Coleta Dinâmica em Tempo Real de Fluido Extracelular do Hipocampo de Ratos Conscientes Usando um Sistema de Microdiálise
21 de outubro de 2022
O protocolo aqui fornece uma amostragem dinâmica detalhada em tempo real do fluido extracelular do hipocampo de ratos acordados usando um sistema de microdiálise.
O fluido extracelular hipocampal e a lotação pela técnica de microdiálise cerebral contribuem para monitorar a micro doença específica das doenças do sistema nervoso central. A técnica de microdiálise cerebral alcança a dinâmica e a contínua inquisição de fluido cerebral intersticial em regiões específicas do cérebro de ratos não anestesiados. Comece fixando o rato anestesiado em um localizador cerebral estereotáxico e limpe a área cirúrgica raspada com um cotonete de iodopovidona e etanol três vezes antes da operação.
Em seguida, faça uma incisão cranial facial de 1,5 centímetro até o meio com tesoura cirúrgica e remova o periósteo com tesoura cirúrgica e pinça oftálmica. Considerando o bregma como posição basal, usando uma broca craniana perfura o endocrânio para perfurar uma abertura de dois milímetros na região CA1 do hipocampo. Agora fixe a estileta do cateter na garra de um localizador cerebral estereotáxico e ajuste a posição do invólucro de microdiálise nas posições anteroposterior, médio-lateral e ventral dorsal.
Ajustar a válvula dorsoventral do localizador estéreo cerebral e implantar o invólucro de microdiálise na região CA1 a uma profundidade de 3,5 milímetros. Perfure mais três aberturas com um diâmetro de dois milímetros de tal forma que as três aberturas formem um triângulo no qual a abertura da sonda está localizada centralmente. Parafusos de implante nas aberturas a uma profundidade de um milímetro e fixar o cateter sonda com cimento dental.
Em seguida, use uma sutura cirúrgica de 4-O para fechar a pele. Conecte a microseringa da bomba de microdiálise com o dispositivo de atividade acordada ACSF e o coletor de amostras criogênicas de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, para descarregar o ar na tubulação, ajuste a bomba de microdiálise a uma taxa de um microlitro por minuto.
Em seguida, conecte a tubulação e a sonda de microdiálise cerebral e opere a bomba de microdiálise a uma taxa de um microlitro por minuto para injetar ACSF na sonda até que a superfície da sonda esteja levemente úmida. Imergir a sonda em uma solução de injeção de heparina sódica para uso subsequente. Para coletar o HECF do rato acordado, insira a sonda de microdiálise cerebral no cateter de sonda e coloque o rato em uma câmara com acolchoamento para garantir que os ratos estejam livres para se movimentar.
Ligue o controlador giratório multicanal para evitar o entrelaçamento das tubulações de microdiálise durante o movimento livre do rato. Em seguida, ligue a bomba de microseringa e bombeie o ACSF a uma taxa de um microlitro por minuto. Após um equilíbrio de 60 minutos do sistema de coleta de HECF de microdiálise, coletar o HECF periodicamente.
Após o término da amostragem, retire a sonda de microdiálise cerebral do cateter de sonda. Imergir a sonda em água deionizada e lavar com água deionizada por 12 horas para remover deposições de sal encalhado da tubulação e da sonda. Retire a sonda e coloque-a em uma solução de 0,05% a quatro graus Celsius.
O líquido extracelular hipocampal adquirido pela técnica de microdiálise cerebral é semelhante à água, incolor e transparente na taxa de amostragem definida. Os procedimentos mais importantes são implantar a microdiálise cuidadosamente na região CA1 e inserir a sonda no cateter pop. A técnica de microdiálise simples permite auxiliar a mudança dinâmica de marcadores de doenças em regiões específicas do cérebro, a substância da eficácia da droga e o catabolismo tecidual dos componentes da droga.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para amostragem dinâmica em tempo real do fluido extracelular do hipocampo (FECH) de ratos acordados, utilizando uma técnica de microdiálise cerebral. O processo permite aos pesquisadores monitorar marcadores específicos de doenças em distúrbios do sistema nervoso central, obtendo amostras contínuas de regiões cerebrais específicas sem anestesiar os animais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doenças Neurodegenerativas
- Técnicas de Microdiálise
Contexto
- Compreender a dinâmica do fluido extracelular é fundamental para estudar os mecanismos neuronais e a plasticidade.
