Isolamento, ativação e expansão de células T baseadas em flotação de amostras de células mononucleares do sangue periférico humano usando microbolhas

O protocolo de ativação e expansão de microbolhas é significativo porque aborda uma grande necessidade não atendida na pesquisa e fabricação de terapia celular, melhorando a persistência e a eficácia das terapias com células T. A técnica de seleção, ativação e expansão positiva baseada em flutuabilidade do Akadeum limita a superestimulação e a subsequente exaustão das células T durante os fluxos de trabalho de ativação e expansão. Para começar, incubar 3 vezes 10 até o 8º PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mililitros de tampão de separação, com anticorpo anti-CD3 biotinilado.

Misture suavemente os componentes por pipetagem e incube-os à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicione microbolhas de avidina despojadas às células na proporção de 0,5 para 1, de acordo com as instruções do fabricante. E misture usando um rotador comercial de ponta a ponta a 20 RPM por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente.

Centrífuga a 400g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, as células selecionadas positivamente estarão no topo da suspensão com as microbolhas de avidina despojadas, e as células restantes não selecionadas estarão no pellet celular na parte inferior do tubo. Usando uma pipeta de vidro de nove polegadas, insira a ponta abaixo da camada de célula de bolha na parte inferior do tubo.

Aspirar o pellet celular e o subnadante com uma pipeta eletrônica e transferi-los para um novo tubo. Ressuspeite a camada de células de bolhas deixada no tubo original em um mililitro de meio de célula T completo. Centrifugar o subnadante a 400g por cinco minutos à temperatura ambiente e usá-lo para medição indireta de pureza e recuperação.

Após a centrifugação das células subnadantes e não selecionadas, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de meio antes de contar. Usando um contador de células automatizado, conte as células no subnadante com microscopia de campo brilhante e determine o número de células capturadas na camada de células bolha, conforme descrito no manuscrito do texto. Para criar a avidina e as microbolhas despojadas anti-CD28 conjugadas, adicione o anticorpo anti-CD28 biotinilado às microbolhas comerciais e misture usando rotação de ponta a ponta por um período mínimo de duas horas.

Adicione as microbolhas de áripas de áripas conjugadas anti-CD28 à suspensão de células de bolhas preparada numa proporção de 1,5 para 1. Misture os componentes usando rotação de ponta a ponta por 15 minutos. Em seguida, ajuste o volume total para 2 milhões de células por mililitro com meio de célula T completo, ou outro meio desejado de acordo com o número de células obtido.

Distribua um mililitro de células ativadas em uma placa de 24 poços e incube em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% umidificada a 37 graus Celsius. Após 24 horas, adicione IL-2 e anti-CD3 solúvel para incentivar uma maior expansão, conforme calculado usando o número inicial de células chapeadas no dia zero. Coloque a placa celular de volta na incubadora de dióxido de carbono umidificada e incube durante a noite a 37 graus Celsius.

Remova metade do meio do meio-termo a cada dois dias. Substitua-o por um meio de células T fresco e completo e adicione IL-2 a uma concentração de 50 unidades por mililitro. Conte as células T duas vezes por semana para avaliar a densidade celular.

Quando a densidade celular exceder 2 vezes 10 para a 6ª, ou 2,5 vezes 10 para a 6ª célula por mililitro, transfira-as para um vaso maior, diluindo-as para 5 vezes 10 para a 5ª célula por mililitro. Misture suavemente o conteúdo de cada poço pipetando para cima e para baixo. Remova todo o conteúdo do poço, incluindo as microbolhas, e transfira-as para um tubo de 1,5 mililitro.

Lave cada poço com 400 microlitros de DPBS sem cálcio e magnésio e transfira a solução para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugar o tubo a 400g por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 50 microlitros de tampão de separação.

Em seguida, divida 50 microlitros de suspensão celular em 25 microlitros cada para ativação e exaustão. Manchar as células com um coquetel de coloração de anticorpos de ativação e exaustão e incubá-las por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicione um mililitro de tampão de separação, misture suavemente e centrifugar para lavar o excesso de anticorpos.

Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspeite o pellet celular em um mililitro de tampão de separação e transfira-o para um vaso apropriado para a análise da citometria de fluxo. Aumentos no número viável de células T e células T transgênicas positivas foram observados entre a amostra de controle e as células que receberam co-estimulação de microbolhas.

Populações de células efetoras aumentadas também foram observadas nas amostras de microbolhas. As células T ativadas viáveis expressam aumento do marcador de ativação precoce CD69 e do marcador de ativação média a tardia CD25. O número total e a porcentagem de células positivas para marcadores de exaustão PD1 também foram significativamente maiores em amostras de células que receberam co-estimulação de microbolhas.

A mistura e a dispensação adequadas de microbolhas são essenciais para garantir uma dosagem precisa, pois as microbolhas flutuam para a superfície rapidamente sem agitação. Esperamos plenamente que o faça, permitindo o rápido crescimento de uma grande população de células T com maior atividade do que aquelas células T mais exaustas frequentemente vistas em outros métodos.