Name: Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a gerar esferoides tumorais 3D a partir de células cancerígenas primárias para avaliar a sensibilidade a terapias anticâncer. Este método reproduz melhor a biologia tumoral real e permite personalizar tratamentos para pacientes com tumores sólidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A coleta de amostras de tumores humanos utilizadas para as culturas de células tumorais primárias foi realizada de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) no Rabin Medical Center, com consentimento informado por escrito dos pacientes. Os pacientes elegíveis para participação no estudo incluíram pacientes com câncer adulto e pediátrico, de ambos os sexos, com câncer de mama, cólon, fígado, pulmão, neuroendócrino, ovário ou pâncreas não metastático, qualquer câncer pediátrico ou qualquer câncer metastático. O único critério de exclusão foi a falta de capacidade para fornecer o consentimento informado.
1. Geração e coleta de esferoides
NOTA: O isolamento de células tumorais primárias pode ser realizado conforme descrito por Kodak et al.8. É importante ressaltar que as células tumorais primárias usadas para gerar os esferoides podem ser derivadas diretamente de amostras de pacientes obtidas por biópsia, ressecção, etc., ou indiretamente usando amostras tumorais de modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX), como descrito por Moskovits et al.9.
<ol><li>Preparar uma suspensão de célula única de culturas de células tumorais primárias aderentes de 75%-100% de confluência tomando um pequeno frasco (T25) com uma cultura de células primárias aderente de célula única, removendo o meio de cultura celular, lavando com PBS e, em seguida, adicionando 1 mL de 1x Accutase (uma solução de descolamento celular) (ver Tabela de Materiais) por 3 min a 37 °C.</li>
	<li>Neutralizar a solução de Accutase adicionando 5 mL de meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1:100, aminoácidos não essenciais a 1% e L-glutamina a 1%; ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aspirar as células com pipeta sorológica de 10 mL e depositá-las em tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire o meio de cultura celular, adicione 5 mL de meio de cultura de células fresco em cima do pellet de células e misture delicadamente.</li>
	<li>Conte as células viáveis com um hemocitômetro10. Para fazer isso, pegue uma alíquota de 50 μL da suspensão celular e misture-a com 50 μL de azul de tripano. Conte as células vivas (as células negativas para a cor azul) e calcule o número total de células vivas na suspensão.</li>
	<li>Preparar um "meio de cultura 3D" (um meio de cultura celular suplementado com 5% de matriz de membrana basal; ver Tabela de Materiais). NOTA: O "meio de cultura 3D" é líquido à temperatura ambiente. A 37 °C, a consistência torna-se mais gel-like (para que as células permaneçam juntas), embora ainda possa ser pipetada (uma vez que contém apenas 5% de matriz de membrana basal).</li>
	<li>Calcular o número de células necessárias para o ensaio e o volume total necessário; cada poço deve conter 2.000-8.000 células em 200 μL de meio.</li>
	<li>Prepare uma suspensão celular com o número desejado de células (por exemplo, 4.000 células) em 200 μL do "meio de cultura 3D" e misture suavemente com a pipeta para garantir uma distribuição homogênea.</li>
	<li>Transfira a suspensão para um reservatório de pipetagem. Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa (consulte a Tabela de Materiais). Antes de cada coleta das células, misture bem a suspensão.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente para reforçar o agrupamento das células, melhorando assim a agregação celular, e incubar a placa a 37 °C numa incubadora humidificada a 5% CO2.</li>
