Name: Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a isolar gotículas lipídicas de platoglobulos em plantas e cianobactérias usando ultracentrifugação e gradientes de sacarose. Este método rápido e adaptável viabiliza análises bioquímicas detalhadas do metabolismo lipídico.

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A pesquisa no grupo de laboratório Lundquist é apoiada por doações da NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) para a P.K.L. Os autores agradecem à Dra. Carrie Hiser (MSU) pelo apoio no desenvolvimento do método de isolamento de plastoglobule cianobacteriano.

1. Isolamento bruto de plastoglobule
<ol><li>Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar de milho não estressado<ol><li>Adquira seis mudas de milho saudáveis com aproximadamente 3 semanas de idade e quase no estágio de crescimento V5, pesando aproximadamente 120 g.</li>
		<li>Corte todas as folhas na base do caule, mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo e transporte para a câmara fria.</li>
		<li>Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores (cerca de 5 cm x 5 cm) usando uma tesoura.</li>
		<li>Moer suavemente, mas completamente, metade do tecido foliar cortado em liquidificador comercial em 350 mL de tampão de moagem (Tabela 1). Start-stop do liquidificador 5x-6x para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.</li>
		<li>Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande em quatro frascos de centrífuga de 250 ml. Em seguida, repita o passo 1.1.4 com a segunda metade do tecido foliar cortado.</li>
		<li>Dividir uniformemente o filtrado entre os quatro frascos e centrifugar durante 6 minutos a 1.840 x g a 4 °C. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.</li>
		<li>Despeje o sobrenadante resultante e ressuscite suavemente o pellet em 12 mL de meio R 0,2 contendo 0,2 M de sacarose (Tabela 1), girando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Depois de ressuspender cada pellet, carregue a suspensão para o frasco seguinte e repita a ressuspensão. Junte as suspensões em uma garrafa.</li>
		<li>Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de 3 mL, atingindo um volume máximo de 2,5 mL em cada tubo.</li>
		<li>Sonicate cada tubo 4x, por 10 s de cada vez, usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 100%. Tenha cuidado para manter o chifre do sonicator submerso e longe da superfície líquida para evitar a formação de espuma.</li>
		<li>Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Alterne entre os quatro tubos, devolvendo cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos da superfície da almofada de sacarose (prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa) usando uma seringa e uma agulha 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Deposite em um tubo de 2,0 mL.</li>
		<li>Coletar alíquotas do tilacoide bruto antes e após a sonicação e liberação de plastoglobules. Continue para a etapa 2.1. Alternativamente, armazene os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purifique mais tarde.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar desidratado de E. nindensis<ol><li>Adquira um vaso (composto por três plantas individuais por vaso) de E. nindensis totalmente desidratada, de 8 a 9 semanas de idade (quase 40 g de tecido).</li>
		<li>Retire todo o tecido foliar da base da planta, logo acima do solo, usando uma tesoura e mergulhe imediatamente o tecido em um banho de gelo. Transporte o tecido para a câmara fria.</li>
		<li>Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, corte o E. nindensis sai em pedaços menores (em torno de 5 cm x 5 cm) usando tesoura.</li>
		<li>Moer suavemente, mas bem, as folhas com 100 mL de tampão de moagem (Tabela 1) em um liquidificador comercial. Ligue o liquidificador várias vezes para garantir que todas as folhas estão sendo cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.</li>
		<li>Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande para um balão cónico de 250 ml. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.</li>
		<li>Adicionar a quantidade adequada de sacarose para levar a uma concentração final de 0,5 M e distribuir a solução em tubos de centrífuga de 250 ml. NOTA: Uma maior concentração de sacarose em comparação com a preparação de Z. mays é usada para garantir a flutuação das gotículas lipídicas citosólicas antes da subsequente sonicação/liberação dos plastoglóbulos ligados ao tilacóide.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Uma mistura de plastoglóbulos e gotículas lipídicas citosólicas será prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto da superfície da almofada de sacarose (Figura 1B). Recolha o material flutuante utilizando uma seringa com uma agulha de 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha e deposite num tubo.</li>
