Name: Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda um método de eletroporação para transformar Rickettsia parkeri com vetores de expressão de proteínas fluorescentes em culturas de células de carrapatos. Esta técnica permite estudar a função gênica em bactérias intracelulares obrigatórias.

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Agradecemos a Timothy J. Kurtti e Benjamin Cull por suas discussões e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado financeiramente por uma doação para a U.G.M. do NIH (2R01AI049424) e uma subvenção para a U.G.M. da Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).

1. Propagação e purificação de R. parkeri a partir de cultura de células de carrapatos
NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células devem ser realizados em um gabinete de biossegurança de classe II.
<ol><li>Preparando R. parkeri-células de carrapatos infectadas<ol><li>Cultivar células ISE6 em frascos de cultura celular de25 cm 2 a 34 °C em 5 mL de L15C300 em meio17, suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), caldo de fosfato de triptose a 5% (TPB) e concentrado de lipoproteína a 0,1% (LPC). NOTA: O ISE6 (linhagem celular derivada de embriões de Ixodes scapularis) é uma linhagem celular de carrapatos amplamente utilizada em muitos laboratórios e é, portanto, um modelo essencial para estudar as interações carrapato-patógeno17,18,19. A taxa de crescimento das células ISE6 é mais lenta do que a das células de mamíferos, com um tempo de duplicação populacional de ≥72 h. Por exemplo, as células ISE6 subcultivadas a partir de uma cultura 100% confluente a uma proporção de 1:5 levarão 3-4 semanas para recuperar 100% de confluência. As células ISE6 saudáveis serão geralmente arredondadas com numerosos filamentos aderentes17.</li>
		<li>Conte as células ISE6 com um hemocitômetro sob um microscópio de luz. Use em uma concentração de ~106 células/mL (100% confluente).<ol><li>Enxaguar suavemente as células do balão com meio e dispersar as células por pipetagem para gerar uma suspensão celular homogénea. Adicione 20 μL de suspensão celular entre o hemocitômetro e cubra o vidro para contar as células usando um hemocitômetro.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicionar R. parkeri 20 do tipo selvagem livre de células hospedeiras (número médio: 5 × 10 7-10 × 107) às culturas de células ISE6 em frascos de cultura celular de 25 cm 2. Incubar culturas de células de R. parkeri infectadas a 34 °C em 5 mL de meio completo consistindo de meio L15C300, FBS a 10%, TPB a 5%, LPC a 0,1%, bicarbonato de sódio a 0,25% (NaHCO3) e HEPES a 25 mM até que 90%-100% das células estejam infectadas. NOTA: A taxa de infecção de R. parkeri em células ISE6 é determinada pela coloração de Giemsa, e o tempo de incubação para atingir 90%-100% de infecção varia de 5 dias a 7 dias em média.</li>
		<li>Determine a taxa de infecção através da coloração de Giemsa.<ol><li>No gabinete de biossegurança, ressuspeite as culturas de células infectadas e transfira 50 μL da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
			<li>Diluir a suspensão com meio completo (diluição 1:5) e centrifugar 100 μL em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para manter o R. parkeri vivo contido, use uma centrífuga com um rotor selado projetado para ser removido da centrífuga. Isso permite o transporte do rotor selado para dentro e para fora do capô. NOTA: Como os R. parkeri ainda estão vivos antes da centrifugação, a amostra precisa ser contida até que a rickettsia seja morta. Assim, a centrífuga usada para girar a cultura de R. parkeri na lâmina deve ter um rotor selado que é projetado para ser levantado da centrífuga. Com o rotor no exaustor de fluxo laminar, carregue as amostras no conjunto de corrediças do funil-microscópio, sele novamente o rotor e coloque o rotor selado de volta na centrífuga. Em seguida, ligue a centrífuga e as amostras serão depositadas nas lâminas do microscópio. Após o término da corrida, remova o rotor selado da centrífuga e coloque-o no exaustor de fluxo laminar. Lá, abra a tampa do rotor e descarregue o conjunto de lâminas funil-microscópio dentro do capô. Uma vez seco, mergulhe as lâminas do microscópio de vidro em metanol absoluto, que mata todos os patógenos. Os funis e os portadores de metal são submersos em DMQ diluído, o que mata R. parkeri.</li>