	<li>A cada 2-3 dias, atualize o "meio de cultura 3D". Centrifugar a placa a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente, remover e eliminar suavemente 50% do meio (100 μL) e adicionar 100 μL de "meio de cultura 3D" fresco para substituir a solução existente. Repetir o passo 1.11 e recolocar a placa na incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO2. OBS: A retirada do meio deve ser realizada quando a placa é mantida a 45°, e o meio deve ser coletado apenas da parte superior para evitar a coleta das células. Não deve ser utilizado um sistema de aspiração a vácuo. O meio fresco precisa ser adicionado lenta e suavemente para não atrapalhar os esferoides, que já terão começado a se formar.</li>
	<li>Inspecione as células sob um microscópio a cada 1-2 dias para monitorar a formação esferoide. Meça o diâmetro dos esferoides formados usando a ferramenta "escala" no software de imagem (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: A inspeção microscópica deve primeiramente revelar corpos irregulares redondos a ovais que assumem uma forma esferoide com o passar do tempo11,12.<ol><li>Quando o diâmetro do esferoide atingir 100-200 μm, realizar os experimentos de eficácia da droga. OBS: Os experimentos de eficácia medicamentosa são realizados quando os esferoides atingem esse diâmetro, pois, nesse momento, a maioria das células está se proliferando, o que é propício para avaliar a resposta ao tratamento. Esferoides de maior diâmetro contêm núcleo necrótico e camada quiescente11,12, resultando em menor proporção de células em proliferação que respondem ao tratamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a coleta de esferoides, use uma pipeta de 1.000 μL para coletar os esferoides de cada poço e deposite-os em um tubo cônico de 15 mL. NOTA: Os esferoides são inerentemente frágeis e requerem um manuseamento suave. Ao transferir o meio com os esferoides para o tubo cônico, segure o tubo a 45° e pipete lentamente na parede do tubo. Os esferoides são visíveis aos olhos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cónico a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente e aspirar e eliminar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL do meio de cultura celular e ressuspender bem o pellet, mas suavemente. Evite fazer bolhas.</li>
	<li>Execute a contagem esferoide seguindo os passos abaixo.<ol><li>Use uma placa de 96 poços e desenhe um sinal de mais na parte inferior de um poço para dividir o poço em quadrantes (para ajudar a rastrear a contagem).</li>
		<li>Adicione 50 μL da suspensão ao poço e conte os esferoides manualmente ao microscópio (usando uma lente objetiva de 10x).</li>
		<li>Conte os esferoides em cada quadrante, tenha cuidado para não dobrar a contagem e calcule o número total de esferoides no poço. NOTA: Para precisão da contagem, conte pelo menos 50 esferoides em um poço. Se houver menos de 50 esferoides, misture suavemente a suspensão para garantir uma distribuição homogênea e conte novamente usando um volume maior da suspensão adicionado a um novo poço. Alternativamente, se houver menos de 50 esferoides em um poço, os esferoides podem ser centrifugados e ressuspensos suavemente em um volume de <0,5 mL. Se houver mais de 100 esferoides, adicione o meio de cultura celular à suspensão esferoide, misture suavemente e reconte.</li>
		<li>Calcular a concentração esferoide (contagem esferoide/volume de contagem [μL]) e, em seguida, calcular o número total de esferoides na suspensão (concentração esferoide × volume total).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensaio de eficácia do medicamento (ensaio MTT)
NOTA: Para mais detalhes, ver van Meerloo et al.13. Além disso, para o ensaio de MTT, apenas o meio de cultura celular e não o "meio de cultura 3D" devem ser usados (a adição da matriz da membrana basal não é necessária e poderia potencialmente interferir com o ensaio de MTT).
