Name: Mapeando interações do genoma 3D de mamíferos com Micro-C-XL (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda a mapear a organização tridimensional do genoma em resolução de nucleossomo usando a técnica Micro-C-XL. Este método oferece alta relação sinal-ruído para estudos detalhados de interações cromossômicas de curto alcance.

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Agradecemos a Christl Gaubitz e Kathleen Stewart-Morgan pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a Anja Groth e ao laboratório Groth por seu apoio na criação de nosso laboratório. Agradecemos à equipe da Plataforma de Genômica CPR/reNEW pelo apoio: H. Wollmann, M. Michaut e A. Kalvisa. O Centro de Medicina de Células-Tronco da Fundação Novo Nordisk (reNEW) é apoiado pelo número de concessão da Fundação Novo Nordisk NNF21CC0073729. O Centro de Pesquisa de Proteínas (CPR) da Fundação Novo Nordisk é apoiado pelo número NNF14CC0001 de concessão da Fundação Novo Nordisk. Agradecemos ao laboratório Brickman do Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, pelas células ES de camundongos.

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<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
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<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O sucesso de um experimento Micro-C depende de algumas etapas críticas no protocolo que precisam ser cuidadosamente executadas. Primeiro, a ligação cruzada com o reticulador adicional DSG ou EGS pode levar à agregação de células, dependendo do tipo de célula. A adição de 0,1%-0,5% de BSA à reação de reticulação reduz significativamente a agregação sem afetar a eficiência da reticulação. Ligações cruzadas ineficientes podem resultar em aumento das taxas de interações transcromossômicas indicativas de ligaduras aleatórias. O segundo, mas mais crucial, passo neste protocolo é a digestão da cromatina com MNase. A digestão subótima da cromatina leva à ligadura de proximidade ineficiente (excesso de digestão) ou ao aumento das taxas de dinucleossomos não ligados à proximidade (subdigestão). A eficiência da reação de ligadura pode ser avaliada por eletroforese em gel de agarose (Figura 1B) e é adicionalmente melhor estimada por sequenciamento de baixa entrada. Se o sequenciamento de baixa entrada revelar uma alta taxa de duplicação (ligadura ineficiente) ou taxas aumentadas de dinucleossomos, o grau de digestão da MNase deve ser reavaliado. Notavelmente, a perda de amostra ao executar o protocolo pode levar à redução da complexidade da biblioteca. A concentração de uma amostra é melhor avaliada após a purificação do DNA (etapa 5.3) ou por PCR mínimo (etapa 8). O rendimento total de DNA de 5 x 106 células de mamíferos após a purificação do DNA é tipicamente de >2 μg. A concentração de DNA deve ser controlada após a digestão da MNase, digestão ExoIII e purificação do DNA. Nucleases endógenas, cuja abundância é específica do tipo celular e espécie-específica, podem ser uma fonte de degradação do DNA. Além disso, a purificação de DNA baseada em coluna pode levar à perda de amostra devido à incompatibilidade com o SDS de reações de desproteinação. A precipitação de etanol pode ser considerada se a concentração de DNA for baixa nesta etapa.
Como o Micro-C requer titulação de MNase específica da amostra, é um desafio aplicar o Micro-C a populações de pequenas células, como com pequenos órgãos de vários organismos modelo, embriões e células únicas, organoides ou biópsias de pacientes. Aqui, o Hi-C 3.0 oferece uma alternativa bem estabelecida usando uma reação de desfecho por endonucleases de restrição seqüenciais-específicas 8,9.
O Micro-C é uma tecnologia de conformação cromossômica de alta resolução amplamente aplicável, com alta faixa dinâmica e baixa relação sinal-ruído, o que a torna particularmente adequada para investigar características cromossômicas de curto alcance 4,5,8, como alças cromossômicas. A resolução do Micro-C permite a captura de alças promotora-potencializadora, que estão além do limite de detecção de Hi-C, possibilitando eficientemente uma análise mais detalhada da relação entre organização e regulação do genoma13,14,15. Além disso, estratégias de captura de DNA foram recentemente combinadas com Micro-C para aumentar a resolução locus-específica dos locus genômicos alvo para níveis sem precedentes, revelando novos insights sobre a ultraestrutura do genoma 3D16,17,18. Em resumo, vislumbramos que o Micro-C e seus derivados serão uma tecnologia chave para dissecar o papel do genoma 3D na regulação transcricional e, consequentemente, na diferenciação e manutenção do tipo celular.

