Name: Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a medir influxo de cálcio em células T primárias murinas por citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite avaliar simultaneamente subpopulações e fenótipos de superfície sem isolamento prévio.

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R01AI132419, - Brasil | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muito obrigado aos nossos colegas da Cytek por discussões contínuas de análise citométrica espectral completa no software Aurora e SpectroFlo. As figuras foram criadas com BioRender.com.

<ol><li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation%3A+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li>
<li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+calcium+mobilization+study+%28flow+cytometry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).</li>
<li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).</li>
<li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+%28ITK%29+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+%28RLK%29+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li>
<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
<li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase%2C+Itk%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022).</li>
<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022).</li>
<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Este protocolo descreve um ensaio otimizado projetado para medir as respostas de cálcio em células T primárias murinas carregadas com corante indicador ratiométrico Indo-1 titulado usando citometria de fluxo de espectro completo 7,8. A vantagem de realizar ensaios de fluxo de cálcio usando citometria de fluxo de espectro total é a capacidade de coloração de marcadores de superfície celular multiplex em combinação com a avaliação da fluorescência do Indo-1. A cito...

O influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T (TCR) é uma medida útil da ativação de células T e é frequentemente usado para determinar se uma população de células T tem respostas prejudicadas nas etapas proximais da via de sinalização TCR1. As medidas do influxo de cálcio são geralmente realizadas pré-marcando as células T com um ou um par de corantes indicadores fluorescentes de cálcio e, em seguida, examinando os sinais fluorescentes usando citometria de fluxo em tempo real após a reticulação do TCR 2,3,4. O indo-1, um corante de cálcio ratio-métrico, é excitado pelo laser UV com pico de emissões em dois comprimentos de onda diferentes dependentes da ligação do cálcio5, e é um corante indicador comumente usado para análise por citometria de fluxo das respostas de cálcio em linfócitos vivos. Como o perfil de emissão de Indo-1 é bastante amplo, pode ser desafiador combinar a avaliação de Indo-1 com a análise simultânea de múltiplos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo passa-faixa. Essa limitação restringe o uso da análise por citometria de fluxo das respostas do cálcio a populações pré-purificadas de células T ou a populações identificadas por um conjunto limitado de moléculas de superfície celular.
Para abordar as limitações da medição das respostas de cálcio em populações heterogêneas de linfócitos primários usando citometria de fluxo passa-faixa, um protocolo foi desenvolvido para medir a fluorescência do Indo-1 usando citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite a multiplexação do Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular, aproveitando as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo. A vantagem do uso da citometria de fluxo de espectro total sobre a citometria de fluxo convencional é sua capacidade de distinguir os sinais fluorescentes de corantes altamente sobrepostos, aumentando assim o número de marcadores de superfície que podem ser avaliados simultaneamente em cada amostra. A citometria de fluxo convencional utiliza filtros passa-banda e é restrita a um fluorocromo por sistema detector6. A citometria de fluxo de espectro total coleta sinais em todo o espectro do fluorocromo usando 64 detectores em um sistema de citometria de fluxo espectral de cincolasers 7,8. Além disso, a citometria de fluxo de espectro total aproveita os detectores APD (Avalanche Photo Diode) que apresentam sensibilidade aumentada em relação aos detectores de tubo fotomultiplicador presentes nos citômetros de fluxoconvencionais8. Consequentemente, esta abordagem é ideal para populações de células heterogêneas, tais como células mononucleares do sangue periférico ou suspensões de células linfoides secundárias murinas, pois elimina a necessidade do isolamento de populações específicas de células T antes da marcação do corante de cálcio. Em vez disso, os perfis de expressão de marcadores de superfície celular e o gating por citometria de fluxo após a coleta de dados podem ser usados para avaliar as respostas de cálcio em cada população de interesse. Como mostrado neste relatório, o Indo-1 pode ser prontamente combinado com oito anticorpos conjugados ao fluorocromo, resultando em um total de 10 assinaturas espectrais únicas. Além disso, este método pode ser prontamente aplicado a misturas de células de linhagens de camundongos congenicamente distintas, permitindo a análise simultânea das respostas de cálcio em células T selvagens em comparação com aquelas de uma linhagem de camundongos direcionada a genes.

