Name: Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a controlar frações de partículas em andaimes MAP microporosos para engenharia de tecidos. Este método padroniza propriedades do material e respostas celulares em culturas 3D.

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Os autores gostariam de agradecer aos Institutos Nacionais de Saúde, aos Institutos Nacionais de Distúrbios Neurológicos e Derrame (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) e ao Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (1R01AI152568). Este trabalho foi realizado em parte na Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membro da North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), que é apoiada pela National Science Foundation (número de prêmio ECCS-2025064) como parte da National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Os autores gostariam de agradecer ao ex-pós-doutor do laboratório, Dr. Lucas Schirmer, bem como a Ethan Nicklow, por sua assistência na geração do dispositivo impresso em 3D para experimentos de cultura celular.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

A ARA e a TS registraram uma patente provisória sobre essa tecnologia.

Demonstrou-se que a produção microfluídica de microgéis HA-NB gera microgéis com uma faixa mais estreita de distribuição de tamanho do que a produção em lote de emulsão 3,9. Os microgéis descritos neste protocolo foram formulados utilizando um reticulador MMP-clevable (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) para suportar a degradação do material. No entanto, os microgéis HA-NB também podem ser reticulados usando um ligador de di-tiol alternativo, como o ditiotreitol...

Andaimes de partículas microporosas recozidos (MAP) são uma subclasse de materiais granulares em que os blocos de construção de microgel (μgel) estão interligados para formar um andaime poroso a granel. Com a microarquitetura única desses andaimes granulares, a porosidade inata gerada pelo espaço vazio entre o microgel esférico interligado suporta infiltração e migração celular acelerada1. Os blocos de construção de microgel dos andaimes MAP podem ser fabricados a partir de polímeros sintéticos e naturais com modificações químicas2. Os métodos aqui descritos destacam especificamente o uso de microgéis compostos por uma espinha dorsal de ácido hialurônico (AH) modificada com alças funcionais de norborneno (NB). A alça funcional NB no polímero HA suporta reações químicas de clique para formar microgéis e ligá-los para gerar andaimes MAP 3,4. Numerosos esquemas têm sido empregados para ligar os microgéis juntos (ou seja, recozimento), como reações enzimáticas1, 5,6 à base de luz e química de clique livre de aditivos 3,7. A química do clique livre de aditivos é descrita neste trabalho, utilizando a conjugação inversa de demanda eletrônica Diels-Alder tetrazina-norborneno para interligar os microgéis HA-NB.
Para fabricar andaimes MAP, os usuários primeiro geram os blocos de construção de microgel usando emulsões reversas em sistemas de lote ou em dispositivos microfluídicos, bem como com pulverização eletrohidrodinâmica, litografia ou fragmentação mecânica2. A produção de microgéis esféricos HA-NB tem sido bem descrita e relatada anteriormente utilizando técnicas de emulsão em batelada2 e geração de gotículas microfluídicas 8,9,10,11. Neste trabalho, microgéis esféricos de HA-NB foram gerados em uma plataforma microfluídica com foco de fluxo para tamanho e forma controlados, conforme descrito anteriormente 8,9,10. Após a purificação, os microgéis existem em suspensão aquosa e devem ser concentrados para induzir um estado encravado. Quando encravados, os microgéis exibem propriedades de afinamento por cisalhamento, que lhes permitem funcionar como materiais injetáveis e de preenchimento de espaço1. Um método de induzir um estado atolado é secar os microgéis via liofilização, ou liofilização, e posteriormente reidratar o produto seco em um volume controlado12. Alternativamente, o excesso de tampão pode ser removido da pasta de microgel por centrifugação sobre um filtro ou com a remoção manual do tampão do pellet de microgel, seja por aspiração ou usando um material absorvente. No entanto, o uso da centrifugação para secar os microgéis pode gerar uma faixa altamente variável de frações de partículas e frações vazias ao fazer andaimes granulares12. Técnicas de liofilização de microgéis têm sido descritas utilizando IPA a 70% para microgéis de polietilenoglicol (PEG)13, óleos fluorados para microgéis de metacriloíla gelatina (GelMa)14 e etanol a 70% para microgéis de AH12. Este protocolo destaca métodos para liofilização de microgéis esféricos de AH usando etanol a 70%, um reagente de laboratório padrão, para reter as propriedades originais do microgel durante o processo de secagem. Os microgéis de AH liofilizados podem ser pesados e reidratados em porcentagens de peso definidas pelo usuário para controlar as frações finais de partículas em andaimes MAP12.
A etapa final na formação do andaime MAP depende do recozimento dos microgéis para criar um andaime poroso a granel1. Utilizando componentes da matriz extracelular nativa e empregando esquemas de recozimento bio-ortogonal, os andaimes MAP servem como uma plataforma biocompatível tanto para a cultura de células in vitro quanto para o reparo tecidual in vivo 3. Por meio dessas abordagens, os andaimes MAP podem ser fabricados a partir de blocos de construção HA-NB com frações de partículas definidas pelo usuário para seu emprego em aplicações de engenharia de tecidos12. O protocolo a seguir descreve a produção microfluídica de microgéis HA-NB seguida de liofilização e reidratação para controle da fração de partículas em andaimes MAP. Por fim, as etapas para o recozimento dos microgéis são descritas usando química bio-ortogonal para experimentos de cultura de células 3D in vitro .