<ol><li>Em um tubo novo, preparar uma suspensão esferoide na concentração de 200 esferoides por 200 μL de meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% FBS, 1:100 penicilina-estreptomicina, 1% aminoácidos não essenciais e 1% L-glutamina).<ol><li>Para cada tratamento medicamentoso, prepare um estoque de esferoides em um tubo de 15 mL. Calcule a quantidade necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições: (5-8) × 200 μL. Adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária. NOTA: Consulte a seção de resultados representativos sobre os medicamentos utilizados para o presente estudo e sua dosagem. Além disso, os detalhes comerciais dos medicamentos estão listados na Tabela de Materiais.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira 200 μL da suspensão esferoide para os poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e incube a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%. Não utilizar as linhas e colunas externas da placa de 96 poços para o ensaio, pois esses poços são caracterizados por aumento da evaporação, o que poderia levar a uma maior variabilidade entre os experimentos repetidos; em vez disso, adicione PBS a esses poços. NOTA: É fundamental que a cultura dos esferoides seja homogênea antes que a cultura seja aliquotada na placa de 96 poços. Além disso, uma condição de controle (ou seja, esferoides não tratados) deve ser incluída em cada experimento.</li>
	<li>Depois de incubar os esferoides com a droga de estudo por 24-72 h, centrifugar a placa a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e remover suavemente 170 μL do meio de cultura celular, deixando 30 μL (que inclui os esferoides) no fundo do poço. NOTA: A remoção dos 170 μL do meio de cultura celular deve ser feita com cuidado, para não remover os esferoides. Segure a placa a 45° e coloque uma das mãos (usando uma luva escura para contraste) sob os poços para que os esferoides fiquem visíveis (pontos brancos).</li>
	<li>Preparar a solução de MTT (0,714 mg/mL em RPMI livre de fenol, consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicionar 70 μL de solução de MTT a cada poço para um volume final de 100 μL por poço (a concentração final de MTT no poço será de 0,05 mg por 100 μL). Além disso, prepare poços "em branco" com solução de MTT sem células. NOTA: O MTT é sensível à luz. Portanto, a luz no capô deve ser apagada, e o tubo que contém a solução MTT deve ser coberto com papel alumínio.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C em estufa umidificada a 5% CO2 por 3-4 h até que se observe uma mudança na cor da solução nos poços (a cor roxa representa células vivas).</li>
	<li>Quando uma mudança for observada, adicione 100 μL de solução de parada (HCl 0,1N em isopropanol) a cada poço e misture suavemente o conteúdo dos poços sem criar bolhas.</li>
	<li>Leia a absorbância da placa em um leitor Fluorometer-ELISA (veja a Tabela de Materiais) em um comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de fundo de 630-690 nM. NOTA: Se o leitor Fluorometer-ELISA disponível não conseguir ler a placa de 96 poços de fixação ultrabaixa, transfira o conteúdo de cada poço para uma placa de fundo plano correspondente de 96 poços.</li>
	<li>Calcule a viabilidade celular seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Para cada poço, calcule o "sinal específico" ("sinal específico" = o sinal a 570 nm - o sinal a 630-690 nm). Em seguida, calcule o valor médio dos poços "Em branco" e subtraia esse valor de cada poço.</li>
		<li>Calcular a média dos "sinais específicos" nos poços de controle que contêm células que não foram tratadas com a droga do estudo ("AV-SS-unt").</li>
		<li>Calcular a viabilidade (porcentagem) de células em cada poço em relação aos poços com células não tratadas. NOTA: Viabilidade = (sinal específico em cada poço/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. Monitoramento e análise das alterações morfológicas nos esferoides
NOTA: Quanto ao ensaio MTT, apenas o meio de cultura celular e não o "meio de cultura 3D" devem ser usados nesta avaliação (a adição da matriz da membrana basal não é necessária e poderia potencialmente interferir na análise).
