Name: Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda enxertia de mudas para biologia vegetal usando Arabidopsis thaliana. Este método econômico e flexível permite estudar sinalização de longa distância sem treinamento prévio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrigado a Javier Brumos pelo treinamento inicial e orientação na enxertia de mudas de Arabidopsis .

1. Preparação do dispositivo
<ol><li>Fazer o dispositivo de enxertia de silicone fundindo a solução de elastômero de silicone em uma placa de Petri quadrada (100 mm x 100 mm). Preparar 15 mL da solução de elastômero, seguindo as orientações do fabricante. NOTA: Os kits de elastômero de silicone normalmente incluem um líquido à base de silicone e um agente de cura que, quando misturados, permitem que o silicone se solidifique.</li>
	<li>Preparar a placa de Petri quadrada colocando quatro pedaços retos de fio 29 G na placa de Petri quadrada, equidistantes entre si (Figura 1A). Certifique-se de que o fio fique nivelado com o fundo do molde. Para endireitar totalmente o fio, enrole-o em uma superfície dura e uniforme com um objeto pesado e plano (por exemplo, um rack de tubo de metal). NOTA: As gravatas de torção geralmente contêm fio de 29 G e podem ser usadas após a remoção do revestimento externo de papel com acetona.</li>
	<li>Despeje a solução mista de elastômero de silicone por cima dos fios e cubra com a parte superior da placa de Petri. Deixe o silicone curar por 24-48 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire a folha de silicone da placa de Petri usando pinças limpas e passe para uma superfície plana limpa.</li>
	<li>Retire os fios da folha de silicone. Remova a fina camada de silicone remanescente na parte externa do canal com pinça de ponta fina, para permitir que o canal fique aberto de um lado (Figura 1A).</li>
	<li>Corte a folha de silicone perpendicularmente aos canais em tiras de 3 mm usando tesouras limpas. Mova cada tira para um envelope de papel alumínio e sele com fita autoclave.</li>
	<li>Autoclave as tiras a 121 °C por pelo menos 30 min e guarde até que esteja pronta para uso.</li>
</ol>2. Preparo das mudas
<ol><li>Esterilizar e vernalizar sementes.<ol><li>Suspender até 100 sementes de Arabidopsis em 1 mL de solução de água sanitária a 50% contendo Tween 20 a 0,1% em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar por 5-10 min. Remover a solução de água sanitária por pipetagem ou aspiração em condições estéreis. Enxaguar as sementes com 1 mL de dH2O esterilizado. Certifique-se de inverter os tubos para enxaguar adequadamente as sementes e remover qualquer solução de água sanitária deixada na parte superior do tubo. Repita o enxágue 4x.</li>
		<li>Deixar aproximadamente 0,25 mL de água nos tubos com as sementes e armazenar a 4 °C por 3 dias no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaquear as sementes em preparação para a enxertia.<ol><li>Prepare uma placa de MS de ágar 1% da seguinte forma: para 1 L de meio sólido MS (0,5% de sacarose), misture 4,4 g de sal MS, 5 g de sacarose e 10 g de ágar em 800 mL de água, ajuste o pH para 5,7 com KOH e, em seguida, leve o volume total para 1 L com água adicional. Autoclave por pelo menos 20, min antes de despejar ~25 mL nas placas de Petri quadradas.</li>
		<li>Em condições estéreis, mover o número adequado de sementes preparadas para a placa, usando uma ponta de pipeta de 20 μL para aspirar e transferir as sementes.</li>
		<li>Coloque uma tira estéril na superfície da placa para orientar o posicionamento da semente, para que as sementes fiquem alinhadas com os canais da tira. Retire a tira assim que as sementes estiverem chapeadas. OBS: Uma placa quadrada de 100 mm x 100 mm pode acomodar duas fileiras de mudas (Figura 1B).</li>
		<li>Quando as placas estiverem em pé, deixe o líquido evaporar do meio sólido e acumule no fundo da placa. Após a colocação das sementes na placa, colocar na tampa da placa e selar um dos lados da placa que esteja paralelo às duas fileiras de sementes (indicado pela região de destaque azul na Figura 1B) com parafilme. Embrulhe a fita respirável em cima do parafilme e ao redor de todas as outras bordas da placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Levante cuidadosamente duas placas com o lado selado do parafilme virado para baixo. Separe as duas placas na parte inferior colocando um tubo de centrífuga horizontal de 15 mL entre elas e fixe com um elástico. Certifique-se de que as superfícies da placa formem um ângulo de 100°-110° com a superfície da bancada (Figura 1C).</li>
	<li>Armazenar as placas nesta orientação por 72 h no escuro total a 21 °C, para permitir que as plântulas de hipocótilo cresçam ~5 mm de comprimento. Após 72 h, remova as placas do escuro e cresça sob 16 h de luz (intensidade de 100 μE m-2 seg-1) e 8 h de ciclos escuros por mais 2-4 dias na mesma temperatura antes da enxertia.</li>
	<li>Enxertar as mudas entre 5 e 7 dias após serem plaqueadas. Coloque uma faixa de enxertia sobre as mudas, encaixando seus hipocótilos nos canais. Posicionar suavemente a plântula de modo que a junção raiz-hipocótilo seja posicionada no fundo da tira de silicone para preparar a plântula para o corte (Figura 1D).</li>
</ol>3. Procedimento de enxertia
<ol><li>Prepare um ambiente de trabalho estéril higienizando um escopo de dissecção com etanol 70% e autoclavando dois pares de pinças de ponta fina e um cabo de bisturi. Realizar todos os procedimentos de enxertia em capuz estéril e com o auxílio de um dossiê de dissecção, conforme necessário. Realizar a maior parte da enxertia com aumento de 10,5x.</li>
	<li>Prepare as scions. Use uma lâmina de bisturi fresca para cortar o hipocótilo perpendicularmente para criar um corte limpo reto. Empurre a lâmina para frente em vez de pressionar para baixo na planta para evitar que a muda seja empurrada para dentro do ágar (Vídeo 1).</li>
	<li>Remova o disparo. Tome cuidado para manter a parte cortada da parte aérea hidratada, garantindo o contato com a superfície do meio. Alternativamente, mova o rebento para uma área de retenção designada, como a parte superior de uma placa de Petri cheia de dH2O estéril, até que esteja pronta para uso.</li>