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringa Luer-Lok estéril, de uso único, policarbonato</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de seringa Luer-Lok estéril, de uso único, policarbonato</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimida</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>Para síntese de tetrazina marcada com fluorescência</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Para coloração de amostras de cultura de células</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia com êmbolo, 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia, 4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba, 23 G 0,5", Não estéril, tampada</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vácuo de frasco, 0,22 &mu; m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>Para tampão de lavagem de microgel</td></tr><tr><td>Conjuntos de pistão capilar para pipetas de deslocamento positivo, 1000 &mu; L volume máximo</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de pistão capilar para pipetas de deslocamento positivo, 25 &mu; L volume máximo</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de pistão capilar para pipetas de deslocamento positivo, 250 &mu; L volume máximo</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio, grau ACS, frasco de vidro</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>Para síntese de pistola de plasma Corona de tetrazina marcada com fluorescência</td></tr><tr><td>, BD-10A Gerador de alta frequência</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>Frascos CryoTube, polipropileno, rosca interna com tampa de rosca</td><td></td> Células mesenquimais <td>de camundongo Nunc</td> 368632 <td></td></tr><tr><td>D1</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424 Exemplo de</td><td>linha celular para cultura em géis MAP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Para coloração de amostras de cultura de células</td></tr><tr><td>Óxido de deutério, 99,9 atom% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>Para espectroscopia de RMN</td></tr><tr><td>Tubo de diálise, membrana de celulose regenerada, corte de peso molecular de 12-14</td><td>kDa Spectra/Por</td><td>132703</td><td>Para purificar HA-NB e HA-Tet</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>Para síntese de tetrazina marcada com fluorescência</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>Para síntese de tetrazina marcada com fluorescência</td></tr><tr><td>4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metilmorfolínica cloreto (DMTMM)&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>Para modificar HA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>Ligante de ditiol não degradável (substituto do peptídeo clivável MMP)</td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, com 4500 mg/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>para D1 </td></tr><tr><td>paraformaldeído EMS para cultura de células, granulado</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>Para fazer 4% de etanol PFA</td></tr><tr><td>absoluto (200 provas)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td> Para placa de aquecimento de <td>cultura de células D1</td></tr><tr><td></td><td>Instrumentos Kopf</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro com lamínula</td><td>Daigger Scientific</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronato de sódio, 79 kDa de peso molecular médio, produzido na bactéria Streptococcus zooepidemicus, de qualidade farmacêutica, contaminação microbiana < 100 UFC/g, endotoxinas bacterianas < 0,050 UI/mg</td><td>de peso molecular médio de Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa foi usado para a síntese de HA-Tet, mas esses métodos podem ser adaptados para outros pesos moleculares.</td></tr><tr><td>Pacote de software IMARIS Essentials</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem de microscopia</td></tr><tr><td>Bomba de infusão, seringa dupla</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de laboratório com grampo de laboratório de suporte</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Fenil de lítio (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfina</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>N / A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus foi descontinuado, mas outros liofilizadores de console de grau de laboratório podem ser usados para este protocolo.</td></tr><tr><td>Metiltetrazina-PEG4-maleimida</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>Para síntese de tetrazina</td></tr><tr><td>2-(4-morfolino)etano sulfônico (MES)</td> marcada com fluorescência <td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Para modificar HA</td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura, 24 x 60 mm No. 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico SU8 master wafer</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Design personalizado feito internamente em sala limpa ou terceirizado</td></tr><tr><td>Óleo mineral, pesado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP-clivável ditiol reticulador peptídeo (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td> <td>GenScript</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norborneno-2-metilamina</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>Para HA-NB síntese</td></tr><tr><td>Fita de embalagem</td><td>Scotch</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG (tiol) 2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>Para síntese de tetrazina marcada com fluorescência</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 10.000 unidades / mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Para cultura de células D1</td></tr><tr><td>Placa de Petri, poliestireno, descartável, Diâmetro x H = 150 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Para lavagem de HMPs</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>tratamento de vidro repelente de água RainX</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>Solução de tratamento hidrofóbico sintético para tratamento de dispositivos microfluídicos</td></tr><tr><td>Peptídeo RGD (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elásticos</td><td>Grampos</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>Para diálise</td></tr><tr><td>Span 80 para síntese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastômero de Silicone</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>4019862</td><td>elastômero de polidimetilsiloxano (PDMS) para fabricação de dispositivos microfluídicos e dispositivos de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Filtro de seringa, Whatman Uniflo, 0.2 &mu; m PES, 13 mm de diâmetro</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Tetraview LCD microscópio digital</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>Sal de tetrazina-amina HCl</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>Para síntese HA-Tet</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>Para síntese de tetrazina tris(</td></tr><tr><td>2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%), Fenol vermelho</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>Para elevar células aderentes à semente em géis MAP</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 Tubo Médico Não-DEHP, Calibre da Agulha = 23, Espessura da Parede = 0,020 pol, Diâmetro interno = 0,020, Externo diâmetro = 0.060 in</td><td>Thomas Scientific</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de sistema de cura UV, LX500 LED&nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de cura UV, ponto LED UV</td><td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de luz UV, rastreável</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z Series Faca de precisão</td><td>Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