<table><tbody><tr><td>Placas tratadas com TC de 12 poços</td><td>Cell Treat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 mL cônico</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mL com tampa</td></tr><tr><td>Tubos de fluxo de poliéster de 5mL</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>seringa</td><td>BD</td><td>309646</td><td>êmbolo apenas é usado sheith é descartado</td></tr><tr><td>filtro de 70uM</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC lysis</td><td>Buffer Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Spectral Flowcytometer</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath Beads</td><td>coleparmer</td><td>Item # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramer APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Ferramentas de</td> dissecação científica <td></td><td></td>formal</tr><tr><td>McKesson</td><td></td> <td># 487593</td><td>Pinça de Tecido McKesson Adson 4-3/4 Polegadas de Comprimento Aço Inoxidável Não Estéril Não Trava Cabo de Polegar 1 X 2 Dentes</td></tr> Ferramentas de <tr><td>Dissecção Tesoura</td><td>McKesson</td><td>#970135</td><td>Tesoura Cirúrgica McKesson Argent&trade; Anel de Dedo de Grau Cirúrgico de 4-1/2 Polegadas Ponta Reta Afiada / Ponta Afiada</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Lote EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclond</td><td>SH30071.03</td><td>AE29165301</td></tr><tr><td>Software FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-AM Corante Éster</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>Corante de Carga de Cálcio&nbsp;</td></tr><tr><td>ionomicina</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Fantasma Vivo/Morto 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1.7mL</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Purificado CD16/CD32 (Escudo FC) ( 2.4G2)</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC Bloco</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>+ vermelho fenol</td></tr><tr><td>RPMI livre de fenol</td><td>Gibco</td><td></td> <td>11835030-vermelho fenol centrífuga de</td></tr><tr><td>mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebiociência</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gama;/&delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td><td></td><td>Produto No: C06019</td><td>Inclui Tripan</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Waterbath Marca Fisher Banho Seco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise do influxo de cálcio induzido por receptores de células t em células t primárias murinas por citometria de fluxo de espectro completo

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

O influxo de cálcio em resposta à estimulação do receptor de células T é uma medida comum da sinalização de células T. Vários corantes indicadores de cálcio foram desenvolvidos para avaliar a sinalização do cálcio por citometria de fluxo passa-faixa. Este protocolo é projetado para medir as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando citometria de fluxo de espectro completo. Os esplenócitos totais são marcados com o corante indicador de cálcio ratiométrico Indo-1, juntamente com um painel de anticorpos conjugados ao fluorocromo para moléculas de superfície celular. Aproveitar os recursos da citometria de fluxo de espectro completo fornece uma plataforma para utilizar uma ampla gama de colorações da superfície celular em combinação com o Indo-1. As células são então analisadas em tempo real a 37 °C antes e depois da adição de um anticorpo anti-CD3 para estimular o receptor de células T. Depois de desmisturar os sinais espectrais, a proporção de Indo-1 ligado ao cálcio e livre de cálcio é calculada e pode ser visualizada ao longo do tempo para cada população fechada de esplenócitos. Esta técnica pode permitir a análise simultânea das respostas do cálcio em múltiplas populações celulares.

O fluxo de trabalho experimental para avaliar as respostas de cálcio em células T murinas primárias usando um corante ratiométrico Indo-1 com coloração superficial multiplexadora é mostrado na Figura 1. Após a colheita e processamento dos esplenócitos de camundongos em uma única suspensão celular, as células são coradas com um éster Indo-1 AM e a superfície corada com anticorpos ligados ao fluorocromo. Uma vez concluída a carga do corante e a coloração de anticorpos, as amostras de linfócito...