		<li>Rejeitar o sobrenadante restante após a recolha da mistura de plastoglobule/gotículas lipídicas flutuantes.</li>
		<li>Para isolar os plastoglóbulos conectados ao tilacóide residual, ressussuscite o pellet em 12 mL de R 0,2 médio rodopiando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Junte as suspensões em uma garrafa. Continue para a etapa 1.1.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração bruta de plastoglobulos a partir de cianobactérias<ol><li>Cultivar uma cultura de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 para a fase estacionária (cerca de 7-10 dias) e ajustar a densidade celular para uma OD750 de 2,0 usando um espectrofotômetro. Para condições de cultura, use meios BG-11 e cresça em uma incubadora a uma intensidade de luz de 150 μmol de fótons/m 2/s, 2% de CO2, 32 °C e com agitação contínua a 150 rpm.</li>
		<li>Para remover os polissacarídeos, lavar as células centrifugando a cultura de 50 mL a 6.000 x g por 45 min a 4 °C e, posteriormente, removendo o sobrenadante. Continue lavando as células duas vezes em 50 mL de tampão A (Tabela 1). Remover uma alíquota do homogeneizado celular e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa</li>
		<li>Ressuspeite o pellet lavado em 25 mL de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 psi, repetindo o processo 3x (coloque a amostra no gelo entre cada ciclo para evitar a desnaturação da proteína) até que a cor lisada mude de verde para vermelho-azul-verde sob luz branca. Use uma célula pré-resfriada e execute esta etapa na câmara fria.</li>
		<li>Distribuir o homogeneizado resultante entre oito tubos ultracentrífugos de 3 mL preenchidos até um máximo de 2,5 mL em cada tubo e, em seguida, sobrepor cuidadosamente com 400 μL de R médio, produzindo um gradiente de degraus. NOTA: Consulte Yang, et al. e Kelekar, et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26.</li>
		<li>Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, e centrifugar durante 30 minutos a 150.000 x g a 4 °C. O tilacóide e outras organelas mais pesadas (incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato) serão pellets, enquanto os plastoglóbulos serão prontamente vistos como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose (Figura 1C).</li>
		<li>Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com a ponta da agulha, se necessário.</li>
		<li>Continue para a etapa 2.2. Em alternativa, conservar os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purificar mais tarde.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Colheita de plastoglóbulos puros
<ol><li>Processamento de tecidos vegetais<ol><li>Produzir gradientes de sacarose em tubos ultracentrífugos de 2,5 mL por primeira camada com 500 μL de plastoglóbulos brutos da etapa 1.1 ou etapa 1.2 misturada com 500 μL do meio R 0.7, para levar a um volume total de 1 mL, em seguida, sobrepor com 400 μL de R médio 0.2, seguido de sobreposição com 400 μL de R médio. NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26.</li>
		<li>Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o excesso de R médio à camada superior, conforme necessário. Em seguida, centrifugar a 150.000 x g por 1,5 h a 4 °C.</li>
		<li>Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) com seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos da parte superior da parede do tubo de centrífuga com a ponta da agulha, se necessário.</li>
		<li>Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento flash em nitrogênio líquido. Conservar directamente a -80 °C ou liofilizar até ao pó seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Processamento de cianobactérias<ol><li>Produzir um gradiente de sacarose em quatro tubos ultracentrífugos de 2,5 mL em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL do meio R 0,7, depois sobrepor com 750 μL do meio R 0,2. NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26.</li>
		<li>Centrifugar o gradiente de sacarose a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Coletar os plastoglóbulos puros (Figura 1C) com seringa e agulha 22 G da fase superior do gradiente de sacarose e transferir para um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. Conservar diretamente a -80 °C ou liofilizar para um pó seco.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse a declarar.

Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões semelhantes, a inclus...

A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebola (Allium cepa), espinafre (Spinacia oleracea), pansy (Viola tricolor), pimenta (Capsicum annuum) e ervilha (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Um método atualizado para isolar plastoglóbulos de cloroplasto de forma mais eficiente e melhor produtiva foi posteriormente apresentado por Ytterberg et al.3,14. Embora inicialmente empregado para o estudo dos plastoglóbulos dos cloroplastos foliares de Arabidopsis thaliana, empregamos com sucesso este método atualizado para o tecido foliar saudável de outras espécies vegetais, tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo milho (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), capim-do-amor (Eragrostis nindensis), bromo falso roxo (Brachypodium distachyon) e tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana) ; resultados não publicados). Além disso, o método de isolamento foi adaptado com sucesso aos plastoglóbulos de cianobactérias, incluindo Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e o tecido foliar dessecado da planta da ressurreição, E. nindensis.
Os plastoglóbulos de cloroplasto do tecido foliar saudável estão fisicamente conectados às membranas tilacóides16. Apesar dessa continuidade física, os dois subcompartimentos do cloroplasto mantêm composições lipídicas e proteicas distintas, embora a troca regulada de lipídios e proteínas entre os dois compartimentos tenha sido proposta 2,4,17,18,19. De fato, um interessante modelo de hemifusão foi recentemente proposto para o tráfico de lipídios neutros entre cloroplastos e citosol19. Devido à continuidade física de plastoglobules e tilacóides, o método de isolamento com tecido foliar saudável inicia-se com a coleta de uma preparação tilacóide bruta peletizada, que é posteriormente sonicada para separar os plastoglóbulos dos tilacóides, o que contrasta com os métodos utilizados para isolar gotículas lipídicas citosólicas20 . A ultracentrifugação em uma almofada de sacarose então flutua os plastoglóbulos de baixa densidade através da sacarose, separando-os efetivamente dos tilacóides, núcleos e outros materiais de alta densidade. Em contraste, plastoglóbulos em cianobactérias, bem como os de tecido foliar dessecado, evidentemente existem in vivo em uma forma flutuante. Assim, seu isolamento envolve flutuar diretamente em um gradiente de sacarose. Este artigo demonstra o método de isolamento do tecido foliar saudável e demonstra ainda duas variações que podem ser usadas para isolar plastoglóbulos de tecidos foliares desidratados ou culturas de cianobactérias, expandindo grandemente a amplitude fisiológica e o contexto evolutivo em que os plastoglóbulos podem ser estudados.
Plastoglobules isolados podem posteriormente ser usados para qualquer número de análises a jusante para investigar características moleculares. Utilizamos os plastoglóbulos isolados do tecido foliar de A. thaliana para extensa análise proteômica e lipidômica sob diferentes condições ambientais ou genótipos, demonstrando a modificação seletiva da composição proteica e lipídica em adaptação ao estresse 2,4,21,22. Além disso, ensaios de quinase in vitro que demonstram atividade de transfosforilação associada a plastoglóbulos isolados foram realizados22, os estados oligoméricos de componentes proteicos foram investigados usando eletroforese em gel nativa 21 e ensaios de barbear de protease foram realizados23.
O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento. Em nossa experiência, os protocolos descritos abaixo podem ser totalmente concluídos em aproximadamente 4 h. Um método alternativo para isolar plastoglóbulos do tecido foliar tem sido descrito, o que permite o isolamento simultâneo de outros subcompartimentos de cloroplasto24. Este método alternativo oferece algumas vantagens claras quando a comparação quantitativa com os outros subcompartimentos de cloroplasto é necessária ou desejada. No entanto, este método alternativo também é mais tedioso e proporcionará um rendimento significativamente menor de plastoglóbulos isolados de quantidades comparáveis de tecido foliar. Quando um estudo focado de plastoglobules é o objetivo, a metodologia descrita aqui é a escolha ideal. No entanto, as alíquotas totais foliares e tilacóides brutas podem ser coletadas durante a preparação da amostra, e é altamente recomendável fazê-lo, para ter amostras de referência para posterior comparação.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glicerofosfato. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Proliant Biological</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Quimostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Célula de pressão francesa (modelo FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação Multitron</td><td>Infors HT</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Potássio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Bioquímicos de cisteína reduzida</td><td>MP</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>pirofosfato de sódio &middot; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td> Lâmpada fluorescente <td>Gro-Lux Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W, 18"</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Blender (1,2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Liquidificador comercial</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.

Após a conclusão da etapa 1 do protocolo, deve-se ser capaz de ver prontamente uma quantidade considerável de material de plastoglobule/gotícula lipídica flutuando sobre (ou perto) da camada superior da almofada de sacarose (Figura 1B-C). Outras frações também poderiam ser coletadas nesta fase. Por exemplo, os tilacóides serão peletizados e podem ser ressuspensos com o meio R 0,2 para análises subsequentes. Após a centrifugação subsequente, os plastoglóbulos...

