Fracionamento subcelular para o isolamento de componentes sinápticos do cérebro murino

Sinapses são as unidades computacionais básicas do cérebro. O método apresentado é uma ferramenta simples e valiosa para estudar as sinapses e seus processos moleculares e também para entender como elas podem ser alteradas em vários distúrbios cerebrais. Esta técnica envolve um fracionamento de estruturas sinaptossomas isoladas do cérebro.

Isso permite ao pesquisador capturar efeitos que podem ser compartimentados na sinapse. Os níveis de distribuição e atividade de proteínas específicas também podem ser analisados com resolução subsináptica. Este procedimento leva cerca de 11 horas para um pesquisador individual concluir se tudo correr bem.

Um indivíduo que nunca realizou esta técnica pode ter dificuldade com a duração deste procedimento, pois naturalmente levará um pouco mais de tempo para alguém que não está familiarizado com os passos. Devido à duração deste dia experimental, é altamente recomendável realizar as dissecações com um parceiro que possa ajudá-lo a facilitar a coleta rápida de tecidos para garantir que nenhuma amostra se coloque no gelo por mais tempo do que o necessário. Também recomendamos a preparação de buffers e materiais de bancada no dia anterior à execução deste experimento para que tudo esteja ao alcance fácil quando necessário.

Isto é particularmente verdadeiro para os tubos de coleção. Múltiplas alíquotas de um total de 11 frações subcelulares serão coletadas até o final deste procedimento. Portanto, ter esses tubos claramente rotulados com antecedência tornará seu dia muito mais fácil.

Para começar, insira uma tesoura fina sob a pele na incisão de decapitação a uma profundidade pericraniana e faça uma incisão sagital média até a sutura intranasal para retrair o couro cabeludo do crânio. Trabalhando a partir da área occipital em direção a cada aspecto temporal, apague a fáscia e o músculo para expor a superfície externa do crânio além de cada meato acústico externo. Prenda o couro cabeludo e o aspecto rostral do crânio com a mão não dominante e, com a outra mão, insira uma tesoura fina de dois milímetros no lado caudal do forame magno, onde a medula espinhal é visível saindo.

Faça uma incisão na linha média até que a tesoura atinja a superfície interna do osso intraparietal. Mude o ângulo da tesoura para que as lâminas corram paralelamente à superfície dorsal do crânio. Continue avançando a incisão sagital média rostralmente através dos ossos parietal e frontal usando as suturas sagital e interfrontal como guia e termine a incisão logo após a sutura internasal.

Em seguida, faça uma incisão perpendicular de três milímetros ao osso nasal, rostral à sutura internasal, colocando a tesoura perpendicular ao crânio com cada lâmina posicionada em uma sutura pré-maxilar nasal e fazendo um corte uniforme. Ao fixar o aspecto rostral, use um lado de um par de pinças texturizadas para levantar suavemente o crânio do cérebro e, em seguida, levantá-lo lateralmente e ventralmente. Repita ao longo da linha média, conforme necessário, em seguida, para o outro hemisfério até que toda a superfície do cérebro esteja exposta.

Usando pinça curva ou uma espátula fina levantar suavemente o lado rostral do cérebro. Corte os nervos ópticos e cranianos para completar a excisão do crânio. Homogeneize os cérebros usando um homogeneizador de vidro para baixo colocado em um banho de gelo em 12 passagens para cima a 500 rpm.

Faça uma pausa breve a cada curso para baixo para garantir a homogeneização completa do tecido. Transfira o homogeneizado total do cérebro para um tubo de centrífuga de fundo redondo de alta velocidade de 14 mililitros e gire-o a 800 G por 10 minutos a quatro graus Celsius para obter o sobrenadante denominado S1.transfer S1 para um novo tubo de centrífuga, descarte o pellet. Tome duas alíquotas de cinco microlitros de S1 para o ensaio de ácido bicinchonínico e duas alíquotas de 100 microlitros de S1 para a mancha ocidental.

Gire S1 a 9.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius para obter o sobrenadante somal sináptico, ou S2, e o pellet de sinaptossomo bruto ou P2. Tome duas alíquotas de 10 microlitros de S2 para o ensaio de ácido bicinchonínico e duas alíquotas de 500 microlitros de S2 para a mancha ocidental. Descarte o sobrenadante após a obtenção das alíquotas. após centrifugação a 9.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius, obter o sobrenadante S2'e sinaptossomo lavado, P2'Descarte o sobrenadante e ressuspenda P2'em três mililitros de tampão A.Evite ressuspender a porção vermelha escura no fundo do pellet, que contém principalmente mitocôndrias.

Pegue duas alíquotas de 20 microlitros de P2'para o ensaio de ácido bicinchonínico e duas alíquotas de 100 microlitros de P2'para o western blot. Para a lise hipotônica do sinaptossomo lavado adicione nove volumes de tampão refrigerado B para ressuspender P2'e homogeneizar o sinaptossomo em um homogeneizador de vidro para baixo. Transfira as amostras para tubos de centrífuga cônica tampados de 50 mililitros e gire-os em um revólver de tubo em uma sala fria de quatro graus Celsius por 15 minutos.