<ol><li>Após a contagem dos esferoides, diluir a suspensão em meio de cultura celular (meio de cultura RPMI-1640 suplementado com FBS 10%, penicilina-estreptomicina 1:100, aminoácidos não essenciais a 1% e L-glutamina 1%) para aproximadamente 1-2 esferoides por 20 μL.</li>
	<li>Colocar 80 μL de meio de cultura celular nos poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e, em seguida, adicionar 20 μL da suspensão esferoide aos poços. NOTA: Os poços conterão, portanto, 1-2 esferoides em um volume de 100 μL.</li>
	<li>Verifique cuidadosamente os poços sob o microscópio, e marque os poços que contêm um esferoide, pois eles serão usados para esta análise.</li>
	<li>Preparar o medicamento do estudo em uma concentração que é o dobro da concentração de interesse. Adicione 100 μL da solução do fármaco aos poços relevantes (a concentração total no poço será então de 1x).</li>
	<li>Capture uma imagem de cada poço no Dia 0 (antes de adicionar o medicamento do estudo) e use a ferramenta "escala" no software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) para determinar os diâmetros dos esferoides.</li>
	<li>Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%, examinar a morfologia e medir o diâmetro dos esferoides (usando a ferramenta "escala") diariamente por 3-7 dias, dependendo de quando o efeito da droga é observado (por exemplo, disseminação celular, vagens invasivas, destruição da estrutura, etc.).</li>
	<li>Ao final do experimento, plotar as mudanças nos diâmetros esferoides (em relação ao Dia 0) ao longo do tempo. NOTA: Variação (porcentagem) = (diâmetro esferoide em um dia específico/diâmetro desse esferoide no Dia 0) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).</li>
<li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Investigacio%CC%81n+Cli%CC%81nica%22%5BJournal%5D)">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284(2022).</li>
<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
<li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li>
<li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665(2022).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Periodicum+Biologorum%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O presente protocolo descreve um método simples para gerar culturas de células primárias 3D (esferoides) derivadas de amostras tumorais humanas. Esses esferoides podem ser usados para várias análises, incluindo a avaliação de potenciais candidatos a fármacos e combinações de fármacos, a identificação de potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e a investigação dos mecanismos de resposta e resistência. O protocolo utiliza células tumorais primárias derivadas diretamente de amostras de pacientes ou células tumorais d...

Estudos in vitro e in vivo representam abordagens complementares para o desenvolvimento de tratamentos oncológicos. Os modelos in vitro permitem o controle da maioria das variáveis experimentais e facilitam as análises quantitativas. Muitas vezes servem como plataformas de triagem de baixo custo e também podem ser usadas para estudos mecanísticos1. No entanto, sua relevância biológica é inerentemente limitada, uma vez que tais modelos refletem apenas parcialmente o microambientetumoral1. Em contraste, modelos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), capturam a complexidade do microambiente tumoral e são mais adequados para estudos translacionais e tratamento individualizado em pacientes (ou seja, investigando a resposta a drogas em um modelo derivado de um paciente individual)1. No entanto, os modelos in vivo não são propícios a abordagens de alto rendimento para triagem de drogas, uma vez que os parâmetros experimentais não podem ser controlados tão rigorosamente quanto nos modelos in vitro e porque seu desenvolvimento é demorado, trabalhoso e dispendioso 1,2.
Modelos in vitro estão disponíveis há mais de 100 anos e linhagens celulares estão disponíveis há mais de 70 anos3. Durante as últimas décadas, no entanto, a complexidade dos modelos disponíveis in vitro de tumores sólidos aumentou dramaticamente. Essa complexidade varia desde modelos de cultura 2-dimensional (2D) (estruturas monocamadas) que são linhagens celulares estabelecidas derivadas de tumores ou linhagens celulares primárias até abordagens mais recentes envolvendo modelos 3-dimensionais (3D)1. Dentro dos modelos 2D, uma distinção fundamental é entre as linhagens celulares estabelecidas e primárias4. Linhagens celulares estabelecidas são imortalizadas; Portanto, a mesma linhagem celular pode ser usada globalmente ao longo de muitos anos, o que, de uma perspectiva histórica, facilita a colaboração, o acúmulo de dados e o desenvolvimento de muitas estratégias de tratamento. No entanto, aberrações genéticas nessas linhagens celulares se acumulam a cada passagem, comprometendo sua relevância biológica. Além disso, o número limitado de linhagens celulares disponíveis não reflete a heterogeneidade dos tumores nospacientes4,5. As linhagens celulares primárias de câncer são derivadas diretamente de amostras tumorais ressecadas obtidas por biópsias, derrames pleurais ou ressecções. Portanto, as linhagens primárias de células cancerosas são biologicamente mais relevantes, pois preservam elementos do microambiente tumoral e características tumorais, como comportamentos intercelulares (por exemplo, cross-talk entre células saudáveis e cancerosas) e fenótipos semelhantes a troncos de células cancerosas. No entanto, a capacidade replicativa das linhagens celulares primárias é limitada, o que leva a um tempo de cultivo estreito e limita o número de células tumorais que podem ser utilizadas paraanálises4,5.
