Name: Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco musculares e progenitores fibro-adipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. Este método permite estudar funções celulares em homeostase, regeneração e doenças.

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A triagem celular foi realizada no FACS Core Facility, Universidade de Aarhus, Dinamarca. As figuras foram criadas usando Biorender.com. Agradecemos ao Dr. J. Farup por compartilhar o anticorpo anti-PDGFRa do coelho. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção inicial da AUFF para E.P. e Start Package da NovoNordiskFonden para E.P. (0071113) e para A.D.M. (0071116).

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<li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li>
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<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes nem conflitos de interesse.

Várias etapas são fundamentais na execução deste protocolo para alcançar bons rendimentos. Os músculos individuais têm um volume pequeno em comparação com a quantidade de músculo utilizada em protocolos de isolamento em massa. Isso resulta em um risco de o músculo secar durante a dissecção, o que reduz o rendimento. Para evitar isso, é importante adicionar meio aos músculos imediatamente após a dissecção. Além disso, se a dissecção estiver demorando mais, a pele pode ser removida de um membro de cada vez para reduzir o t...

O músculo esquelético tem uma alta capacidade de regeneração devido à presença de células-tronco musculares (MuSCs). As MuSCs localizam-se nas miofibras, abaixo da lâmina basal, e residem em estado quiescente de saída prolongada e reversível do ciclo celular 1,2,3,4. Após a lesão, as MuSCs ativam-se e entram no ciclo celular para dar origem a progenitores amplificadores que podem se diferenciar e fundir-se para formar novas miofibras 2,5. Trabalhos anteriores mostraram que as CTms são absolutamente essenciais para a regeneração muscular 6,7,8. Além disso, uma única MuSC pode enxertar e gerar tanto novas células-tronco quanto novas miofibras9. O músculo esquelético também abriga uma população de células estromais mesenquimais denominadas progenitores fibroadipogênicos (PAFs), que desempenham papel crucial no suporte da função de MuSC durante a regeneração muscular 6,10,11,12.
Devido ao seu potencial para coordenar a regeneração muscular, tem havido um enorme interesse em entender como MuSCs e FAPs funcionam. MuSCs quiescentes são marcadas pela expressão dos fatores de transcrição Pax7 e Sprouty1 e do receptor de calcitonina da proteína de superfície celular, enquanto as FAPs quiescentes são marcadas pelo receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas da proteína de superfície celular (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Estudos prévios mostraram que MuSCs e FAPs poderiam ser purificados de músculos esqueléticos usando marcadores de superfície celular e classificação celular ativada por fluorescência (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Embora esses protocolos tenham avançado muito a capacidade de estudar MuSCs e FAPs, uma desvantagem é que a maioria desses protocolos requer o isolamento de MuSCs de um pool de diferentes tecidos musculares. Trabalhos recentes nossos e de outros têm revelado diferenças no fenótipo celular e nos níveis de expressão gênica entre MuSCs isolados de diferentestecidos22,23. As CPm do diafragma, tríceps e grácil apresentam ativação mais rápida do que as CPm dos músculos dos membros posterioresinferiores 22, enquanto as CP das MuSC do músculo extraocular apresentam diferenciação mais rápida do que as CP do diafragma e dos músculos dos membros posterioresinferiores 23.
Este protocolo descreve o isolamento de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais (Figura 1). Isso inclui a dissecção dos músculos diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL), gastrocnêmio (GA) e masseter. Os músculos dissecados são posteriormente dissociados por digestão enzimática utilizando colagenase II (protease que tem como alvo específico a sequência amino Pro-X-Gly-Pro no colágeno, possibilitando a degradação do tecido conjuntivo e dissociação tecidual24) e dispase (protease que cliva fibronectina e colágeno IV, possibilitando maior dissociação celular25). MuSCs e FAPs são isolados de suspensões de célula única por FACS. Como exemplos de ensaios a jusante para análise celular, a ativação de células-tronco é determinada pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), enquanto a pureza celular é determinada pela coloração por imunofluorescência para os marcadores específicos de tipo celular Pax7 e PDGFRa.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL (desempenho de PCR testado, PP, 30.000 xg, livre de DNA / DNase / RNase, baixa ligação ao DNA, estéril)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>72.706.700</td><td>Tubo de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL (PP / HD-PE, 20.000 xg, IVD / CE, IATA, DNA / DNase / RNase-free, Não citotóxico, livre de pirogênio, Estéril)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A / S</td><td>62.554.502</td><td>Tubo</td></tr> <tr><td>de 15 mLTubo de poliestireno de 5 mL com fundo redondo</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>Tubo FACS sem tampa de filtro</td></tr><tr><td>5 mL de poliestireno Tubo de fundo redondo com tampa de filtro de célula</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>352235</td><td>Tubo FACS com tampa do filtro</td></tr><tr><td>Tubo de 5 mL (PP, autoclavável não estéril)</td><td>Coleção VWR</td><td>525.0946</td><td>Tubo de 5 