			<li>Seque as lâminas ao ar livre e fixe em metanol absoluto por 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
			<li>Manchar as lâminas com a coloração de Giemsa (4% em tampão de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C e enxaguar com água durante 5 s.</li>
			<li>Determinar a percentagem de infeção (número de células infetadas com rickettsiae/100 células) por microscopia de luz. NOTA: A Figura 1 mostra os resultados típicos da coloração de Giemsa.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de R. parkeri sem células NOTA: Quando 90%-100% das células da cultura estão infectadas, as rickettsias devem ser isoladas das células ISE6 e a eletroporação deve ser realizada.<ol><li>Adicione grão de carboneto de silício estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL a um volume de aproximadamente 0,2 mL.</li>
		<li>Remover 2 mL de meio de culturas 100% infectadas por R. parkeri (etapa 1.1.3) e ressuspender as células nos 3 mL restantes de meio.</li>
		<li>Transferir porções iguais desta suspensão para tubos preparados na fase 1.2.1.</li>
		<li>Vórtice cada tubo em alta velocidade por 30 s e, em seguida, coloque os tubos no gelo. Deixe a areia assentar em segundos pela gravidade.</li>
		<li>Em um armário de biossegurança de classe II, tenha uma seringa estéril de 5 mL Luer-lock pronta com o êmbolo estendido e a extremidade do êmbolo presa em uma base de poliestireno para tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Usando uma ponta de pipeta de barreira estéril de 1 mL montada em um pipetador adequado, remova o sobrenadante do lisado de células vórtices do tubo, tomando cuidado para não aspirar nenhum grão. Insira a ponta do pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo na seringa com uma pressão suave. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.</li>
		<li>Fixar um filtro esterilizado de 2 μm de tamanho de poro no cubo da seringa e filtrar a cultura de R. parkeri da etapa 1.2.6 em tubos estéreis de 1,5 ml.</li>
		<li>Recolher o R. parkeri por centrifugação a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuscite o pellet em 1,2 mL de sacarose gelada de 300 mM e centrifugar novamente a 13.600 × g a 4 °C por 5 min. Repetir a ressuspensão e a centrifugação para um total de duas lavagens com sacarose.</li>
		<li>Combinar os pellets de R. parkeri em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril, refrigerado, em 50 μL de sacarose gelada de 300 mM por transformação. Como um frasco de 25 cm2 de R. parkeri fornece rickettsias suficientes para duas a três transformações, adicione 100-150 μL de sacarose fria de 300 mM. NOTA: Se desejado, o número de rickettsiae pode ser calculado usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser. Ao usar uma inoculação inicial de 5 × 10 7 -10 × 10 7 R. parkeri livre de células, levará em média 5-7 dias para atingir 90%-100% de infecção, produzindo aproximadamente 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri livre de células.</li>
		<li>Ressuspeite suavemente o pellet por pipetagem até que esteja completamente disperso. Divida a amostra em porções de 50 μL em tubos microcentrífugos estéreis e estéreis e refrigerados. NOTA: Se desejado, a viabilidade da rickettsia pode ser avaliada por citometria de fluxo após coloração com corante fluorescente 21.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transformação de R. parkeri com o plasmídeo pRAM18dSFA