Micro-C-XL é uma técnica genômica para medir a conformação do genoma 3D com resolução de nucleossomos. O Micro-C-XL baseia-se na tecnologia Hi-C baseada em ligadura de proximidade amplamente utilizada, que transformou nossa compreensão de como os genomas 3D são organizados1. O Micro-C-XL e sua primeira iteração, Micro-C, foram inicialmente desenvolvidos em Saccharomyces cerevisiae2,3 e posteriormente adaptados a sistemas celulares de mamíferos, para os quais o protocolo demonstrou todo o seu potencial na detecção de características de curto alcance do genoma 3D, como alças cromossômicas e sítios de isolamento. Esta versão é baseada em publicações recentes de mamíferos Micro-C-XL 4,5. Como o Micro-C-XL substitui o Micro-C, o Micro-C-XL é doravante referido como Micro-C no manuscrito.
As principais diferenças entre Micro-C e Hi-C6 são as seguintes: 1) fragmentação do genoma com nuclease microcócica (MNase) em comparação com enzimas de restrição e 2) reticulantes adicionais com maior espaçamento atômico entre os grupos reativos em comparação com apenas formaldeído. Ambas as etapas contribuem significativamente para a melhoria da relação sinal-ruído do Micro-C em comparação com o Hi-C convencional. O tamanho da fragmentação limita a resolução para a qual a organização do genoma 3D pode ser resolvida durante o protocolo de ligadura de proximidade. A MNase é uma nuclease que digere preferencialmente o DNA acessível e deixa intacto o DNA nucleossomal protegido. O footprinting nucleossomal usando o sequenciamento de MNase mostrou que os nucleossomos cobrem totalmente a maioria dos genomas eucarióticos7. Como os nucleossomos estão distribuídos ao longo do genoma com um espaçamento médio de 160-220 pb, dependendo da espécie e do tipo celular, a MNase é a enzima ideal para o mapeamento de alta resolução da arquitetura do genoma.
O uso de um reticulador adicional em combinação com formaldeído (FA) no método Micro-C melhora adicionalmente a relação sinal-ruído 2,8. Reticulantes específicos de amina com espaçadores atômicos mais longos entre os grupos reativos facilitam ligações cruzadas proteína-proteína. Estes são tipicamente disuccinimidil glutarato (DSG) ou etilenoglicol bis-succinimidil succinato (EGS) com espaçadores de 7,7 Å e 16,1 Å, respectivamente. A redução do ruído através do EGS ou DSG é particularmente aparente em experimentos com altas taxas de fragmentação, como o Micro-C, e presumivelmente ocorre devido a uma redução na taxa de eventos de ligaduraaleatória8.
Um protocolo Hi-C 3.0 recentemente desenvolvido que utiliza ligações cruzadas ESG/DSG e múltiplas combinações de enzimas de restrição reduz o ruído em experimentos Hi-C e melhora significativamente a detecção de alças cromossômicas e locais de isolamento 8,9. Ainda assim, uma comparação site a site de vários recursos de dados de interação descobriu que o Micro-C tinha detecção superior de recursos de curto alcance, como loops cromossômicos e locais de isolamento, em comparação com o Hi-C 3.0 e o Hi-C8 convencional. No entanto, o Hi-C 3.0 melhora a detecção de características de curto alcance e mantém uma forte detecção de compartimentalização do genoma em comparação com o Hi-C convencional. Em resumo, a escolha de um método de captura da conformação cromossômica deve ser determinada pela questão objetiva e biológica.
Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo para experimentos Micro-C bem-sucedidos que podem desvendar a organização do genoma 3D.