mL</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, não citotóxico, livre de pirogênio, Estéril)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>Tubo de 50 mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Lote Thermo</td><td>Fisher: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 burro-anti mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lote: 2420713 (Cat#A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, Instalação central Centrífuga da Universidade de Aarhus</td></tr><tr><td>5810</td><td>eppendorf EP022628188</td><td></td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de Proliferação de Células para Imagem, Alexa Fluor 488 corante</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lote: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>Kit de Proliferação</td></tr><tr><td>Celular Colágeno de pele de bezerro&nbsp;</td><td>Biorreagente, Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Fonte: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Worthington, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>Collagenase</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote: 2309415 (cat# 17105-041 )</td><td>Dispase</td></tr><tr><td>Soro de burro (não estéril)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Lote: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>Pinça reta com pontas finas</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>Pinça curva</td></tr><tr><td>Mistura de nutrientes F-10 (Presunto) (1x), +L-glutamina</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote. 2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp; &nbsp;</td><td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de mini-tubo cabeça a cabeça&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15534080 (Modelo nº 88861052)</td> <td>Rotador de mini-tubo cabeça sobre cabeça</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote. 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td><td>Banho de água agitador</td></tr><tr><td>MS2 mini-shaker&nbsp;</td><td>IKA&nbsp;</td><td></td><td>Unidade de vórtice</td></tr><tr><td>Agulha 20 G (0,9 mm x 25 mm)</td><td>BD microlance, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>304827</td><td>agulha 20G&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de formalina neutro 10%</td><td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>Lote: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células não pirogênicas (40 &micro; M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>Filtro de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 anticorpo primário</td><td>DSHB</td><td>Lote: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentrado em pó</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM. A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>Caneta/estreptococo</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote. 163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta p10</td><td>Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>Pontas de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras de filtro</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta p1000</td><td>Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>Ponteiras de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras de filtro</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta p20</td><td>Ponteiras artísticas, barreira autovedante, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>Pontas de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas, ponteiras</td></tr> de <tr><td>pipeta p200</td><td>Ponteiras artísticas, barreira auto-selante, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>Ponteiras de filtro de baixa retenção, pré-esterilizadas,</td></tr><tr><td>Almofada protetora</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp; 60 x 40cm, 8 camadas</td></tr><tr><td>Rainin, pipet-lite XLS</td><td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>Pipetas (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>RabMAb anti-PDGFR-alfa recombinante</td><td>, abcam</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi (eixo nº 3)</td><td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.502</td><td>Bisturi</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi nº 11</td><td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.0911</td><td>Bisturi</td></tr><tr><td>Scanlaf mars</td><td>Labogene</td><td>gabinete de classe 2: Bancada Mars</td><td>Flow</td></tr><tr><td>Microscópio ScanR</td><td>Olympus</td><td></td><td>, Instalação central Tesoura da Universidade de Aarhus</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Série 8000 DH</td><td>Thermo Scientific</td><td>3540-MAR</td><td>Incubadora</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica 10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Pipeta sorológica estéril e não pirogênica</td></tr><tr><td>5 mL</td><td>VWR, Avantor entregue pela VWR</td><td>612-3702</td><td>Seringa estéril, não pirogênica</td></tr><tr><td>5 mL, ponta Luer (6%), estéril&nbsp;</td><td>BD Emerald,</td><td>Seringa</td><td>de 307731</td> Fisher Scientific</tr><tr><td>TC Dish 100, padrão</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3902</td><td>Placa de Petri&nbsp;</td></tr><tr><td>Superfície tratada com cultura de tecidos (TC), poliestireno preto, fundo plano, estéril, tampa, pacote de 20</td><td>Corning, Sigma Aldrich</td><td>3764</td><td>Placa de fundo de meio poço de 96 poços</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Fonte: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de populações de células-tronco quiescentes de músculos esqueléticos individuais