Centrifugar o P2'at 25, 000 G lisado durante 20 minutos a quatro graus Celsius para obter o sobrenadante de lise ou LS1, e o pellet de lise contendo membranas sinaptossomais, ou LP1. Tome duas alíquotas de 50 microlitros de LS1 para o ensaio de ácido bicinchonínico e duas alíquotas de 400 microlitros de LS1 para a mancha ocidental. Transfira o LS1 para um tubo de centrífuga tampado para ultracentrifugação.

Centrifugar LS1 em um rotor ultracentrífugo de ângulo fixo a 100.000 G por 60 minutos a quatro graus Celsius para obter sobrenadante de citosol sináptico, ou LS2, e pellet de vesícula sináptica, ou LP2. Ressuscite LP2 em 500 microlitros de tampão A e usando uma agulha de calibre 23 e uma seringa de um mililitro puro LP dois com trituração suave. Tome duas alíquotas de 10 microlitros de LP2 para o ensaio de ácido bicinchonínico e duas, alíquotas de 250 microlitros de LP2 para o western blot.

Transfira cerca de 30 mililitros de LS2 para unidades de filtro centrífugas com um corte de 10 miliDalton e concentre o LS2 em aproximadamente 0,5 mililitros girando a 5.000 G por até uma hora a quatro graus Celsius. Tome duas alíquotas de 10 microlitros de LS2 concentrado para o ensaio bicinchonínico, e duas, alíquotas de 250 microlitros de LS2 concentrado para o western blot. Ressuscite LP1 em um mililitro de tampão B, E tome duas, 10 alíquotas de microlitros de LP1 para o ensaio de ácido bicinchoninico e duas alíquotas de 50 microlitros de LP1 para o western blot.

Ajustar o LP1 restante para um volume final de 7,5 mililitros e uma concentração final de sacarose de 1,1 molar com tampão B e tampão C.Em seguida, transfira 7,5 mililitros do LP1 ressuspenso para um tubo ultracentrífugo de 14 mililitros. Sobreponha cuidadosamente o LP1 com 3,75 mililitros de tampão D e marque a parte superior da solução com uma caneta. Em seguida, sobreponha com cerca de 1,25 mililitros de tampão A.E da mesma forma, marque a parte superior da solução com uma caneta.

Equilibrar os tubos para ultracentrifugação por peso, não por volume, com a adição gota a gota do tampão A a um máximo de 10 miligramas. Centrifugar a 48.000 G por 2,5 horas a quatro graus Celsius em um rotor de ultracentrífuga de balde oscilante e adquirir imagens dos gradientes intactos para documentar a distinção de cada interface de sacarose e o sucesso do fracionamento. Remova cuidadosamente a camada superficial de sacarose 320 milimolares e recupere a fração de mielina na interface de sacarose de 320 milimolares e 855 milimolares em um volume de 800 microlitros.

Pipetar para cima da parede dos tubos de forma circular para garantir que a fração completa seja coletada. Em seguida, recupere a fração SPM na interface de sacarose de 855 milimolares e 1,1 milimolar em um volume de 1000 microlitros. Aspirar cuidadosamente a sacarose restante e recuperar o pellet mitocondrial ressuspendendo em 200 microlitros de tampão B.Dilua a fração SPM com dois volumes de tampão B e, em seguida, centrifugar em um rotor de ângulo fixo em um tubo de centrífuga de 3,5 mililitros.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet SPM no buffer A para um volume final de 250 microlitros. Pegue duas alíquotas de cinco microlitros de SPM para o ensaio de ácido bicinchonínico e divida o SPM restante ao meio para o western blot. Imagens de microscopia eletrônica de sinaptossomas são mostradas nesta figura.

Um sinaptossomo contendo vesículas sinápticas componentes pré e pós-sinápticos e vesículas sinápticas em uma mitocôndria são mostrados aqui. A análise imunoblot das frações subcelulares foi realizada para avaliar os marcadores de pureza da fração. Quando comparado ao homogeneizado cerebral completo inicial, a análise revelou o enriquecimento de n-caderina na fração da membrana plasmática sináptica, alfa-sinucleína no citosol sináptico, sinaptofisina na fração vesícula sináptica e proteína básica da mielina na fração mielina.

Uma vez que a pureza da fração tenha sido estabelecida, o immunoblotting quantitativo pode ser usado para determinar a localização de proteínas de interesse ou consultar diferenças na distribuição de proteínas entre genótipos ou tratamentos. Ao tentar este procedimento, certifique-se de usar vidro sem detergente para que o sinaptossomo intacto possa ser coletado. Além disso, tenha cuidado ao preparar gradientes de sacarose para garantir que você obtenha interfaces claras.

Isso permitirá que você isole com sucesso a fração da membrana plasmática sináptica. Várias análises estruturais e funcionais podem ser realizadas para auxiliar a qualidade das frações sinápticas, como microscopia eletrônica, immunoblotting, proteômica e outros métodos moleculares. A liberação de neurotransmissores ou ensaios enzimáticos também podem ser realizados para auxiliar a viabilidade metabólica dos sinaptossomos.

O isolamento das estruturas dos sinaptossomos foi uma técnica de mudança de paradigma para a análise da função e composição das sinapses. À medida que vemos a disfunção sináptica precoce na neurodegeneração, a dissecção cuidadosa das alterações moleculares no nível da sinapse nos ajudará a explorar os mecanismos moleculares desses distúrbios.