	<li>Prepare os porta-enxertos. Puxe suavemente a raiz pegando a raiz no espaço deixado entre as pinças fechadas e girando-as, deixando a seção de corte dos porta-enxertos no meio da tira (Figura 2). NOTA: A raiz frágil será danificada se esmagada entre as pinças fechadas diretamente, necessitando encunhar a raiz no ângulo afiado das extremidades da pinça para manipular o tecido.</li>
	<li>Pegue suavemente o rebento desejado usando a pinça de ponta fina e insira na parte superior do canal. OBS: É fundamental confirmar visualmente o contato entre as mudas e os porta-enxertos para obter o sucesso do enxerto (Figura 3).</li>
	<li>Após a confecção de todos os enxertos, envolva as placas com parafilme e fita adesiva respirável e monte as placas da mesma forma que antes, sem atrapalhar as mudas ou tiras de silicone. Mova cuidadosamente as placas para uma câmara de crescimento regulada a 26 °C com ciclos de 16 h claro/8 h escuro.</li>
	<li>Avaliar as plântulas enxertadas em condições estéreis após 7-10 dias. Retire cuidadosamente a tira de silicone usando pinças, descascando um dos lados, permitindo que os canais liberem as mudas. Remova quaisquer raízes adventícias que cresçam da copa, cortando-as da copa com uma lâmina de bisturi fresca ou esmagando-as usando pinças de ponta fina. Avaliar visualmente se o porta-enxerto ficou firmemente aderido à copa para formar um enxerto bem-sucedido (Figura 2).</li>
	<li>Mova enxertos bem-sucedidos para o solo de propagação de mudas para crescer pelo tempo necessário. Cubra o solo com plástico transparente por alguns dias à medida que as mudas forem se estabelecendo. Após a transferência das plantas para o solo, crescer sob os ciclos claro e escuro mencionados anteriormente a 21 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Reviews%22%5BJournal%5D)">A history of grafting.</a> Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).</li>
<li>Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+control+in+tomato+with+ABA-deficient+roots%3A+Response+of+grafted+plants+to+soil+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying.</a> Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).</li>
<li>Notaguchi, M., Okamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+long-distance+signaling+via+plant+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 161(2015).</li>
<li>Ko, D., Helariutta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot-root+communication+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Shoot-root communication in flowering plants.</a> Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).</li>
<li>Thomas, H. R., Frank, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+pieces%3A+uncovering+the+molecular+basis+for+long-distance+communication+through+plant+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting.</a> New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).</li>
<li>Takahashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+peptide+modulates+stomatal+control+via+abscisic+acid+in+long-distance+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling.</a> Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).</li>
<li>Brumos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+auxin+biosynthesis+is+a+key+regulator+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development.</a> Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).</li>
<li>Corbesier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT+protein+movement+contributes+to+long-distance+signaling+in+floral+induction+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis.</a> Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-union+development%3A+A+delicate+process+that+involves+cell-cell+communication+between+scion+and+stock+for+local+auxin+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrografting+techniques+for+testing+long-distance+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Micrografting techniques for testing long-distance signalling.</a> The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).</li>
<li>Marsch-Martínez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+flat-surface+collar-free+grafting+method+for+Arabidopsis+thaliana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings.</a> Plant Methods. 9 (1), 14(2013).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrografting+device+for+testing+systemic+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanisms+of+long-distance+mRNA+movement+in+a+Nicotiana+benthamiana%2Ftomato+heterograft+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system.</a> Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+movement+of+small+RNAs+from+shoots+to+roots+in+interspecific+heterografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts.</a> Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).</li>
<li>Ragni, L., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+thick+enough-the+Arabidopsis+hypocotyl+as+a+model+to+study+secondary+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth.</a> Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).</li>
<li>Chen, I. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetics+approach+reveals+a+role+of+brassinolide+and+cellulose+synthase+in+hypocotyl+elongation+of+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Plant Science. 209, 46-57 (2013).</li>
<li>An, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+apical+hook+development+by+gibberellins+and+ethylene+in+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene-induced+Arabidopsis+hypocotyl+elongation+is+dependent+on+but+not+mediated+by+gibberellins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+alh1+illustrates+a+cross+talk+between+ethylene+and+auxin%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin.</a> Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).</li>
<li>Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FERONIA+is+a+key+modulator+of+brassinosteroid+and+ethylene+responsiveness+in+arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls.</a> Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Resumo e significado A formação de uma união do enxerto é crucial para o sucesso da enxertia, que requer contato direto e ininterrupto entre o porta-enxerto e a muda. O tamanho em miniatura e a fragilidade das mudas de pequenas plantas, como Arabidopsis, tornam tecnicamente desafiador atender a esse requisito. Uma técnica desenvolvida nos primeiros métodos de enxertia de plântulas de Arabidopsis foi inserir tanto a copa quanto o porta-enxerto em um colar curto de tubos de silicone pa...