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

O protocolo permite que os investigadores meçam simultaneamente a resposta ao cálcio em células T primárias, juntamente com a avaliação de seu subconjunto e fenótipo de superfície. A principal vantagem dessa técnica é que ela evita a necessidade de isolar subconjuntos específicos de células antes de examinar suas respostas de cálcio. Para começar, prepare uma solução estoque de um micrograma por microlitro de Indo-1 AM adicionando 50 microlitros de DMSO em um frasco contendo 50 microgramas de Indo-1 AM. Diluir a solução-mãe num volume adequado de cRPMI e numa concentração de seis microgramas por mililitro.Coloque o meio em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, use esse meio para diluir uma suspensão de célula previamente preparada em uma proporção de um para um para obter cinco a 6 milhões de células por mililitro. Em seguida, a uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, adicionar um mililitro de suspensão celular por poço por condição experimental.Preparar uma única amostra de controle corada para Indo-1 livre de cálcio adicionando EGTA às células carregadas de corante Indo-1. Prepare um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1. Preparar um controle positivo de Indo-1 adicionando ionomicina a uma concentração de 50 micromoles à suspensão celular carregada de corante no citômetro de fluxo.Além disso, prepare um poço para controles de coloração única para populações celulares adicionais usando fluoróforos conjugados com anticorpos. Em seguida, adicione dois microgramas de anticorpo bloqueador do receptor FC por milhão de células e incube a placa por 45 minutos com toques a cada 15 minutos para ressuspender as células. Após a incubação, misture e retire todo o volume de células da placa e adicione-o a tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro.Centrifugar e decantar o sobrenadante. Uma vez que as células são lavadas com um mililitro de cRPMI pré-aquecido, pellet novamente e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em um mililitro de cRPMI e incubar cada tubo, deixando o topo do tubo levemente aberto para as trocas gasosas, permitindo a completa desesterificação dos ésteres de AM intracelulares.Em seguida, prepare uma mistura mestre de todos os anticorpos conjugados de fluorocromo definidos pelo usuário e adicione-a às células de repouso por um mililitro do volume celular. Após o repouso, granule as células e lave o pellet ressuspendendo em um mililitro de cRPMI resfriado a quatro graus Celsius. Repita este passo e coloque os tubos sobre gelo.Ressuspenda amostras individuais em 500 microlitros de cRPMI livre de fenol vermelho usando um tubo de fluxo de poliestireno de cinco mililitros com tampa. Para manter a temperatura usando a análise de fluxo de cálcio, prepare um banho de contas adicionando contas de banho a um pequeno banho de água e aqueça-o até 37 graus Celsius. Corte cuidadosamente um tubo de 50 mililitros ao meio e descarte a parte superior do tubo.Encha três quartos do tubo restante com contas de banho e deixe-o atingir 37 graus Celsius no banho de contas. Coloque o banho de contas perto de um citômetro de fluxo, juntamente com um suporte de isopor para posicionar o tubo. Antes da análise no citômetro de fluxo, aqueça os tubos individualmente a 37 graus Celsius por sete minutos.Faça login no software do citômetro de fluxo e clique na guia Biblioteca. Em seguida, selecione etiquetas fluorescentes para adicionar Indo-1 ligado ao cálcio e Indo-1 sem cálcio. Em seguida, selecione laser UV em grupos de etiquetas fluorescentes e clique em adicionar para adicionar um nome de etiqueta fluorescente.Escolha o comprimento de onda de excitação e emissão a laser e clique em Salvar. Continue para a montagem experimental. Clique na guia Aquisição, Abrir/Criar um novo experimento e adicione as etiquetas fluorescentes desejadas ao experimento.Crie um grupo de referência e um novo grupo de amostra para o experimento e rotule ambos os grupos. Na guia Aquisições, defina os eventos para registrar no máximo em 10 milhões, o volume de parada para o volume máximo de 3000 microlitros e o tempo de parada para o máximo de 36.000 segundos. Adquira controles corados únicos para anticorpos conjugados definidos pelo usuário incluídos no painel multicolorido e para corante funcional Indo-1.Adicionar 50 micromoles de ionomicina ao controle positivo e vórtice Indo-1 ligado ao cálcio. Adicione o tubo de fluxo à placa de injeção de amostra e clique em Gravar. Em seguida, adicione o controle negativo de Indo-1 sem cálcio ao citômetro de fluxo e clique em Gravar.Desmisture os controles manchados clicando no botão Desmisturar. Quando a desmistura estiver concluída, crie gráficos sequenciais usando a planilha não misturada, como SSC-A versus FSC-A, para remover detritos da amostra e SSC-A versus SSC-H para remover duplicatas. Em seguida, crie portões clicando em Plotar.Adicione um gráfico à planilha e clique duas vezes dentro do portão para criar um condomínio fechado a jusante. Continue até que todas as populações de interesse sejam contabilizadas. Em seguida, aqueça as amostras de controle coradas únicas previamente preparadas a 37 graus Celsius para análise sequencial.Configure o software de citometria de fluxo e execute DI em água gelada por dois a três minutos para garantir a estabilidade fluídica do citômetro de fluxo. Configure gráficos sequenciais na planilha não misturada criando portas usando o retângulo de polígono ou botões de porta de elipse para incluir a população de interesse. Clique duas vezes dentro do portão e altere os parâmetros dos eixos y e x para SSC-A versus SSC-H.Complete a definição dos parâmetros do eixo clicando com o botão esquerdo do mouse no eixo. Crie um gráfico com SSC-A versus sinal de corante de viabilidade. Portar as células vivas que são negativas para coloração de corante de amina.As células vivas negativas para coloração de mortos vivos se agruparão na marca zero nos eixos y e x. Clique duas vezes no gráfico interno para criar um novo gráfico contendo apenas linfócitos vivos de célula única. Mude o eixo Y para Indo-1 versus o tempo no eixo x para visualização do influxo de cálcio.Em seguida, coloque a amostra biológica aquecida no SIT da máquina. Execute as amostras a 2.500 a 3000 eventos por segundo em uma taxa de fluxo média para visualizar o influxo de cálcio em um número limitado de populações celulares. Adicione o próximo tubo ao banho de contas no controle de aquisição.Pressione Record para registrar os dados iniciais por 30 segundos para obter um nível basal de sinalização de cálcio na amostra. Em seguida, clique em Parar e remova o tubo da porta de injeção da amostra. Adicione 30 microgramas de anti-CD3 não conjugado diretamente no tubo de amostra para iniciar o influxo de cálcio.Coloque rapidamente o tubo de volta na porta de injeção da amostra e pressione Gravar no software. Registre os dados por sete minutos, observando o tempo decorrido sob os controles de aquisição no software. Em seguida, pressione Parar no software.Adicionar um micrograma por mililitro de ionomicina e registrar por 30 segundos para obter o sinal máximo de cálcio nas células de interesse. Continue para a próxima amostra e repita o fluxo de trabalho até que todas as amostras tenham sido coletadas. Salve o experimento e clique no arquivo zip de exportação.Arquivos não misturados são enviados para o software de análise de citometria de fluxo externo. Um sinal consistente estável em um gráfico de tempo versus dispersão lateral indicou estabilidade fluídica. A população de linfócitos foi delimitada seguida da discriminação de singlets em um gráfico de altura de dispersão lateral versus área.Singlets foram avaliados quanto à viabilidade. Em seguida, aplicou-se o gating na população CD19 negativa. Esses subgrupos de células T foram avaliados usando anticorpos contra CD4 e CD8 visualizando fluorescência Indo-1 ligada ao cálcio versus o tempo.Em populações celulares individuais, o gráfico de Indo-1 ligado ao cálcio versus o tempo mostrou uma linha de base antes da estimulação. Um pico de resposta à medida que os níveis de cálcio intracelular diminuíram e a resposta de cálcio provocou a adição de ionomicina. Antes da adição do anticorpo anti-CD3, um fraco sinal de Indo-1 ligado ao cálcio foi detectado.Durante o pico de resposta, as células mostraram um forte sinal de Indo-1 ligado ao cálcio e redução da Indo-1 livre de cálcio. Aos cinco minutos após o pico, a fluorescência do Indo-1 quase retornou à linha de base. Após a adição de ionomicina, um sinal robusto de Indo-1 ligado ao cálcio foi visualizado, indicando adequada carga de corante das células.A análise das populações raras foi realizada plotando-se Indo-1 ligado ao cálcio versus Indo-1 livre de cálcio após o gating em cada população de interesse. E analisar a resposta do cálcio ao longo de todo o curso de tempo para cada subgrupo. O fluxo de cálcio usando perfil de espectro completo pode levar à análise por citometria de fluxo de alto parâmetro em uma variedade de subgrupos imunes.A análise de alta dimensão para agrupamento imparcial de subgrupos de células T pode ser usada em combinação com citometria de fluxo de alto parâmetro para análise avançada. Esta técnica é desenvolvida para a análise de múltiplos subconjuntos imunológicos em conjunto uns com os outros em uma amostra em massa.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células...

