetros. Repita a centrifugação do líquido restante e, em seguida, colete e misture ambos os sobrenadantes no mesmo tubo de ultracentrífuga.Encha o tubo completamente com PBS. Centrifugar o sobrenadante a 100.000 g durante 60 minutos. Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet enchendo o tubo ultracentrífugo com PBS.Após repetir a centrifugação a 100.000 g por 60 minutos, ressuspenda o pellet com 50 microlitros de PBS. Aspirar a suspensão de sEV usando uma seringa estéril de um mililitro e filtrá-la através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetro em um tubo centrífugo de 600 microlitros. Conservar o filtrado a 80 graus Celsius para análise posterior.Use um citômetro de fluxo de nanopartículas para determinar a distribuição de tamanho e pureza dos sEVs. Verifique o volume da solução de limpeza. Em seguida, observe a diferença entre os níveis da bainha e o líquido residual.Após 20 segundos de ligar a fonte de alimentação principal do instrumento, ligue o computador. Aguarde os bipes indicando que o instrumento está conectado corretamente para executar o software. Clique em Iniciar para ligar a câmera, o laser e a bomba de ar.Em seguida, clique em Fluxo de bainha e selecione Iniciar.Coloque água ultrapura na plataforma de carregamento. Após quatro minutos, clique em Amostra e Impulsionamento e, em seguida, selecione Descarregar na Amostra. Após 30 segundos, coloque o tubo em branco na plataforma de carregamento.Clique em Amostra, selecione Aumentar e, em seguida, selecione Descarregar na amostra. Em seguida, coloque o tubo contendo a água ultrapura na plataforma de carregamento. Simultaneamente, clique em Sample and Boosting, seguido por Sheath Flow e Purge.Clique em Operação Manual e coloque o tubo de concentração de partículas na plataforma de carregamento. Em seguida, clique em Amostra, selecione Impulsionando por um minuto e, simultaneamente, selecione o controle de qualidade de nanoesferas de sílica fluorescente padrão de 250 nanômetros em Informações da amostra. Selecione Amostragem da amostra e ligue o detector clicando em SPCM.Em seguida, clique em Auto Sampling e insira 1.0 em Sampling Set para fixar a pressão em um kilopascal. Clique na barra de ferramentas e selecione Sinal grande. Ajuste a posição horizontal do laser e ajuste o laser para dois micrômetros.Em seguida, clique continuamente em L e R para garantir que o sinal seja forte e uniforme. Clique em Time to Record para coletar os dados, que salta automaticamente para Buffer quando terminar. Em seguida, salve os dados no arquivo Nfa e clique em Amostra para selecionar Descarregar.Coloque o tubo da solução de limpeza na plataforma de carga. Clique em Amostra, selecione Impulsionar e, após um minuto, clique em Amostra e Descarregar. Use água ultrapura para remover a solução de limpeza residual da ponta capilar.Coloque o tubo padrão de tamanho de partícula na plataforma de carregamento e clique em Aumento de amostra por um minuto. Selecione 68 a 155 controle de qualidade S16M-Exo em Informações da amostra e clique em Amostra e, em seguida, em Amostragem. Em seguida, clique na barra de ferramentas e selecione Sinal pequeno.Clique em Time to Record para coletar os dados, que salta automaticamente para Buffer quando terminar. Em seguida, salve os dados em um arquivo Nfa e clique em Amostra para selecionar Descarregar. Após a remoção dos resíduos com a solução de limpeza, coloque o tubo PBS na plataforma de carregamento e execute as etapas demonstradas para o tubo padrão de tamanho de partícula.Em seguida, limpe a ponta capilar, como demonstrado anteriormente, e carregue a amostra de sEV para analisar os dados descritos anteriormente para o tubo padrão de tamanho de partícula. Os sEVs purificados foram examinados em microscópio eletrônico de transmissão, que revelou a presença de sEVs com morfologia em forma de taça. Foi realizada citometria de fluxo para os sEVs.E o tamanho das partículas variava de 40 a 200 nanômetros, e o tamanho médio das partículas era de 89 nanômetros. A pureza dos sEVs enriquecidos foi encontrada para ser 68,32%Os marcadores proteicos de sEVs tais como CD63, CD9, e TSG101 foram detectados por western blot. GM130 foi usado como marcador de controle negativo de sEVs, que foi encontrado em células teciduais, mas não nos sEVs.É crucial realizar as etapas de digestão enzimática, ultracentrifugação diferencial e filtração por membrana com o máximo cuidado para garantir a pureza de pequenas vesículas extracelulares.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

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