controlando a fração de partículas em andaimes de partículas microporosas recozidos para cultura de células 3d

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Os microgéis são os blocos de construção de andaimes de partículas microporosas recozidas (MAP), que servem como uma plataforma para a cultura de células in vitro e reparação de tecidos in vivo. Nesses andaimes granulares, a porosidade inata gerada pelo espaço vazio entre os microgéis permite a infiltração e migração celular. Controlar a fração do vazio e a fração de partículas é fundamental para o projeto do andaime MAP, pois a porosidade é uma sugestão bioativa para as células. Microgéis esféricos podem ser gerados em um dispositivo microfluídico para tamanho e forma controlados e, posteriormente, liofilizados usando métodos que impedem o fraturamento da rede polimérica. Após a reidratação, os microgéis liofilizados levam a frações de partículas controladas em andaimes MAP. A implementação desses métodos para a liofilização em microgel levou a estudos reprodutíveis mostrando o efeito da fração de partículas na difusão de macromoléculas e na disseminação celular. O protocolo a seguir abrangerá a fabricação, liofilização e reidratação de microgéis para controle da fração de partículas em andaimes MAP, bem como o recozimento dos microgéis através de reticulação bio-ortogonal para cultura de células 3D in vitro.

O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação de andaimes de partículas microporosas recozidos (MAP) com um esquema de reticulação bio-ortogonal, bem como frações de partículas controladas para cultura de células 3D. Primeiro, o AH foi modificado com grupos de pingente norborneno para ser usado tanto na formação de microgel quanto na interligação para formar andaimes MAP. Utilizando esses métodos, aproximadamente 31% das unidades de repetição de AH foram modificadas com sucesso com uma alça funcional norbornena (<...

Minimizar a variabilidade na fração de partículas dentro de andaimes granulares facilita a experimentação reprodutível. Este trabalho descreve métodos para a geração de andaimes granulares com frações de partículas controladas para aplicações de engenharia de tecidos in vitro .

Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

Materiais granulares, como andaimes MAP, são materiais injetáveis porosos feitos de partículas de hidrogel de tamanho micro interligadas. O controle da fração de partículas é fundamental para as propriedades do material e as respostas celulares. Frações de partículas variáveis em andaimes MAP resultam em uma variedade de propriedades de andaimes e respostas celulares, mas essa técnica permite que os usuários definam a fração de partícula final nos andaimes MAP que eles criam.Os andaimes MAP podem ser usados para promover o reparo e a regeneração de feridas complexas, bem como para administrar medicamentos. A fração de partículas, por exemplo, afeta a taxa e o grau de infiltração e regeneração celular. Este método pode ser aplicado em todas as classes de hidrogéis granulares.Agora que podemos fazer andaimes MAP com frações de partículas controladas pelo usuário, podemos estudar de forma reprodutível a bioatividade desses materiais e investigar respostas celulares únicas, como o confinamento. Configurar a geração de microgel microfluídico requer tempo e paciência enquanto você aprende as técnicas. É melhor ter vários dispositivos preparados e prontos para o caso de você ter problemas com a configuração.Comece com a produção microfluídica de ácido hialurônico, ou HA, e Norborneno, ou NB, microgéis. Antes de secar os microgéis, pese um tubo de tampa de rosca crio-seguro. Em seguida, em um exaustor estéril, transfira os microgéis lavados e purificados para um tubo de tampa de rosca crio-seguro usando uma pipeta de deslocamento positivo.Adicione etanol a 70% aos microgéis purificados e misture bem. Centrifugar o tubo durante cinco minutos a 5 000 g. Aspirar o sobrenadante e adicionar etanol a 70%.Misture bem e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar brevemente para garantir que os microgéis estejam no fundo do tubo. Adicione nitrogênio líquido a um recipiente criogênico e coloque o tubo de microgéis para congelar rapidamente.Após cinco a 10 minutos, remova o tubo de microgéis com pinça. Remova rapidamente a tampa e cubra o tubo com tecido de grau de laboratório. Prenda o tecido com um elástico e transfira-o para um recipiente de liofilização, ou câmara.Carregue a amostra no liofilizador seguindo as instruções do fabricante e liofilize a 0,066 Torr e a 63 graus Celsius negativos. Pesar os microgéis liofilizados do tubo antes de armazená-los à temperatura ambiente. Misture o polidimetilsiloxano, ou base de elastômero PDMS com o agente de cura em uma proporção de 10 para um em massa.Despeje a mistura PDMS em uma grande placa de Petri de plástico e degaseifique no exsicador por 30 minutos, ou até que todas as bolhas tenham desaparecido. Uma vez que todas as bolhas tenham desaparecido, coloque cuidadosamente o molde impresso em 3D no PDMS para minimizar a formação de novas bolhas. Coloque no forno a 60 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS.Após a cura, use uma faca ou lâmina de barbear para traçar suavemente ao redor do perímetro do dispositivo de cultura e remova cuidadosamente o molde. Use um soco de biópsia de quatro milímetros para remover qualquer PDMS do fundo dos poços. Corte os dispositivos para caber em uma folha de tampa de vidro.Use fita adesiva para remover a poeira do lado inferior do dispositivo de cultura. Coloque o deslizamento de tampa de vidro limpo e o dispositivo de cultura em uma placa quente a 135 graus Celsius por 15 minutos para remover a umidade. Em um exaustor, use uma pistola de plasma corona no alto da tampa de vidro e no lado inferior do dispositivo por 30 segundos.Em seguida, ligue rapidamente as superfícies tratadas. Aplique pressão suavemente para garantir uma boa vedação entre o dispositivo de cultura e o deslizamento da tampa de vidro. Coloque o dispositivo em um forno de 60 graus Celsius durante a noite para fixar a ligação.No dia seguinte, autoclave o dispositivo para esterilizar antes de usar in vitro. Em seguida, prepare a Partícula Microporosa Recozida, ou componentes do andaime MAP, com base na fração de partículas desejada para cultura celular em andaimes MAP. Pesar microgéis liofilizados para determinar a massa de microgéis.Em seguida, reconstitua os microgéis em 84% do volume MAP final do meio celular com base no MAP percentual de peso escolhido. Deixe os microgéis incharem por 20 minutos. Dissolva o ácido hialurônico, ou HA-tetrazina, e o meio celular em 16% do volume MAP final.Uma vez que as células tenham atingido a confluência desejada, levante e conte as células. Transfira 10.000 células por microlitro MAP para um novo tubo. Centrifugar as células e aspirar o sobrenadante do pellet sem aspirar as células.Adicione microgéis e reticulante ao pellet usando uma pipeta de deslocamento. Misture bem e semeie 10 microlitros por poço. Pipeta em movimento circular para distribuir uniformemente a mistura no poço.Deixe os microgéis recozidos a 37 graus Celsius por 25 minutos antes de adicionar meios celulares para encher os poços. Mantenha as culturas 3D a 37 graus Celsius e altere a mídia conforme necessário. Para evitar aspirar o andaime, estabilize a ponta da pipeta ao longo da crista do poço superior.Nos momentos desejados, fixe as amostras substituindo o meio por 50 microlitros de paraformaldeído a 4% por poço por 30 minutos à temperatura ambiente. Lave as amostras três vezes com 50 microlitros de PBS, ou tampão preferido, e prossiga para imunofluorescência ou coloração por fluorescência usando 50 microlitros por bem como o volume de trabalho. Dispositivos microfluídicos com uma região de foco de fluxo mostraram produzir microgéis HA-NB de 50 ou 100 mícrons de diâmetro.O meio de liofilização dos microgéis foi otimizado para minimizar a formação de criogel utilizando etanol a 70%. No entanto, outros meios, como álcool isopropílico, água e acetonitrila, podem ser usados de forma intercambiável para facilitar a formação de criogel. Para facilitar a interligação bio-ortogonal de microgéis HA-NB foi sintetizado um reticulante linear HA-tetrazina.A espectroscopia de RMN de prótons mostra uma modificação bem-sucedida de 11% das unidades de repetição de AH com um grupo pingente de tetrazina. O produto de microgel liofilizado seco foi reidratado com volumes especiais e recozido para obter diferentes formulações de porcentagem de peso de microgéis em andaimes MAP. Essas porcentagens ponderais de microgéis em andaimes MAP corresponderam a frações de partículas únicas.A cultura de células em andaimes MAP é mostrada aqui. As células em cultura 3D em andaimes MAP foram fixadas no quinto dia, coradas e fotografadas em microscópio confocal. Fatias Z únicas mostram diferenças no crescimento celular e andaimes compreendendo diferentes porcentagens de peso MAP.Selecione sua mídia de liofilização apropriadamente, dependendo se você deseja criogéis ou não. Não pule as etapas de incubação, para que seus microgéis tenham tempo suficiente para inchar no meio. Técnicas padrão, como microscopia, citometria de fluxo, sequenciamento de RNA e muito mais, podem ser usadas para avaliar as respostas celulares dentro desses materiais granulares com porosidades definidas.