<ol><li>No gelo, adicionar 3 μg de DNA plasmídico pRAM18dSFA 13,15,20 livre de endotoxinas a cada tubo contendo 50 μL de suspensão de R. parkeri e agitar a mistura com a ponta do pipeta suave mas completamente. NOTA: Ao preparar o DNA plasmídico, use um kit de purificação que inclua uma etapa de remoção de endotoxinas para produzir DNA plasmidial livre de endotoxinas23. Descobrimos que uma gama de concentrações de plasmídeos entre 1 μg e 3 μg por 50 μL de suspensão de R. parkeri resultou em transformações bem-sucedidas, enquanto o aumento da quantidade de plasmídeo para 10 μg inibiu a transformação.</li>
	<li>Transfira a mistura acima de DNA e R. parkeri para uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm refrigerada e estéril (bata suavemente na cubeta até que a mistura seja distribuída uniformemente) e deixe-a descansar no gelo por 10-30 min.</li>
	<li>Remover o meio de uma cultura 100% confluente de células ISE6 e ressuspender as camadas celulares em 1,5 mL de meio fresco com NaHCO 3 e tampão HEPES (descrito acima na etapa 1.1.3). Utilizar um balão de células confluentes por transformação.</li>
	<li>Transferir as células ressuspensas para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (um tubo por balão de25 cm 2 de células ISE6).</li>
	<li>Eletroporate a mistura de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohms, 25 μF usando um eletroporador.</li>
	<li>Usando um pipeto de transferência de ponta fina estéril e estendido, transfira uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 (etapa 2.4) para a cubeta e puxe suavemente o líquido para cima e para baixo para lavar a cubeta. Transfira a mistura para o tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo o restante da suspensão de células ISE6 e misture suavemente a mistura de transformação com as células.</li>
	<li>Centrifugar as amostras transformadas a 700 × g por 2 min no RT e, em seguida, aumentar a velocidade de centrifugação para 13.600 × g por mais 1 min no RT. NOTA: As duas velocidades de centrifugação promovem a ligação rickettsial e a entrada nas células: 700 × g são usados para puxar as células ISE6, enquanto 13.600 × g são usados para puxar as rickettsias para baixo.</li>
	<li>Deixar as amostras a RT ou a 34 °C durante 15 min a 1 h.</li>
	<li>Ressuspender os transformadores (dois ou três) em células ISE6 com uma ponta de pipeta de barreira estéril de 2 mL ajustada a um pipetador e transferir para dois ou três frascos de cultura celular de25 cm 2 contendo 3,5 mL de meio fresco com NaHCO3 e tampão HEPES. Alternativamente, use uma pipeta Pasteur estéril de barreira de 2 mL operada com um bulbo de borracha.</li>
	<li>Agitar os balões para espalhar uniformemente a mistura e, em seguida, incubar a 34 °C.</li>
	<li>Após 16-24 h, adicionar 10 μL de espectinomicina (50 mg/mL) e 10 μL de estreptomicina (50 mg/mL) a cada balão na etapa 2.10.</li>
</ol>3. Observação do R. parkeri transformado
NOTA: Utilizar um microscópio de epifluorescência com filtros de rodamina/TRITC para observar os frascos preparados no passo 2.11 após 3-7 dias. Uma vez que as placas são evidentes nas culturas (5-14 dias), pode-se observar R. parkeri transformado que expressa a proteína fluorescente vermelha mKATE, codificada no plasmídeo pRAM18dSFA.
<ol><li>Microscopia confocal<ol><li>Ressuspender as culturas celulares a partir dos frascos de passo 2.11 e misturar 100 μL destas culturas celulares com 5 μL de solução Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT no escuro. NOTA: A Hoechst 33342 é uma contramancha nuclear permeável a células que se liga ao ADN celular vivo e emite fluorescência azul.</li>
		<li>Centrifugar 50 μL da mistura em lâminas de microscópio de vidro utilizando uma centrífuga a 5 × g durante 3 min.</li>
		<li>Adicione 3 μL de PBS 1x ao ponto de células depositadas na lâmina, sobreponha com uma folha de cobertura e veja com um microscópio confocal (objetiva de 60x). Utilizar os seguintes parâmetros de excitação e emissão para imagens fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitação a 350 nm, emissão a 470 nm; para a tetrametilrodamina (TRITC), excitação a 557 nm, emissão a 576 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li>
</ol>