A enxertia é uma técnica hortícola antiga que se tornou uma prática agrícola estabelecida por volta de 500 a.C.1. A enxertia de diferentes variedades de plantas cultivadas para melhorar a produtividade foi o primeiro uso dessa técnica, e continua sendo utilizada para esse fim até hoje. Na última década, a enxertia tem atraído cada vez mais atenção como ferramenta para biólogos moleculares estudarem a sinalização de longa distância em plantas 2,3,4,5. Enquanto enxertar plantas adultas é relativamente fácil, enxertar plantas logo após a germinação é um desafio. Apesar disso, algumas vezes é necessário avaliar os efeitos da sinalização de longa distância em processos como o desenvolvimento das plantas, as respostas ambientais e o florescimento 6,7,8.
Arabidopsis thaliana foi estabelecido como o organismo modelo na biologia vegetal por muitas razões, incluindo seu tamanho relativamente pequeno, facilitando o crescimento dentro de um laboratório. No entanto, o pequeno tamanho e a fragilidade das mudas de Arabidopsis tornam a enxertia de mudas jovens muito desafiadora. Em muitos casos, é necessário treinamento prático extensivo para obter enxertos de plântulas com sucesso. Ao longo dos anos, houve muitos avanços metodológicos que identificaram condições ideais de cultivo e novas técnicas para aumentar a taxa de sucesso da enxertia de plântulas9,10,11. A ferramenta mais recente introduzida foi um chip de enxertia de plântulas de Arabidopsis, que permite que mesmo usuários inexperientes alcancem níveis aceitáveis de sucesso de enxertia12. Embora esse avanço tenha reduzido significativamente a barreira técnica da enxertia de plântulas, o dispositivo de chip é caro, e o número de enxertos que podem ser conduzidos em paralelo rapidamente se torna proibitivo.
Além disso, este dispositivo só pode ser usado para mudas de Arabidopsis que tenham dimensões de hipocótilo semelhantes às mudas selvagens. Embora Arabidopsis seja a espécie-chave no mundo da genética molecular de plantas, trabalhos recentes têm sido feitos em outras espécies usando enxertia de plântulas. Exemplos incluem a enxertia de soja e feijão, tabaco para tomate e canola para Arabidopsis e, posteriormente, amostragem de ambos os tecidos para pequenos RNAs13,14. Portanto, um método de enxertia acessível à maioria dos laboratórios e que possa ser facilmente adaptado a uma ampla gama de espécies vegetais sem grandes alterações técnicas é altamente desejável.
Este protocolo detalha um método que emprega a produção interna de um dispositivo de enxertia simples que permite a personalização completa do diâmetro e comprimento do canal de enxertia para acomodar qualquer morfologia de plântula na maioria das espécies vegetais. A produção desses dispositivos é muito acessível e altamente escalável, pois os únicos componentes necessários são elastômero de silicone, fiação ou tubulação do tamanho correto, uma lâmina de alta precisão e um recipiente para servir como molde. Seguindo o protocolo de enxertia aqui detalhado, os usuários podem obter taxas de enxertia bem-sucedidas de 45% (n = 105), comparáveis aos resultados de enxertia previamente relatados10,12.