- Os métodos atuais geralmente envolvem técnicas invasivas que podem influenciar o contexto biológico.
- A microdiálise permite a coleta de fluido intersticial enquanto o indivíduo está acordado, fornecendo dados mais relevantes.
- Este protocolo atende à necessidade de monitoramento contínuo da composição do fluido cerebral em modelos vivos.
Objetivo do Estudo
- Aprimorar o monitoramento de marcadores de doenças no hipocampo mediante a implementação de uma abordagem de amostragem não invasiva.
- Fornecer uma estrutura metodológica detalhada para que pesquisadores possam replicar o procedimento.
- Estabelecer um sistema confiável para observar os efeitos de fármacos e alterações metabólicas ao longo do tempo.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza um sistema de microdiálise implantado na região CA1 do hipocampo.
- Ratos acordados e não anestesiados servem como modelo biológico para a coleta de ECFH.
- A técnica de microdiálise mede o fluido a uma taxa de um microlitro por minuto.
- Passos críticos incluem a implantação precisa do cateter, equilibração e intervalos regulares de coleta.
- A limpeza do cateter de microdiálise após a coleta é realizada para garantir a integridade dos dados.
Resultados Principais
- O HECF coletado é claro e incolor, permitindo a análise de marcadores de doenças.
- A metodologia detalhada permite experimentação sobre as mudanças dinâmicas nos ambientes neuronais.
- As informações obtidas com este método podem auxiliar na avaliação da eficácia de medicamentos e na compreensão do catabolismo tecidual.
Conclusões
- Este estudo demonstra o potencial da microdiálise no avanço do nosso entendimento sobre a dinâmica dos fluidos cerebrais e os processos das doenças.
- A capacidade de monitoramento contínuo permite a avaliação de alterações em tempo real na ação de fármacos e nos estados metabólicos.
- Essas descobertas são fundamentais para aprimorar as estratégias de enfrentamento das doenças neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta dinâmica em tempo real do fluido extracelular do hipocampo (HECF) em ratos conscientes permite o monitoramento direto de alterações neuroquímicas relevantes para a progressão de doenças do SNC e a eficácia de fármacos. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva em neurociência translacional ao fornecer dados quantitativos e resolvidos no tempo de biomarcadores provenientes de regiões cerebrais relevantes para a doença. A abordagem apóia a descoberta precoce e a redução de riscos mecanicistas em portfólios de neuroterapias direcionadas às vias do hipocampo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da dinâmica neuroquímica subjacente aos mecanismos de doenças do SNC in vivo.
- Apóia a validação funcional de alvos ao quantificar os efeitos de fármacos e metabólitos no hipocampo.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da medição direta de marcadores extracelulares relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece amostragem quantitativa validada do líquido extracelular cerebral para triagem de compostos subsequentes.
- Permite a coleta reprodutível e padronizada de dados neuroquímicos em modelos animais acordados.
- Apoia o desenvolvimento de ensaios para avaliação de respostas farmacodinâmicas a compostos ativos no SNC.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a medição de biomarcadores pré-clínicos com pontos finais relevantes para a doença na neurociência translacional.
- Permite a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, acompanhando os efeitos dinâmicos das drogas in vivo.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em leituras neuroquímicas em tempo real.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de microdiálise se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a análise quantitativa em tempo real do líquido extracelular do hipocampo em ratos conscientes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias para alvos no sistema nervoso central mediante o monitoramento de alterações dinâmicas de biomarcadores.
- Triagem: Fornece dados neuroquímicos reprodutíveis e prontos para ensaios, para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece resultados quantitativos para comparar os efeitos de fármacos e estados patológicos em diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos pré-clínicos e translacionais ao alinhar a medição de biomarcadores com desfechos clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para descoberta de fármacos para o sistema nervoso central e validação de fluxos de trabalho de biomarcadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos no SNC.
- Valor Operacional: Padroniza a coleta de amostras neuroquímicas e melhora a reprodutibilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou interromper projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados acionáveis de biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a neuroterapias com base em evidências dinâmicas in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica e implante de sonda de microdiálise.
- Exige instrumentação especializada para coleta por microdiálise e análise quantitativa.
- Exige padronização entre equipes nos fluxos de coleta e protocolos analíticos.
- A adaptação a diferentes regiões cerebrais ou modelos de doença pode exigir otimização do protocolo.
- A coleta é limitada a analitos abaixo de 20 kDa devido às especificações de corte da sonda.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