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

O isolamento de plastoglóbulos altamente puros é fundamental para o seu estudo. Um protocolo rápido e eficaz para o seu isolamento que facilita a sua investigação bioquímica a jusante é apresentado aqui. O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento e sua adaptabilidade a numerosas espécies de plantas e condições ambientais.Cuidados especiais devem ser tomados ao sonicar as ressuspensões tilacóides para garantir força suficiente para retirar plastoglóbulos dos tilacóides e com a subsequente extração de plastoglóbulos do gradiente de sacarose. Demonstrando esse procedimento estarão o Dr. Elsinraju Devadasu, pesquisador de pós-doutorado em meu laboratório, e Febri Susanto, doutorando em meu laboratório. Comece adquirindo mudas de três semanas de idade de seis milhos saudáveis, com estágio de crescimento V5 e pesando aproximadamente 120 gramas.Corte todas as folhas na base do caule e mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo antes de transportá-las para a câmara fria. Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores de cinco por cinco centímetros usando uma tesoura. Moer suave e completamente metade do tecido foliar cortado em 350 mililitros do tampão de moagem a um nível inferior a sete num liquidificador comercial.Inicie e pare o liquidificador cinco a seis vezes para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Filtre o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 mícrons em um funil grande para quatro frascos de centrífuga de 250 mililitros. Depois de repetir a etapa de mistura com o restante tecido foliar cortado, divida uniformemente o filtrado entre os quatro frascos.Retirar uma alíquota do filtrado foliar e reservá-la para ser armazenada como amostra total representativa das folhas. Em seguida, centrifugar o filtrado por seis minutos a 1, 840 G e quatro graus Celsius. Deitar fora o sobrenadante resultante e, com movimentos suaves de rodopio da escova, ressuspender o pellet em 12 mililitros de R 0,2 médio, contendo 0,2 de sacarose molar.Depois de ressuspender o pellet em uma garrafa, adicione a suspensão à próxima garrafa e repita a ressuspensão para agrupar as suspensões em uma garrafa. Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de três mililitros, atingindo um volume máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Em seguida, use o sonicator de ponta a uma amplitude de 100% para sonicar cada tubo quatro vezes por 10 segundos cada.Certifique-se de manter o chifre do sonicador submerso e longe da superfície do líquido para evitar a formação de espuma. Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Ao alternar os quatro tubos, devolva cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.Uma vez feito, centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Desnatar a superfície da almofada usando uma seringa e uma agulha de calibre 22 e colher a almofada flutuante amarela e oleosa resultante de plastoglóbulos brutos da almofada de sacarose. Recupere aproximadamente 500 microlitros de cada tubo e deposite-os em um tubo de 2,0 mililitros.Colete alíquotas tilacóides brutas antes e depois da sonicação e liberação de plastoglobules. Uma vez feito, continue o processamento do tecido vegetal ou armazene os plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purifique-os mais tarde. Cultivar 50 mililitros de cultura da espécie synechocystis PCC 6802 em meio BG11 por 7 a 10 dias para atingir a fase estacionária.Usando um espectrofotômetro, ajuste a densidade celular para uma densidade óptica de 2,0 a 750 nanômetros. Para remover os polissacarídeos, centrifugar 50 mililitros de cultura e remover o sobrenadante. Repita a lavagem das células em 50 mililitros de tampão A duas vezes.Ressuspeite o pellet lavado em 25 mililitros de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 libras de polegadas quadradas. Repita o processo três vezes em condições frias até que a cor lisada mude de verde para vermelho, azul, verde sob luz branca. Remova a alíquota do homogeneizado celular e reserve-a para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa.Distribuir o homogeneizado resultante em oito tubos de ultracentrífuga de três mililitros cheios até um máximo de 2,5 mililitros em cada tubo. Sobreponha este homogeneizado com 400 microlitros de R médio, produzindo um gradiente de degraus. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, antes de centrifugar os tubos.O tilacóide e outras organelas mais pesadas, incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato, mostram formação de pelotas, enquanto os plastoglóbulos formam uma almofada oleosa amarela sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa, como demonstrado anteriormente, e deposite a colheita em um tubo de dois mililitros. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com uma ponta de agulha, se necessário.Ou continuar com o processamento de cianobactérias ou armazenar plastoglóbulos brutos a menos 80 graus Celsius e purificar mais tarde. Para colher os plastoglóbulos puros usando o método de processamento de tecido vegetal, prepare o gradiente de sacarose descrito anteriormente usando 500 microlitros de plastoglóbulos brutos, 400 microlitros de meio R 0,2 e 400 microlitros de médio R.Após centrifugação, colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros em um tubo de dois mililitros. Depois de alicitar os plastoglóbulos puros e congelar as alíquotas em nitrogênio líquido, armazene-as a menos 80 graus Celsius ou liafilize-as em um pó seco.Para colher plastoglóbulos puros de cianobactérias, crie um gradiente de sacarose, como mencionado anteriormente, usando 500 microlitros dos plastoglóbulos brutos, 750 microlitros do meio R 0,7 e 750 microlitros do meio R 0,2. Após a centrifugação, colete os plastoglóbulos puros em um tubo de 1,5 mililitro e alíquota os plastoglóbulos puros. Uma vez feito, congele rapidamente as alíquotas de plastoglóbulos puros em nitrogênio líquido e armazene-as diretamente a menos 80 graus Celsius ou liofilize em um pó seco.Neste método, uma quantidade significativa de plastoglobule ou material de gotículas lipídicas foi vista flutuando na camada superior da almofada de sacarose. Após a centrifugação subsequente, plastoglóbulos purificados foram obtidos na superfície ou perto da superfície do gradiente de sacarose. Após o isolamento bem-sucedido dos plastoglobules, imunoblots desenvolvidos para avaliação de pureza utilizando anticorpos levantados contra arabidopsis thaliana fibrillin 1a e arabidopsis thaliana photosystem II subunidade D1 mostraram que os homólogos da fibrilina estavam primariamente associados a tilacóides do que os plastoglobules.Para garantir a extração eficiente e concentrada da almofada flutuante, coloque o orifício da agulha da seringa logo abaixo da superfície líquida do tampão enquanto estiver completamente submerso e, em seguida, puxe suavemente para cima. Amostras isoladas de plastoglobule são passíveis de estudos proteômicos ou lipidômicos subsequentes e têm sido usadas para demonstrar as mudanças na composição proteico-lipídica alvo sob diferentes condições ambientais. Esta técnica facilitou novos estudos do plastoglobule, incluindo a descoberta da atividade da proteína quinase associada e a presença de complexos proteicos oligoméricos através de investigação bioquímica subsequente.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC)