Não são declarados conflitos de interesses.

Aqui, demonstramos um método para introduzir DNA exógeno codificado no plasmídeo pRAM18dSFA em rickettsias usando eletroporação. Neste procedimento, as rickettsias livres de células foram purificadas a partir de células hospedeiras, transformadas com um vetor de transporte de rickettsias e liberadas em células de carrapatos para infecção. Também é descrito um procedimento de imunofluorescência confocal para detectar R. parkeri que expressa proteína de fluorescência vermelha em células de carrapatos. Métodos seme...

Rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias que pertencem ao gênero Rickettsia (família Rickettsiaceae, ordem Rickettsiales). O gênero Rickettsia é classificado em quatro grupos principais com base em características filogenéticas1,2: o grupo da febre maculosa (SFG), que contém as rickettsias que causam as rickettsioses transmitidas por carrapatos mais graves e fatais (por exemplo, Rickettsia rickettsii, o agente causador da febre maculosa das Montanhas Rochosas), o grupo do tifo (TG, por exemplo, Rickettsia prowazekii, o agente do tifo epidêmico), o grupo de transição (TRG, por exemplo, Rickettsia felis, o agente causador da febre maculosa transmitida por pulgas) e o grupo ancestral (AG, por exemplo, Rickettsia bellii). 
Entre as mais antigas doenças transmitidas por vetores conhecidas, as rickettsioses são adquiridas principalmente após a transmissão dos patógenos através das picadas de vetores artrópodes infectados, incluindo carrapatos, pulgas, piolhos e ácaros 3,4. Embora a descoberta de antibióticos eficazes tenha melhorado os resultados do tratamento, as rickettsioses epidêmicas emergentes e reemergentes continuam a desafiar as estratégias tradicionais de prevenção e controle. Assim, uma compreensão abrangente das interações rickettsia / hospedeiro / vetor acabaria por estabelecer uma base sólida para o desenvolvimento de novas abordagens para prevenir e curar essas doenças antigas.
Na natureza, a transferência horizontal de genes (HGT) em bactérias ocorre por meio de conjugação, transdução e transformação5. A transformação bacteriana in vitro utiliza esses conceitos de HGT, embora a natureza intracelular das rickettsias apresente alguns desafios. As condições restritas de crescimento e os sistemas de conjugação e transdução pouco compreendidos em diferentes espécies de rickettsiae têm impedido a aplicação de métodos de conjugação e transdução em rickettsiae 6,7,8. Comparado com outros gêneros bacterianos intracelulares obrigatórios (por exemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma e Ehrlichia), o gênero Rickettsia difere no que diz respeito às estratégias de crescimento e replicação dentro do citoplasma celular, o que impõe desafios específicos à modificação genética das rickettsias devido às suas características únicas de estilo de vida9.
O obstáculo inicial a ser superado ao tentar a modificação genética das rickettsias é alcançar uma transformação bem-sucedida. Assim, projetar uma abordagem viável com alta eficiência de transformação seria extremamente valioso para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para rickettsias. Aqui, nos concentramos na eletroporação, um método de transformação amplamente reconhecido que tem sido usado para introduzir DNA exógeno com sucesso em várias espécies de rickettsiae, incluindo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii e Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa de R. parkeri Tate's Hell (acesso: GCA_000965145.1) com o vetor shuttle pRAM18dSFA derivado do plasmídeo AaR/SC pRAM18 da cepa Rickettsia amblyommatis projetado para codificar mKATE, uma proteína fluorescente de vermelho distante, e aadA, conferindo resistência à espectromicina e estreptomicina13,15,20. R. parkeri transformados são viáveis e mantidos de forma estável sob seleção de antibióticos em linhagens celulares de carrapatos. Além disso, mostramos que a localização de R. parkeri transformado em células vivas de carrapatos via microscopia confocal pode ser usada para avaliar a qualidade das taxas de transformação em linhagens celulares vetoriais.