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>VWR International Inc</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>ACETONA (HPLC & Solvente Certificado ACS) 4 L</td><td>VWR</td><td>BJAH010-4</td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Sigma</td><td>A1296-500g</td><td></td></tr><tr><td>Dow SYLGARD 184 Encapsulante de Silicone Transparente 0,5 kg Kit</td><td>Dow</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacarose (Biologia Molecular), 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1,5 mL), pacote de 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>20901-551 / 05-402</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi de alta precisão Fisherbrand #4 Estilo Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-000-164</td><td></td></tr><tr><td>Fita de autoclave sem chumbo Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri quadradas Fisher</td><td>Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Leica Zoom 2000 Microscópio Estéreo</td><td>Microscópio Central</td><td>L-Z2000</td><td></td></tr><tr><td>Fita Micropore</td><td>3M</td><td>B0082A9FEM</td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519-10L</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Genesee Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de potássio</td><td>VWR International Inc</td><td>AA13451-36</td><td></td></tr><tr><td>Redi-earth Plug e Mix de Mudas</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>SUN239274728CFLP</td><td></td></tr><tr><td>Scotts Osmocote Plus</td><td>Hummert International</td><td>7630600</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design No. 22 Lâmina de Bisturi de Carbono</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-697</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>PINÇA DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM</td><td>VWR</td><td>102091-580</td><td></td></tr></tbody></table>