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias. Começa com uma cultura de cianobactérias e prossegue através da ruptura celular usando força mecânica. A liberação de pigmentos fotossintéticos indica lise bem-sucedida. Um gradiente de etapa de sacarose é então usado para separar os componentes celulares por densidade, permitindo que...

Extração e Purificação de Plastoglóbulos de Bactérias Fotossintéticas

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias usando centrifugação com gradiente de densidade de sacarose, destacando sua natureza rica em lipídios e de baixa densidade e garantindo sua preservação estrutural para análise a jusante.

Purificação por gradiente de densidade de plastoglóbulos de cianobactérias

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Os poliésteres lipídicos constituem os componentes estruturais de duas modificações da parede celular, a cutícula da planta e as barreiras de difusão contendo suberina. Neste vídeo, descrevemos um método para despolimerizar a cutina de folhas inteiras deslipidadas. O método pode ser aplicado para investigar mutantes comprometidos na biossíntese de cutina ou suberina.

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A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

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Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a fucoxantina clorofila a/c proteínas obrigatórias (FCP) de diatomáceas e incorporá-las em lipossomas com composições de lipídios naturais para estudar a transferência de energia de excitação sobre as alterações de composição do íon.

Isolando e incorporando luz-colheita antenas de diatomáceas Cyclotella Meneghiniana em lipossomas com lipídios tilacoides

Aqui, descrevemos um método para purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis folhas e seus três principais compartimentos sub (envelope, estroma e contém), usando uma combinação de centrifugações diferenciais, contínuo de Percoll, e gradientes de sacarose descontínuo. O método é valioso para subplastidial e Localização subcellular das proteínas por immunoblotting e proteômica.

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

Aprenda a isolar gotículas lipídicas de platoglobulos em plantas e cianobactérias usando ultracentrifugação e gradientes de sacarose. Este método rápido e adaptável viabiliza análises bioquímicas detalhadas do metabolismo lipídico.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

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