<table><tbody><tr><td>Cubeta de eletroporação de pulsador de genes de 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; M Filtro de tamanho de poro&nbsp;</td>Seringa Luer-lock de 5 mL Whatman <td>6783-2520</td><td></td> <td>da GE Healthcare Life</td></tr><tr><td>Sciences&nbsp;</td><td>Grão</td><td></td> de carboneto de silício BD 309646 <td></td></tr><tr><td>60-90</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>Metanol absoluto&nbsp;</td>Caldo de fosfato de triptose <td>Bacto A457-4</td><td></td> <td>da Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Centrífuga Cytospin BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>O rotor é destacável para que todo o rotor possa ser colocado no capô para carregar amostras infecciosas</td></tr><tr><td>Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td> usado para obter pipeta de transferência de ponta fina estendida <td>de plasmídeo pRAM18dSFA livre de endotoxinas</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>O lote FBS deve ser testado para garantir que as células ISE6 cresçam bem nele.</td></tr><tr><td>Eletroporador Gene Pulser II com Controlador de Pulso PLUS</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105 & 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>edição de imagem bruta</td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa coloração&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr> Concentrado de lipoproteína <tr><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td><td>médio L-15 da Leibovitz</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Microscópio <td></td> de epifluorescência Nikon Diaphot <td>da</td> MP Biomedicals 191476 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Reagente NucBlue Live ReadyProbes&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) microscópio confocal&nbsp;</td><td>Câmara</td> de Contagem Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser</td><td>Hausser Scientific</td><td>&nbsp; Câmara 3900</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de eletroporação para transformar rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

As rickettsioses são causadas por uma ampla gama de bactérias intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Rickettsia que podem ser transmitidas aos hospedeiros vertebrados através da picada de vetores artrópodes infectados. Até o momento, as rickettsioses epidêmicas emergentes ou reemergentes continuam sendo um risco para a saúde pública devido à dificuldade no diagnóstico, pois os métodos diagnósticos são limitados e não padronizados ou universalmente acessíveis. O diagnóstico errôneo resultante da falta de reconhecimento dos sinais e sintomas pode resultar em atraso no tratamento com antibióticos e maus resultados de saúde. Uma compreensão abrangente das características da Rickettsia acabaria por melhorar o diagnóstico clínico, a avaliação e o tratamento com melhor controle e prevenção da doença. 
Estudos funcionais de genes rickettsianos são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese. Este trabalho descreve um procedimento para a eletroporação da cepa Tate's Hell de Rickettsia parkeri com o vetor shuttle pRAM18dSFA e a seleção de R. parkeri transformado em cultura de células de carrapatos com antibióticos (espectromicina e estreptomicina). Um método também é descrito para a localização de R. parkeri transformado em células de carrapatos usando microscopia de imunofluorescência confocal, uma técnica útil para verificar a transformação em linhagens celulares vetoriais. Abordagens semelhantes também são adequadas para a transformação de outras rickettsiae.

A morfologia de R. parkeri em células ISE6 sob microscópio de luz após coloração de Giemsa é mostrada na Figura 1. Na Figura 2, R. parkeri transformada expressando proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 é mostrada usando microscopia confocal. Há um aumento substancial na taxa de infecção de R. parkeri transformado (vermelho) em células ISE6 (azul, corresponde aos núcleos) do (A) dia 7 para (B</stron...

A eletroporação é um método rápido e amplamente adotado para a introdução de DNA exógeno no gênero Rickettsia. Este protocolo fornece um método de eletroporação útil para a transformação de bactérias intracelulares obrigatórias no gênero Rickettsia.