enxertia de mudas escalável, flexível e econômica

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

A enxertia de plântulas em estágio inicial tornou-se uma ferramenta popular em genética molecular para estudar as relações raiz-parte aérea dentro das plantas. A enxertia de mudas em estágio inicial da pequena planta-modelo, Arabidopsis thaliana, é tecnicamente desafiadora e demorada devido ao tamanho e fragilidade de suas mudas. Uma coleção crescente de métodos publicados descreve essa técnica com diferentes taxas de sucesso, dificuldade e custos associados. Este trabalho descreve um procedimento simples para fazer um dispositivo de enxertia reutilizável in house usando mistura de elastômero de silicone, e como usar esse dispositivo para enxertia de plântulas. No momento desta publicação, cada dispositivo de enxertia reutilizável custa apenas US$ 0,47 em materiais consumíveis para produzir. Usando este método, os iniciantes podem ter suas primeiras mudas enxertadas com sucesso em menos de 3 semanas do início ao fim. Este procedimento altamente acessível permitirá que os laboratórios de genética molecular de plantas estabeleçam a enxertia de plântulas como parte normal de seu processo experimental. Devido ao total controle que os usuários têm na criação e design desses dispositivos de enxertia, essa técnica poderia ser facilmente ajustada para uso em plantas maiores, como tomate ou tabaco, se desejado.

Vários aspectos do desenho da tira de enxertia foram testados para identificar as condições ideais de enxertia que exigiam menor habilidade técnica (Tabela 1). Todos os ensaios de enxertia foram concluídos em meio MS de sacarose a 0,5%, que foi previamente relatado como um meio de enxertia ideal11,12.
O crescimento ótimo das plântulas não pode ser alcançado com a germinação em faixa Na primeira iter...

Este protocolo descreve um método robusto de enxertia de plântulas que não requer experiência ou treinamento prévio e pode ser executado a um custo muito baixo usando materiais de fácil acesso na maioria dos laboratórios de biologia molecular.

Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...