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

O músculo esquelético abriga populações distintas de células-tronco adultas que contribuem para a homeostase e reparo do tecido. As células-tronco musculares esqueléticas (MuSCs) têm a capacidade de produzir novos músculos, enquanto os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) contribuem para os tecidos de suporte estromais e têm a capacidade de produzir fibroblastos e adipócitos. Tanto MuSCs quanto FAPs residem em um estado de saída prolongada e reversível do ciclo celular, chamado quiescência. O estado quiescente é fundamental para sua função. As células-tronco quiescentes são comumente purificadas a partir de múltiplos tecidos musculares agrupados em uma única amostra. No entanto, estudos recentes têm revelado diferenças distintas nos perfis moleculares e na profundidade de quiescência de MuSCs isolados de diferentes músculos. O presente protocolo descreve o isolamento e estudo de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais e apresenta estratégias para realizar análise molecular da ativação de células-tronco. Ele detalha como isolar e digerir músculos de diferentes origens de desenvolvimento, espessuras e funções, como diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), gastrocnêmio (GA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL) e músculos masseteres. MuSCs e FAPs são purificados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e analisados por coloração de imunofluorescência e ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).

Seguindo o protocolo de isolamento individual da musculatura esquelética (Figura 2), os músculos grácil, AT, EDL, GA, sóleo, tríceps, masseter e diafragma foram isolados de três camundongos machos suíços de raça outbre que haviam sido descontinuados de um programa de melhoramento local (Figura 2). Após dissociação tecidual e coloração de anticorpos, MuSCs e FAPs dos músculos individuais foram purificados por FACS (Figura 3). O gatin...