controlling-particle-fraction-microporous-annealed-particle-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos dois processos para a microfabricação dos chips porosa de polímero para tridimensional cultivo celular. O primeiro é de estampagem a quente combinado com um processo de soldagem solvente vapor. A segunda usa um processo desenvolvido recentemente microthermoforming combinado com tecnologia de iões pista levando a uma significativa simplificação de fabricação.

Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Este artigo descreve uma variedade de configurações para semear células-tronco mesenquimais humanas em materiais, neste caso fios eletrofiados, que não cobrem a base das placas de poço de cultura padrão, a fim de maximizar e quantificar o número de células que inicialmente se ligam em comparação com a densidade de semeadura conhecida.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Os avanços nas tecnologias de biomateriais permitem o desenvolvimento de construções tridimensionais do tipo multicelular. Desenvolvemos protocolos de eletrofiação para produzir três andaimes individuais para cultivar as principais células estruturais das vias aéreas para fornecer um modelo 3D in vitro da parede bronquíola das vias aéreas.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Hastes de microgel com grupos reativos complementares são produzidas via microfluídica com a capacidade de se interligar em solução aquosa. Os microgéis anisométricos encravam e se interligam em construções estáveis com poros maiores em comparação com sistemas baseados em esféricos. Microgéis modificados com GRGDS-PC formam construções 3D macroporosas que podem ser usadas para cultura celular.

Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para sintetizar os blocos de construção de microgel para andaime de partículas de annealed microporoso, que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicamentos regenerativos.

Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados ​​para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Aprenda a controlar frações de partículas em andaimes MAP microporosos para engenharia de tecidos. Este método padroniza propriedades do material e respostas celulares em culturas 3D.

Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D

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