A enxertia de semeadura em estágio inicial é uma ferramenta poderosa para definir a sinalização de longa distância em plantas. Esperamos que este método auxilie na adoção bem-sucedida da enxertia semeadeira sem treinamento prático. Comece preparando a placa de Petri quadrada, medindo 100x100 milímetros para fundição do elastômero de silicone.Pegue o fio de calibre 29 em laços de torção depois de remover o revestimento de papel externo no fio com acetona. E endireitar totalmente o fio, enrolando-o em uma superfície dura e uniforme com um objeto plano pesado, como um rack de tubo de metal. Em seguida, coloque quatro pedaços de fios endireitados equidistantes um do outro na placa de Petri quadrada, garantindo que os fios fiquem achatados no fundo do prato.Despeje a solução mista de elastômero de silicone sobre os fios na placa de Petri e coloque a tampa sobre a placa. Depois de deixar o silicone curar por 24 a 48 horas à temperatura ambiente, remova a folha de silicone da placa de Petri usando pinças limpas e mova-a para uma superfície limpa e plana. Retire os fios da folha de silicone.Para garantir que os canais estejam abertos de um lado, use pinças de ponto fino para limpar a fina camada de silicone que bloqueia o lado aberto dos canais. Corte a folha de silicone perpendicularmente aos canais em tiras de três milímetros usando uma tesoura limpa. Coloque cada tira em um envelope de papel alumínio e lacre com fita autoclave.Autoclave as tiras a 121 graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes de armazená-las até que seja necessário. Para esterilizar e vernalizar as sementes, tomar um mililitro de solução de água sanitária a 50% contendo 0,1% de Tween 20 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e suspender até 100 sementes de arabidopsis. Incubar a suspensão das sementes à temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos.Após a incubação, aspirar ou pipetar a solução de água sanitária em condições estéreis. Enxágue as sementes com um mililitro de água destilada esterilizada. Certifique-se de inverter os tubos adequadamente enquanto enxagua as sementes.Para remover qualquer solução de água sanitária deixada na parte superior do tubo, repita o enxágue quatro vezes. Deixe aproximadamente 250 microlitros de água com as sementes no tubo e guarde as sementes no escuro a quatro graus Celsius por três dias. Em seguida, antes de plaquear as sementes, coloque as tiras estéreis na superfície da placa MS preparada para orientar o alinhamento das sementes com os canais das tiras.Em seguida, trabalhando em condições estéreis, use uma ponteira de pipeta de 20 microlitros para aspirar e transferir o número adequado de sementes preparadas para a placa. Uma vez que as sementes estão chapeadas, remova as tiras estéreis. Tampe o prato.E sele um dos lados da placa paralelo às fileiras de sementes com parafilme. Enrole a fita respirável em cima do parafilme e ao redor de todas as outras bordas da placa para permitir a troca de ar durante a incubação. Oriente cuidadosamente duas placas verticalmente com seus lados selados com parafilme voltados para baixo.Separe-os na parte inferior, colocando horizontalmente um tubo centrífugo de 15 mililitros no meio, enquanto os prende juntos por cima com um elástico. Certifique-se de que as superfícies da placa formem um ângulo de 100 a 110 com a superfície da bancada. Guarde as placas nessa orientação por 72 horas na escuridão total a 21 graus Celsius para permitir que os hipocótilos das mudas cresçam cerca de cinco milímetros de comprimento.Depois disso, remova o setup do escuro e mantenha-o sob um ciclo claro de 16 horas e escuro de oito horas por dois a quatro dias na mesma temperatura antes da enxertia. Enxertar as mudas entre cinco e sete dias após o plaqueamento. Coloque uma faixa de enxertia sobre as mudas, encaixando seus hipocótilos nos canais.Posicione suavemente a muda, de modo que a junção raiz-hipocótilo permaneça no fundo da tira de silicone para preparar a muda para o corte. Trabalhando em uma capa estéril com o auxílio de um escopo de dissecção, prepare as mudas para enxerto. Usando uma lâmina de bisturi fresca, faça um corte reto, limpo e perpendicular através do hipocótilo.Evite pressionar e empurrar a muda para dentro do ágar. Em seguida, remova a calha e mantenha a parte cortada da calha hidratada, garantindo o contato com a superfície do meio. Alternativamente, a calha pode ser movida para uma placa de Petri cheia de água destilada estéril.Para preparar os porta-enxertos, segure cuidadosamente a raiz dentro do espaço entre as pinças fechadas e gire suavemente para puxá-la, deixando a seção de corte dos porta-enxertos no meio da tira. Em seguida, pegue suavemente a calha desejada usando a pinça de ponta fina e insira-a na parte superior do canal. Visualmente, confirme o contato entre a copa e o porta-enxerto para obter um enxerto bem sucedido.Após a confecção de todos os enxertos, envolver as placas com parafilme e fita adesiva respirável e montá-las da mesma forma demonstrada anteriormente, sem atrapalhar as mudas ou tiras de silicone. Mova cuidadosamente as placas para uma câmara de crescimento ajustada a 26 graus Celsius com um ciclo claro de 16 horas e escuro de oito horas. Após sete a 10 dias, avaliar as mudas enxertadas em condições estéreis utilizando pinças para descascar cuidadosamente a tira de silicone de um lado e liberar as mudas dos canais.Remova quaisquer raízes adventícias que cresçam da copa, cortando-as com uma lâmina de bisturi fresca ou esmagando-as com pinças de ponta fina. Mais uma vez, avaliar visualmente se o porta-enxerto ficou firmemente aderido à copa, formando um enxerto bem-sucedido. Mover os enxertos bem-sucedidos para o solo de propagação de mudas e cobrir o solo com plástico transparente por alguns dias enquanto as mudas se estabelecem.Permita que as plantas cresçam sob os ciclos claro e escuro mencionados anteriormente a 21 graus Celsius. Ensaios de enxertia para determinar o protocolo ótimo de enxertia revelaram uma taxa global de sucesso de enxertia de 25% quando as sementes germinaram diretamente sobre as tiras de silicone com canais fechados. A reorientação das sementes para manter os embriões cotilédones e o radical apontando para baixo durante a germinação aumentou ligeiramente a eficiência de enxertia para 33%Ao retirar o silicone que fecha os canais para permitir o contato entre a semente e o meio de crescimento, 85% das plântulas germinaram com sucesso.No entanto, a taxa de sucesso de enxertia manteve-se em 31%, indicando que o crescimento ótimo das plântulas não pôde ser alcançado com a germinação em faixa. Curiosamente, o protocolo demonstrado, no qual as plântulas foram cultivadas verticalmente na placa de enxertia antes de serem inseridas nos canais abertos das tiras, produziu uma taxa geral de sucesso de enxertia de 48% durante os dois primeiros ensaios. Considerando a menor taxa de sucesso do terceiro e do ensaio relativamente pequeno, que pode ser atribuído a pequenas variações nos locais de enxertia, o sucesso geral da enxertia foi de 45%, comparável ao método em que as mudas foram cultivadas em placas horizontais, cortadas em superfície sólida e inseridas em tiras de enxertia.No entanto, o protocolo demonstrado é comparativamente menos demorado. Usando este protocolo, os laboratórios novos na enxertia de mudas podem criar rapidamente um grande número de dispositivos de suporte de enxertia, ao mesmo tempo em que podem personalizar o dispositivo para atender às suas necessidades específicas facilmente.

