Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Esse protocolo permite identificar e quantificar o vírus Zika sem depender do efeito citopático. Depende do reconhecimento de anticorpos do componente do vírus. O uso de anticorpos vírus-específicos pode ajudar na identificação de diferentes sorotipos virais em populações mistas.

Este método tem vantagens sobre os ensaios clássicos de formação de placas. É mais rápido e habilitado para aplicações de alto rendimento ao aplicar com um sistema de imagem automatizado para contagem rápida de células. O protocolo proposto é altamente adaptável.

Com as devidas modificações, o protocolo proposto pode ser aplicado a vários tipos celulares e alvos virais. Comece cultivando células Vero em um frasco de cultura celular de 75 quadrados=centímetros que contém 12 mililitros de DMEM suplementado com 10% FBS e dois milimoles de L-glutamina. Colocar o balão numa incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para infectar a monocamada celular, utilizar pipeta sorológica de 10 mililitros para remover o meio de crescimento do frasco de cultura celular. Com pipeta sorológica de cinco mililitros, enxaguar o frasco com três mililitros de DPBS duas vezes. Em seguida, adicionar dois mililitros de DMEM sem soro e 20 microlitros de inóculo do vírus Zika no frasco de cultura celular.

Deixar incubar o balão à temperatura ambiente durante uma hora com balanço suave para incentivar a adsorção do vírus. Ao final da incubação, com pipeta sorológica de cinco mililitros, retirar cuidadosamente e descartar o inóculo viral diluído do frasco de cultura celular. Enxaguar duas vezes o frasco de cultura celular com três mililitros de DPBS.

Em seguida, adicionar 12 mililitros de meio de manutenção no frasco de cultura celular para manter as células infectadas. Incubar as células Vero infectadas por três dias em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após três dias de incubação, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para colher o sobrenadante da cultura celular contendo o vírus Zika em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Para a quantificação do vírus, semeie células Vero em placas designadas e permita que elas cresçam durante a noite a 37 graus Celsius com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%. Prepare seis tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro para cada placa para realizar uma diluição seriada de dez vezes, incluindo um tubo extra para um controle negativo. Para uma configuração de placa de 24 poços, adicione 450 microlitros de DMEM sem soro a todos os seis tubos de microcentrífuga.

Para uma configuração de placa de 96 poços, distribua 135 microlitros de DMEM sem soro em seis tubos adicionais. Para realizar a diluição em série para o experimento de placa de 24 poços, adicione 50 microlitros do estoque do vírus Zika no tubo de 10 a menos um contendo 450 microlitros de DMEM livre de soro. Para o experimento de placa de 96 poços, adicione 15 microlitros de estoque de vírus Zika no tubo de 10 a menos um contendo 135 microlitros de DMEM livre de soro.

Vórtice cada tubo para misturar completamente o vírus e o meio, garantindo uma distribuição uniforme das partículas virais dentro da diluição. Usando uma ponta de pipeta nova, ressuspenda o tubo de 10 a menos um e transfira 50 e 15 microlitros de vírus Zika diluído para o tubo de 10 a menos dois como uma segunda diluição de dez vezes para as placas de 24 e 96 poços, respectivamente. Retire e descarte o meio de condição para cada poço da placa apropriada.

Enxágue cada poço com DPBS duas vezes para remover quaisquer resíduos. Começando com a diluição mais alta, adicione o inóculo viral diluído em série nos poços, trabalhando para a diluição mais baixa. Após uma hora de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus dos poços, começando pela menor para a maior concentração.

Lave as células infectadas com DPBS duas vezes para remover quaisquer vestígios de suspensão do vírus. Sobreponha o poço com DMEM e carboximetilcelulose de baixa viscosidade a 1,5%. Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, retire e descarte o meio de sobreposição e lave as células três vezes com PBS. Para a placa de 96 poços, use uma pipeta multicanal para remover e descartar o meio de sobreposição e lave as células três vezes com 60 microlitros de PBS por poço. Adicionar paraformaldeído a 4% para fixar as células e incubar a placa à temperatura ambiente durante 20 minutos.

Após 20 minutos, descarte o paraformaldeído e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicionar o substrato 3,3'diaminobenzidina peroxidase e incubar a placa por 30 minutos no escuro. Após 30 minutos, pare a reação lavando os poços com água.

Seque as placas ao ar durante a noite e prossiga para a enumeração dos focos. Conte os focos para cada réplica da diluição selecionada e calcule o número médio de focos para cada um. As células Vero infectadas foram fixadas em diferentes momentos pós-infecção.

Para a placa de 2 poços, o primeiro aparecimento de focos virais foi observado 48 horas após a infecção, embora o tamanho dos focos fosse muito pequeno para contar com precisão. Após 96 horas pós-infecção, não havia sinais de descolamento celular. Em 60 horas pós-infecção, o tamanho dos focos aumentou para um nível ótimo para contagem.

Posteriormente, com o passar do tempo, os focos tornaram-se maiores e começaram a se fundir ou se sobrepor uns aos outros em intensidade, formando aglomerados que cresceram ao longo do tempo. Portanto, focos formados 60 horas após a infecção foram escolhidos para determinar o título do vírus Zika em uma placa de 24 poços. Para a placa de 96 poços, as células permaneceram intactas após 72 horas pós-infecção.

O aparecimento de focos virais foi observado pela primeira vez 24 horas após a infecção. No entanto, até 36 horas após a infecção, o tamanho dos focos era muito pequeno. O tamanho ideal dos focos foi alcançado 48 horas pós-infecção.

Nos últimos momentos, focos sobrepostos ou mesclados foram observados, e o número de focos sobrepostos aumentou ao longo do tempo. Os focos formaram-se 48 horas após a escolha da infecção para determinar o título viral dos isolados do vírus Zika. Adicione delicadamente o DPBS na lateral de cada poço e agite as placas para trás e para frente uma a três vezes para remover detritos celulares e excesso de meios.

Essa técnica beneficiará muito os pesquisadores na pesquisa do Zika e também pode ser amplamente adaptada para quantificar outros vírus clinicamente importantes, tornando-se uma ferramenta valiosa para a vigilância e o diagnóstico de vírus.