Modelos usando culturas 3D são biologicamente mais relevantes do que modelos de cultura 2D, uma vez que as condições in vivo são mantidas. Assim, modelos de cultura 3D preservam a forma e o crescimento natural das células e replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular. Os modelos 3D mais comumente usados na pesquisa do câncer incluem esferoides multicelulares, estruturas baseadas em arcabouços e culturas embutidas emmatriz4,6,7.
O presente protocolo gera modelos de cultura tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avalia sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Os resultados representativos aqui apresentados são de câncer de mama e cólon; No entanto, esse protocolo é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos (por exemplo, colangiocarcinoma, câncer gástrico, pulmonar e pancreático) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa em câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Os esferoides multicelulares gerados por essa abordagem podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Esse protocolo é dividido em três seções: (1) geração, coleta e contagem dos esferoides em preparação para seu uso como modelo para testar a eficácia de fármacos; (2) ensaio de MTT para avaliar a eficácia da droga sobre os esferoides; e (3) a avaliação microscópica das alterações morfológicas após o tratamento dos esferoides com drogas como outra abordagem para avaliar a eficácia das drogas (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracil</td><td>TEVA Israel</td><td>lote 16c22NA</td><td>Fluorouracil, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Dissociação Celular</td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>TEVA Israel</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatina,&nbsp;</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>Matriz de membrana basal, tipo 3</td></tr><tr><td>DMSO (dimetil sulfóxido)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometer&nbsp; Leitor ELISA</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>para solução de parada</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA&</td><td>nbsp; Versão 1.52a</td><td>Software de código aberto ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>para solução de parada</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>M5655-1G</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclibe&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Sem Penicilina de Cálcio e Magnésio</td></tr><tr><td>&ndash; estreptomicina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Fenol livre RPMI 1640</td><td>Biological industries, Israel</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório de pipetagem</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio de cultura&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,5% solução</td><td>Indústrias biológicas, Israel</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços de fixação ultrabaixa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Navelbine</td></tr></tbody></table>

estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Apesar dos notáveis avanços na compreensão da biologia tumoral, a grande maioria dos candidatos a medicamentos oncológicos que entram em ensaios clínicos falham, muitas vezes devido à falta de eficácia clínica. Essa alta taxa de falha ilumina a incapacidade dos modelos pré-clínicos atuais em predizer a eficácia clínica, principalmente devido à sua inadequação em refletir a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral. Essas limitações podem ser abordadas com modelos de cultura tridimensionais (3D) (esferoides) estabelecidos a partir de amostras tumorais humanas derivadas de pacientes individuais. Essas culturas 3D representam melhor a biologia do mundo real do que linhagens celulares estabelecidas que não refletem a heterogeneidade tumoral. Além disso, as culturas 3D são melhores do que os modelos de cultura 2D (estruturas monocamadas), pois replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular, e preservam a forma e o crescimento natural da célula. No presente estudo, um método foi desenvolvido para preparar culturas primárias de células cancerosas de pacientes individuais que são 3D e crescem em esferoides multicelulares. As células podem ser derivadas diretamente de tumores de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes. O método é amplamente aplicável a tumores sólidos (por exemplo, cólon, mama e pulmão) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa de câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para gerar modelos 3D de cultura tumoral (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Esses esferoides multicelulares podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.

Este protocolo apresenta procedimentos para gerar uma cultura homogênea de esferoides a partir de células tumorais primárias, avaliar quantitativamente a eficácia de drogas em cultura de esferoides (ensaio de MTT) e determinar o efeito de drogas em estudo sobre a morfologia esferoide. Dados representativos de experimentos em esferoides gerados a partir de culturas de células de câncer de cólon e mama são apresentados. Experimentos semelhantes foram realizados usando outros tipos de tumores, incluindo colangiocarcinoma, c...