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Estudos funcionais dos genes Rickettsia são cruciais para a compreensão de seu papel na patogênese, por isso precisamos de métodos confiáveis de alteração dos genes de forma controlada. Nosso protocolo usa eletroporação para introduzir DNA exógeno em bactérias intracelulares obrigatórias do gênero Rickettsia, permitindo-nos estudar os efeitos do DNA introduzido. Demonstrando o procedimento junto comigo hoje estará Lisa Price, pesquisadora do Dr. Munderloh e do laboratório do Dr. Kurtti.Para começar, prepare uma cultura de células ISE6 infectada por 90 a 100% Rickettsia parkeri, conforme descrito no texto. Em seguida, para determinar a taxa de infecção pela coloração de Giemsa, diluir a suspensão celular para uma proporção de 1:5 com meio completo e depositar 100 microlitros da suspensão celular em uma lâmina de microscópio de vidro por centrifugação a 113 G por cinco minutos. Depois de deixar a lâmina secar ao ar, fixe-a em metanol absoluto por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, incube a lâmina e a mancha de Giemsa por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave a lâmina em água e, uma vez seca, visualize-a sob um microscópio de luz com objetivas de óleo. Determine a porcentagem de células infectadas contando as células infectadas e não infectadas.Para preparar o Rickettsia parkeri livre de células, despeje cerca de 0,2 mililitros de grão de carboneto de silício estéril de 60 a 90 em dois tubos de microcentrífuga estéreis de dois mililitros e deixe os tubos de lado. De um frasco previamente inoculado de Rickettsia parkeri infectado contendo cinco mililitros de meio, remova dois mililitros do meio, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Em seguida, ressuspenda as células com os três mililitros restantes do meio.Divida esta suspensão igualmente entre os dois tubos de grão de carboneto de silicone preparados e vortex o tubo em alta velocidade por 30 segundos. Em seguida, coloque-os no gelo. Em seguida, prepare uma seringa estéril de cinco mililitros luer lock, estendendo o êmbolo e insira a extremidade do êmbolo em uma base de poliestireno usada para segurar tubos cônicos de 15 mililitros.Usando uma pipeta Pasteur de barreira de dois mililitros operada com um bulbo de borracha, remova cuidadosamente o sobrenadante das células do vórtice sem aspirar qualquer grão. Em seguida, insira a ponta da pipeta na abertura do cubo da seringa e ejete o conteúdo para a seringa com uma pressão suave. Em seguida, filtre a cultura de Rickettsia parkeri em tubos estéreis de 1,5 mililitro através de um filtro estéril de tamanho de poro de dois micrômetros instalado no cubo da seringa e centrifugar os tubos a 13.600 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Depois de remover o sobrenadante, lave o pellet de célula duas vezes com 1,2 mililitros de solução de sacarose gelada de 300 milimolares. Centrifugar a amostra e remover o sobrenadante entre as lavagens. No final da centrifugação, ressuspender o pellet de células agrupadas com 100 a 150 microlitros de solução de sacarose gelada para duas a três amostras de transformação, respectivamente.Em seguida, divida a amostra em alíquotas de 50 microlitros em tubos de microcentrífuga pré-refrigerados, estéreis e de 1,5 microlitro. Para transformação em três microgramas de DNA plasmidial pRAM18sSFA livre de endotoxinas para cada tubo contendo 50 microlitros de Rickettsia parkeri no gelo e mexa suavemente com uma ponta de pipeta. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação estéril pré-resfriada com um tamanho de folga de 0,1 centímetro.Bata suavemente na cubeta para distribuir a mistura uniformemente e incube no gelo por 10 a 30 minutos. Entretanto, retire o meio de um balão de cultura celular ISE6 previamente cultivado e ressuspenda a camada celular enxaguando suavemente as células com 1,5 mililitros de meio fresco contendo bicarbonato de sódio e tampão HEPES. Depois de gerar uma suspensão celular homogênea, transfira todo o volume para um único tubo de microcentrífuga estéril de dois mililitros.Em seguida, eletroporate a mistura de Rickettsia parkeri e DNA plasmídico usando um eletroporador. Após a eletroporação, use uma pipeta de ponta fina estendida estéril para transferir uma pequena quantidade da suspensão de células ISE6 para a cubeta e pipetar suavemente para cima e para baixo para recuperar a Rickettsia parkeri eletroporada. Em seguida, transfira o conteúdo da cubeta para o tubo de dois mililitros contendo o restante da suspensão celular ISE6.Em seguida, centrifugar a amostra à temperatura ambiente, primeiro a 700 G por dois minutos para puxar as células ISE6 e, em seguida, a 13.600 G por um minuto para puxar a Rickettsia. Incubar o tubo a 34 graus Celsius por 15 minutos a uma hora. Após incubação, transferir o conteúdo ressuspenso de uma transformação para um balão de cultura celular de 25 centímetros quadrados contendo 3,5 mililitros de meio fresco com bicarbonato de sódio e tampão HEPES.Agite o balão para espalhar a mistura uniformemente e incubar a 34 graus Celsius. Após 16 a 24 horas, adicionar 10 microlitros cada de espectinomicina e estreptomicina ao balão incubado. Agite o balão para misturar os antibióticos uniformemente no meio antes de devolver o balão à incubadora.A propagação bem-sucedida de células selvagens de Rickettsia parkeri e ISE6 foi evidente pela coloração de Giemsa. Os núcleos das células ISE6 corados de roxo escuro com Giemsa no Rickettsi intracelular e extracelular são visíveis. A transformação de Rickettsia parkeri expressando a proteína de fluorescência vermelha em células ISE6 foi confirmada por microscopia confocal após sete dias de incubação.Um aumento substancial na taxa de infecção foi observado após 10 dias. Mantenha tudo estéril durante todo o procedimento. Preste atenção aos detalhes e seja paciente, pois algumas espécies de Rickettsia levam muito tempo para se transformar, especialmente os endossimbiontes de crescimento lento.Este protocolo permitiu o estudo de múltiplos aspectos da biologia de Rickettsia e suas interações com seus vetores artrópodes e hospedeiros mamíferos. Por exemplo, Rickettsi fluorescente que expressa proteínas tem sido usado para rastrear a motilidade e as interações simbiontes das células do carrapato.