scalable-flexible-and-cost-effective-seedling-grafting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculação direta de mudas de milho por injeção com clones infecciosos do Vírus do Mosaico do Rabo-de-Raposa Recombinante e do Vírus do Mosaico da Cana-de-Açúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a entrega mediada por Agrobacterium de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico. Ele descreve o processo de infecção por Agrobacterium , disseminação viral sistêmica e mudanças fenotípicas impulsionadas pela interferência de RNA.

Entrega mediada por agrobactérias de clones virais recombinantes em mudas de milho para silenciamento gênico

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

vasos sanguíneos engenharia escaláveis ​​iria melhorar a aplicabilidade clínica. Usando guias impresso-3D facilmente consideráveis, anéis de músculo liso vascular foram criados e empilhados para uma forma tubular, formando um enxerto vascular. Enxertos podem ser dimensionados para atender toda a gama de dimensões das artérias coronárias humanas, simplesmente mudando o tamanho guia impresso-3D.

A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.

Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para eficientemente tornando homo - e heterografts entre melancia e cabaça, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados, para a investigação de microRNAs frio-responsivo.

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Este protocolo foi projetado para fornecer informações instrucionais para a propagação clonal da Cannabis sativa L. através da implementação de sistemas aeropônicos. O método descrito aqui inclui todos os suprimentos e protocolos necessários para reproduzir com sucesso propriedades morfológicas e químicas desejáveis no gênero Cannabis.

Empregando Sistemas Aeropônicos para a Propagação Clonal da Cannabis

O artigo descreve um protocolo de resgate embrionário para a regeneração de embriões imaturos derivados da hibridização interespecífica de Cucurbita pepo e Cucurbita  moschata. O protocolo pode ser facilmente replicado e será um recurso importante para os programas de melhoramento de abóbora.

Protocolo de Resgate de Embriões para Hibridização Interespecífica em Abóbora

Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.

Um Protocolo Simples para Mapear as Características da Arquitetura do Sistema Radicular da Planta

Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para transfectar transitoriamente milhões de protoplastos de milho para testar grandes bibliotecas de plasmídeos em células do mesofilo do milho.

Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.

Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes

Aprenda enxertia de mudas para biologia vegetal usando Arabidopsis thaliana. Este método econômico e flexível permite estudar sinalização de longa distância sem treinamento prévio.

Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica

Explorar mais vídeos