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Esse protocolo é significativo porque permite o estudo da função das células-tronco em diferentes músculos esqueléticos, aprofundando nossa compreensão de como elas contribuem para a homeostase, regeneração e progressão da doença. Usando esse protocolo, podemos isolar duas populações de células-tronco vivas de músculos específicos e estudar como elas funcionam. Para iniciar o isolamento muscular, borrife o camundongo eutanasiado com etanol e coloque-o com o abdômen voltado para cima.Usando tesoura, faça uma incisão horizontal de 0,5 centímetro de comprimento na pele abdominal. Usando ambas as mãos, puxe a pele para expor o tronco, bem como as extremidades inferiores até os membros posteriores. Localize o grácil ou o músculo interno da coxa e, usando um par de pinças curvas, agarre-o e levante levemente o músculo.Usando tesoura, faça uma incisão de 0,5 centímetro para cortar o músculo grácil. Repita o procedimento na outra perna. Com bisturi, corte a fáscia fazendo uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da face lateral da tíbia.Em seguida, agarre a fáscia com pinça curva e retire-a puxando-a, expondo os tendões na extremidade distal do membro posterior. Em seguida, insira uma pinça reta com pontas super finas entre o tendão distal do TA e o músculo EDL. Separe os músculos deslizando a pinça em direção à extremidade proximal dos músculos.Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Segure suavemente o tendão distal do TA com pinça curva e levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal. Para cortar cuidadosamente o tendão proximal, corte a outra extremidade o mais próximo possível de sua fixação e transfira o TA para uma placa de Petri.Em seguida, use a pinça reta com pontas super finas para passar por baixo do tendão distal do EDL e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar os músculos uns dos outros. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal sem danificar o músculo. Agarrando suavemente o tendão distal do EDL com pinça curva, levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal para cortar cuidadosamente o tendão proximal o mais próximo possível de sua fixação.Corte a outra extremidade e transfira o músculo EDL para uma placa de Petri. Repita o procedimento para o outro membro posterior. Use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tendão de Aquiles e os ossos dos membros posteriores inferiores.Deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo dos ossos. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Puxe o músculo gastrocnêmio ou GA para cima e sobre a fíbula.Localizar o tendão sóleo proximal. Insira a pinça reta entre os músculos sóleo e GA e mova a pinça em direção à extremidade distal dos músculos para separar o sóleo do GA. Agora corte o tendão do sóleo proximal. Segure-o com pinça curva e levante cuidadosamente o sous para acessar seu tendão distal.Cortar o tendão distal para isolar o sóleo do AG e colocá-lo na placa de Petri contendo o meio de lavagem. Em seguida, corte o GA e coloque-o na placa de Petri. Para isolar o músculo tríceps, use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tríceps e o osso úmero e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo do osso.Em seguida, corte a extremidade distal do músculo tríceps e, com pinça curva, puxe-o para cima e sobre o cotovelo para acessar o tendão proximal. Corte o tendão proximal do tríceps e transfira o músculo para uma placa de Petri. Repita o procedimento para os outros quatro membros.Para remover o pelo e a pele da mandíbula, use uma tesoura para fazer uma incisão de 0,5 centímetro abaixo do olho, cortando no sentido caudal. Em seguida, usando os polegares e os dedos indicadores de ambas as mãos, aperte em cada lado da incisão e remova a pele puxando-a para cima e para baixo. Localize o tendão maior do masseter no lado caudal abaixo do olho e insira a lâmina plana de bisturi entre o osso e o músculo para cortar o tendão.Pegue o tendão masseter maior com pinça curva e corte-o com uma lâmina de bisturi ou tesoura na direção rostral para separar o músculo masseter do osso maxilar. Coloque o músculo masseter isolado na placa de Petri e repita o procedimento para o segundo músculo masseter. Use uma tesoura para fazer uma toracotomia no meio do esterno e cortar o esterno.Expor o diafragma cortando 360 graus através da caixa torácica. Em seguida, para separar a parte superior do corpo do abdômen, use uma tesoura para cortar a traqueia, esôfago, veia cava e aorta abdominal. Em seguida, usando tesoura, pré-forme uma laparotomia um centímetro abaixo do esterno e faça um corte em torno de 360 graus.Coloque a tesoura fechada entre a caixa torácica e os órgãos abdominais e pressione para baixo. Puxe suavemente a caixa torácica para separá-la dos órgãos abdominais. Para separar o diafragma da caixa torácica, segure o diafragma entre dois dedos e corte a caixa torácica com uma tesoura.Corte o diafragma o mais próximo possível das costelas em torno de 360 graus e coloque o diafragma isolado em uma placa de Petri. Pique os músculos isolados, um a um, cortando-os em pedaços de aproximadamente um milímetro. Transfira os músculos picados para um tubo cônico de 15 litros contendo cinco litros de tampão de dissociação e incube o tubo a 37 graus Celsius por 35 minutos em banho de água agitada a uma velocidade de 60 rotações por minuto.Após a digestão enzimática dos músculos picados, transfira a suspensão do tubo de 15 mililitros para um tubo de 50 mililitros. Usando uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 20, ressuspenda a amostra puxando-a para cima e para baixo através da agulha cinco vezes. Desenhe a suspensão celular para dentro da seringa e coe a amostra em um novo tubo cônico de 50 mililitros equipado com um filtro de células na parte superior.Para recuperar todas as células mononucleadas, lave o tubo cônico vazio com 20 mililitros de meio de lavagem e despeje-o através do filtro para combinar com a amostra coada. Recupere o volume restante sob o filtro de células com uma pipeta P1000. Após a dissociação tecidual e a coloração de anticorpos, as células-tronco musculares esqueléticas ou MuSCs e progenitores fibroadipogênicos ou FAPs de músculos individuais foram purificados por classificação de células ativadas por fluorescência.Após o fechamento inicial para identificar as células e separar os singlets dos duplos, portões subsequentes foram ajustados usando controles FMO para identificar os limiares de coloração. A amostra corada foi fechada e a população CD31 negativa e CD45 negativa positiva para SCA1 correspondente às FAPs foi classificada em um tubo de coleta separado. A população dupla negativa foi ainda fechada para classificar a população positiva para VCA correspondente aos MuSCs.As suspensões unicelulares do diafragma e do músculo tríceps, ao contrário das demais, apresentaram maior abundância relativa de MuSCs do que as FAPs. A coloração de EDU, embora robusta, indicou uma diferença nas frações de células positivas para EDU para os dois tipos de células-tronco e entre os diferentes músculos. Para todos os tecidos, no entanto, a fração média de MuSCs EDU positivas foi maior do que a de FAPs EDU positivos.MuSCs isolados de EDL e GA apresentaram incorporação de EDU significativamente menor em comparação com aqueles de AT, diafragma, grácil ou tríceps. Da mesma forma, variação significativa na incorporação de EDU também foi observada em FAPs isolados de diferentes músculos. Finalmente, a pureza celular foi confirmada com a coloração por imunofluorescência, indicando a especificidade do protocolo de isolamento de células-tronco.A etapa mais crítica é a digestão mecânica do tecido. Quando o tecido é cortado demais, a viabilidade diminui. Quando o tecido é cortado muito pouco, o EEL diminui.O protocolo pode ser combinado com ensaios que medem o comportamento celular, como enxertia após transplante para entender melhor as funções das células-tronco in vivo. Esta técnica pode responder se as diferenças no comportamento das células-tronco dentro dos músculos individuais podem contribuir para fenótipos de doenças e doenças caracterizadas por padrões únicos de músculos afetados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão...