an-electroporation-method-to-transform-rickettsia-spp-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Fonte: Aigrain, L., et al. Internalização e Observação de Biomoléculas Fluorescentes em Microrganismos Vivos por Eletroporação.  J. Vis. Exp. (2015)O vídeo demonstra a entrega de biomoléculas fluorescentes em células microbianas eletrocompetentes usando eletroporação. O processo começa com a introdução de DNA ou proteínas marcados com fluoróforos em uma suspensão celular resfriada. Um pulso de alta voltagem é então aplicado para criar poros temporários de membrana, permitindo a entrada da...

Entrega por eletroporação de biomoléculas fluorescentes em células bacterianas

Este vídeo demonstra a técnica de eletroporação que introduz o DNA do plasmídeo codificador de proteínas fluorescentes em precursores de células granulares cerebelares primárias de camundongos.

Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

Neste vídeo, descrevemos a nucleofecção, um procedimento de transfecção baseado em eletroporação para fornecer DNA de plasmídeo codificador de proteína repórter fluorescente na forma de esporozoíto do parasita Eimeria de galinha.

Nucleofecção de formas de parasitas: um método de transfecção baseado em eletroporação para entregar plasmídeos codificadores de proteínas fluorescentes no núcleo do esporozoíto

Neste vídeo, demonstramos a introdução de proteínas efetoras bacterianas em células de mamíferos por eletroporação. A localização intracelular das proteínas efetoras bacterianas é detectada por microscopia confocal após coloração com anticorpos conjugados com fluoróforo específicos.

Introdução de proteínas efetoras bacterianas em células de mamíferos por eletroporação

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

A eletroporação foi usada para inserir proteínas efetoras de virulência bacteriana purificadas diretamente em células eucarióticas vivas. A localização das proteínas foi monitorada por microscopia de imunofluorescência confocal. Este método permite estudos sobre tráfego, função e interações proteína-proteína usando proteínas exógenas ativas, evitando a necessidade de expressão heteróloga em células eucarióticas.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

A translocação efetora para as células hospedeiras por meio de um sistema de secreção tipo III é uma estratégia de virulência comum entre bactérias gram-negativas. Um ensaio baseado em fusão efetora beta-lactamase para análise quantitativa da translocação foi aplicado. Em células infectadas por Yersinia, a conversão de um repórter FRET pela beta-lactamase é monitorada usando microscopia de varredura a laser.

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

O presente protocolo descreve um método de injeção de embriões de carrapatos. A injeção embrionária é a técnica preferida para manipulação genética para gerar linhas transgênicas.

Técnica de injeção de embriões para edição de genes no carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

Aprenda um método de eletroporação para transformar Rickettsia parkeri com vetores de expressão de proteínas fluorescentes em culturas de células de carrapatos. Esta técnica permite estudar a função gênica em bactérias intracelulares obrigatórias.

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos (Vídeo) | JoVE Journal

Um método de eletroporação para transformar Rickettsia spp. com um vetor shuttle fluorescente de expressão de proteínas em linhagens celulares de carrapatos

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