Exame de seleção positiva e negativa Tímico por citometria de fluxo

Este vídeo mostra a avaliação da ativação das células B através da utilização de lipossomas antigênicos. As células B tratadas com corante Indo-1 sensível ao cálcio são distinguidas usando citometria de fluxo e sua relação de fluorescência violeta-azul é analisada. À medida que as células encontram lipossomas antigênicos, ela desencadeia a ativação das células B por meio do influxo de cálcio, aumentando progressivamente a proporção do sinal de fluorescência violeta para azul ao longo do tempo.

Monitorando a ativação de células B com lipossomas antigênicos usando um ensaio de fluxo de cálcio

Este vídeo analisa o influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T. Os anticorpos anti-CD3 ativam as vias de sinalização das células T, levando a um aumento nos íons de cálcio intracelulares que se ligam ao corante Indo-1. Na citometria de fluxo, uma mudança de espectro do estado livre de cálcio para o estado ligado ao cálcio se correlaciona com o influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T.

Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.

Medidas cálcio citosólico em células epiteliais renais por citometria de fluxo

arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Citometria de fluxo em tempo real fornecendo sensibilidade de célula única, é especialmente adequada para quantificar as funções do receptor multimodal de culturas vivas. A função de receptor P2X7 usando células progenitoras neurais adulto, foi avaliada através do influxo de cálcio, detectado pelo corante indicador de cálcio, formação do poro transmembrana pela absorção do brometo de etídio e fagocitose usando grânulos látex fluorescentes.

Citometria de fluxo de viver-pilha em tempo real para investigar o influxo de cálcio, formação de poros e fagocitose pelos receptores P2X7 em células progenitoras neurais adulto

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para resolver sinais locais iniciais de Ca2+ , conhecidos como microdomínios de Ca2+ , em células T murinas e humanas primárias usando microscopia de fluorescência. Este protocolo serve como um recurso valioso para pesquisadores que examinam as vias de sinalização de Ca2+ dentro das células imunes e para desvendar ainda mais sua função.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Aprenda a medir influxo de cálcio em células T primárias murinas por citometria de fluxo de espectro completo. Este método permite avaliar simultaneamente subpopulações e fenótipos de superfície sem isolamento prévio.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo (Vídeo) | JoVE Journal

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

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