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo.  os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

Neste protocolo é descrito um método de cultivo in vitro e análise funcional para células-tronco musculares, que preserva a maioria de suas interações com seu nicho endógeno.

Ensaio de cultura de myofibra única para a avaliação da funcionalidade de células-tronco musculares adultas Ex Vivo

O músculo esquelético compreende vários tipos celulares, incluindo células-tronco residentes, cada uma com uma contribuição especial para a homeostase e regeneração muscular. Aqui, a cultura 2D de células-tronco musculares e o nicho de células musculares em um ambiente ex vivo que preserva muitas das características fisiológicas, in vivo e ambientais são descritas.

Cultura não fracionada em massa de músculo esquelético de camundongo para recapitular nicho e quiescência de células-tronco

Esse protocolo fornece um método padronizado para isolar e enriquecer mioblastos primários do músculo esquelético de camundongos adultos e neonatos por meio de dissociação tecidual, filtração sequencial, pré-placagem e condições definidas de cultura, possibilitando o estabelecimento e manutenção de culturas de mioblastas derivadas de células satélite para aplicações experimentais posteriores.

Isolamento de Células Satélites do Músculo Esquelético para Estudos de Miogênese In Vitro

Aprenda a isolar células-tronco musculares e progenitores fibro-adipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. Este método permite estudar funções celulares em homeostase, regeneração e doenças.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

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