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Nosso protocolo é significativo porque descreve uma geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias, e este modelo representa melhor a biologia tumoral do mundo real do que as linhagens celulares. Esta abordagem é aplicável a uma variedade de tumores sólidos. Também é custo-efetivo, pois pode ser realizado do início ao fim em um laboratório típico de biologia celular.Os modelos tumorais 3D gerados usando esta abordagem apoiam a pesquisa sobre a sensibilidade e resistência dos tumores a terapias anti-câncer ou a uma combinação de terapias. Esta abordagem gera modelos 3D a partir de células cancerosas primárias. Portanto, poderia identificar qual terapia é provável de ser eficaz para um determinado paciente e, assim, ajudar a personalizar seu tratamento.Quem demonstrará o procedimento será Ella Itzhaki, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, pegue um pequeno frasco T25 com uma cultura de células primárias aderente de célula única e remova o meio de cultura celular. Lave as células com PBS e adicione um mililitro de 1x Accutase por três minutos a 37 graus Celsius para preparar uma suspensão de célula única de culturas de células tumorais primárias aderentes de 75 a 100% de confluência.Neutralizar a solução de Accutase adicionando cinco mililitros de meio de cultura celular. Aspirar as células com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e depositá-las em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 800g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Retire o meio de cultura celular e adicione oito mililitros de meio de cultura de células frescas em cima do pellet de células e, em seguida, misture suavemente. Para contar as células viáveis com um hemocitômetro, pegue uma alíquota de 50 microlitros da suspensão celular e misture com 50 microlitros de azul de tripano. Em seguida, conte as células vivas e calcule o número total de células vivas na suspensão.Em seguida, prepare o meio de cultura 3D. E após calcular o número de células necessárias para o ensaio e o volume total necessário, preparar a suspensão celular com o número desejado de células em 200 microlitros do meio de cultura 3D. Misture suavemente com a pipeta para garantir uma distribuição homogénea.Transfira a suspensão para um reservatório de pipetagem e adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa com uma pipeta multicanal. Centrifugar a placa a 300g durante 10 minutos à temperatura ambiente para reforçar o agrupamento das células, melhorando assim a agregação celular, e incubar a placa a 37 graus Celsius numa incubadora humidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de centrifugar novamente a 300g por 10 minutos à temperatura ambiente, remova e descarte suavemente 50% do meio e adicione 100 microlitros de meio de cultura 3D fresco para substituir a solução existente.Repita este passo e coloque a placa de volta na incubadora umidificada de 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5%. Inspecione as células ao microscópio a cada um a dois dias para monitorar a formação esferoide. Meça o diâmetro dos esferoides formados usando a ferramenta de escala no software de imagem.E quando o diâmetro do esferoide atingir 100 a 200 micrômetros, realize os experimentos de eficácia do medicamento. Para a coleta de esferoides, use uma pipeta de 1.000 microlitros para coletar os esferoides de cada poço e deposite-os em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo cônico a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante com pipeta.Adicione 0,5 mililitros do meio de cultura celular e ressuspenda bem o pellet, mas suavemente. Para realizar a contagem esferoide, use uma placa de 96 poços e desenhe um sinal de mais na parte inferior de um poço para dividir o poço em quadrantes. Adicione 50 microlitros da suspensão ao poço.E com uma lente objetiva de 10x, conte os esferoides manualmente sob o microscópio. Conte os esferoides em cada quadrante e calcule o número total de esferoides no poço. Em seguida, calcule a concentração de esferoides dobrando a contagem de esferoides contando o volume e calcule o número total de esferoides na suspensão.Em um novo tubo, preparar a suspensão esferoide a uma concentração de 200 esferoides por 200 microlitros de meio de cultura celular. Para cada