<table><tbody><tr><td>1 mM Biotina dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotina dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Exonuclease III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase tampone&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sem Mg2+ e Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0,1 mM b-mercaptoetanol&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldeído&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Cuidado. Veja os fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Fragmento de Klenow</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Cuidado. Veja os fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell contador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Cuidado. Veja os fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>referido como: ímã ímã para tubos de 1,5 ml</td></tr><tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>referido como: ímã ímã para tubos PCR</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0,5M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td><td>sistema de controlo de qualidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol bis(succinato de succinimidil) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>15%</td></tr><tr><td>FBS Gel Loading dye purple (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de proteinase Halt (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Cuidado. Veja os fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>células-tronco embrionárias de camundongo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (Dual Index primers)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>primers de amplificação para bibliotecas de sequenciamento</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II kit de preparação de biblioteca de DNA para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>kit de preparação de biblioteca de sequenciamento&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBPróximo Ultra II Q5 Master mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Cuidado. Veja fabrica MSDS</td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinase K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Cuidado. Veja o</td></tr><tr><td>kit de extração de gel MSDS QIAquick</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>do fabricante, referido como: kit de eluição de gel DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR</td><td>QIAquick QIAgen</td><td>28106</td><td>referido como: kit de purificação de DNA comercial&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>instrumento de quantificação de DNA de alta sensibilidade&nbsp;</td></tr><tr><td>Escada de DNA roxa de carga rápida 1kb plus</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselecione contas de seleção de tamanho</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>contas paramagnéticas&nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5382000015</td><td>referido como: termomixer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuro 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Ultrapuro Clorofórmio Álcool Isoamílico (PCI)</td> <td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de fragmentos</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeando interações do genoma 3d de mamíferos com micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

A organização cromossômica tridimensional (3D) é um fator importante na regulação do genoma e especificação do tipo celular. Por exemplo, acredita-se que elementos cis-regulatórios, conhecidos como potenciadores, regulem a atividade de promotores distais via interação no espaço 3D. Tecnologias de captura de conformação cromossômica (3C) em todo o genoma, como Hi-C, transformaram nossa compreensão de como os genomas são organizados nas células. A compreensão atual da organização do genoma 3D é limitada pela resolução com a qual a organização topológica dos cromossomos no espaço 3D pode ser resolvida. Micro-C-XL mede o enovelamento cromossômico com resolução no nível do nucleossomo, a unidade básica da cromatina, utilizando nuclease microcócica (MNase) para fragmentar genomas durante o protocolo de captura da conformação cromossômica. Isso resulta em uma melhor relação sinal-ruído nas medições, facilitando assim a melhor detecção de locais de isolamento e loops cromossômicos em comparação com outras tecnologias 3D de todo o genoma. Um protocolo passo-a-passo detalhado e visualmente suportado para preparar amostras Micro-C-XL de alta qualidade a partir de células de mamíferos é apresentado neste artigo.

A preparação bem-sucedida de bibliotecas Micro-C pode ser avaliada em várias etapas do protocolo. O passo mais importante é a escolha de um grau de digestão MNase adequado. Portanto, a concentração de MNase deve ser titulada para produzir consistentemente 70%-90% de mononucleossomos sobre dinucleossomos para cada amostra. É importante notar que a digestão da cromatina é diferente para eu- e heterocromatina, com a MNase digerindo a heterocromatina de forma menos eficiente. Assim, o grau ótimo de digestão depende da região de interesse da cromatina e do tipo celular estudado, uma vez que a proporção relativa de eu- e heterocromatina é específica do tipo celular. Portanto, é aconselhável titular cuidadosamente a concentração de MNase necessária e primeiro avaliar o sucesso do experimento Micro-C por meio de sequenciamento de baixa entrada.