tratamento medicamentoso, prepare o estoque de esferoides em um tubo diferente. Calcule a quantidade total necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições e adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária.Transfira 200 microlitros da suspensão esferoide para os poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de incubar os esferoides com a droga do estudo por 24 a 72 horas, centrifugar a placa a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e remover suavemente 170 microlitros do meio de cultura celular, deixando 30 microlitros no fundo do poço. Prepare a solução MTT e adicione 70 microlitros da solução a cada poço para um volume final de 100 microlitros por poço.A concentração final de MTT no poço será de 0,05 miligramas por 100 microlitros. Além disso, prepare poços em branco com solução de MTT sem células. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com dióxido de carbono a 5% por três a quatro horas até que uma mudança na cor da solução nos poços seja observada.Quando uma mudança for observada, adicione 100 microlitros de solução Stop a cada poço e misture suavemente o conteúdo dos poços sem criar bolhas. Leia a absorbância da placa em um leitor ELISA de parâmetro em um comprimento de onda de 570 nanômetros e um comprimento de onda de fundo de 630 a 690 nanômetros. Para calcular a viabilidade celular, calcule o sinal específico para cada poço.Em seguida, calcule o valor médio dos poços em branco e subtraia esse valor de cada poço. Calcular a média dos sinais específicos nos poços de controle que contêm células que não foram tratadas com o medicamento do estudo. Finalmente, calcular a viabilidade das células em cada poço em relação aos poços com células não tratadas.A formação de esferoides a partir de uma cultura primária de células de câncer de cólon ao longo do tempo pelo número de células inicialmente semeadas é mostrada aqui. A partir desta figura, pode-se observar que o número de esferoides gerados depende do número de células inicialmente semeadas em cada poço. Esferoides das células primárias de câncer de cólon após 10 dias em cultura com semeadura inicial de 2.000 células por poço são mostrados aqui.Após a cultura prolongada dos esferoides do câncer de cólon, eles começaram a se ligar uns aos outros e formaram aglomerados de esferoides e estruturas semelhantes a uvas que impediram uma cultura homogênea e, portanto, proibiram o uso dos esferoides nos ensaios de MTT. Os efeitos do palbociclib, sunitinibe e sua combinação em esferoides de células tumorais primárias, incluindo câncer de cólon e mama, são mostrados aqui. Um ensaio de MTT foi conduzido em esferoides derivados de células de câncer de cólon e mama.Os sinais MTT foram normalizados para valores de células tratadas com DMSO. Os valores representam as médias de quatro a oito repetições. Os efeitos dos diversos tratamentos sobre o crescimento celular também foram avaliados microscopicamente no dia zero e após três dias de tratamento dos esferoides derivados de células de câncer de cólon e câncer de mama.Os efeitos do trastuzumabe mais vinorelbina e 5 fluorouracila mais cisplatina sobre esferoides derivados do câncer de mama ao longo do tempo são apresentados nesta figura. A mudança no diâmetro dos esferoides em relação ao dia zero pela duração do tratamento é mostrada aqui. Cada grupo de tratamento incluiu de quatro a seis poços com um esferoide em cada poço.A variação média é apresentada aqui. Os esferoides são ferramentas importantes para muitos estudos além da resposta ao tratamento anticâncer. Esses estudos abordam, por exemplo, a liberação de fármacos e até mesmo questões básicas de biologia, como interações célula-célula.É fundamental iniciar um processo de geração de esferoides com uma suspensão de célula única. Também é fundamental usar placas de fixação ultrabaixas com um meio contendo uma métrica de membrana básica de 5%.

establishing-3-dimensional-spheroids-from-patient-derived-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Aprenda a gerar esferoides tumorais 3D a partir de células cancerígenas primárias para avaliar a sensibilidade a terapias anticâncer. Este método reproduz melhor a biologia tumoral real e permite personalizar tratamentos para pacientes com tumores sólidos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Explorar mais vídeos