Um padrão típico de titulação de MNase da cromatina tratada com quantidades decrescentes de MNase é mostrado na Figura 1A. Aqui, a cromatina de 250.000 células por reação é digerida com uma diluição de quatro vezes a MNase. A maior concentração (10 U de MNase, Lane 2) mostra cromatina superdigerida quase exclusivamente consistindo de DNA mononucleossomal (~150 pb). Notavelmente, o centro da banda mononucleossomal é menor no gel de agarose em comparação com as bandas correspondentes nas amostras com concentrações reduzidas de MNase, indicando uma superdigestão do DNA nucleossomal. Nucleossomos superdigeridos são ligados ineficientemente na reação de ligadura de proximidade; portanto, a amostra na faixa 2 é subótima para experimentos Micro-C. A faixa 3 (2,5 U de MNase) exibe um grau de digestão quase apropriado para experimentos de Micro-C. Aqui, a banda mononucleossomal é a espécie dominante, e o esfregaço subnucleossomal, indicativo de nucleossomos superdigeridos, é reduzido; no entanto, ainda está presente. O grau de digestão na Lane 4 (0,635 U de MNase) é uma condição ideal para um experimento Micro-C neste exemplo de titulação. Uma banda mononucleossomal clara sem DNA subnucleossomal está presente. A intensidade da banda para o DNA mononucleossomo e dinucleossomo é quase igual, indicando um rendimento de mononucleossomo de 66% ou mais. Vale a pena notar que o DNA dinucleossomal é aproximadamente duas vezes o tamanho do DNA mononucleossomal (~320 pb vs. ~150 pb), de modo que sua intensidade de banda por mol de DNA é duas vezes maior em comparação com sua contraparte mononucleossomal. O grau de digestão em Lane 5 (0,156 U de MNase) mostra cromatina subdigerida com quase nenhum DNA nucleossomal, e esta, portanto, representa uma amostra subótima.
Em conclusão, neste exemplo, a digestão de 2,5 x 10 5 células ES de camundongo com 0,625 U de MNase (correspondendo a2,5 U de MNase para 1 x 106 células em 200 μL) oferece o ponto de partida mais promissor para digestãos preparativas em experimentos de Micro-C. No entanto, uma concentração intermediária de MNase entre as condições utilizadas para as amostras na faixa 3 e na faixa 4 (correspondendo a 5 U de MNase para 1 x 106 células em 200 μL) também deve ser considerada. É importante ressaltar que a digestão da cromatina com MNase não pode ser dimensionada linearmente, e não é recomendado aumentar a digestão preparativa mais de 4x. Para preparar bibliotecas Micro-C de mais de 1 x 10 6 células, é aconselhável digerir a cromatina em alíquotas de 1 x 106 células e agrupá-las após a inativação da MNase.
Para avaliar o sucesso do protocolo de ligadura de proximidade, o controle de entrada, que é digerido por MNase e não ligado por proximidade (passo 3.8), deve ser comparado com a amostra ligada à proximidade (passo 5.3) por eletroforese em gel de agarose a 1,5% (Figura 1B). A banda mononucleossomal ligada à proximidade tem um tamanho aproximado de 300 pb, semelhante ao dos dinucleossomos. Portanto, a razão de sinal da banda mono para di- nucleossomal deve mudar de predominantemente mononucleossomos (Lane 1) para di-nucleossomos (Lane 3 e Lane 4). Como o gel de agarose nesta etapa é o DNA dinucleossomal que é excisado e purificado, dividir as amostras em várias faixas é aconselhável para evitar a sobrecarga de carga.
Recomenda-se avaliar a qualidade e a quantidade da biblioteca de sequenciamento preparada por PCR mínimo. Aqui, o DNA de 1 μL de contas (1/20 da amostra total) é amplificado por 16 ciclos em 10 μL de reação de PCR. A concentração total da biblioteca mínima de PCR normalmente varia de 50-500 ng após 16 ciclos de PCR. Em teoria, isso corresponde a uma biblioteca de 1-10 μg da amostra restante de 19 μL se ela também fosse amplificada por 16 ciclos. Recomenda-se usar o número mínimo de ciclos de PCR necessários para gerar uma biblioteca de aproximadamente 100 ng a partir do DNA total. Assumindo amplificação logarítmica na PCR, a concentração teórica do DNA obtido a partir da entrada de 19 μL em 16 ciclos pode ser dividida sucessivamente por dois para calcular o número de ciclos de PCR necessários para gerar uma biblioteca de 100 ng. Por exemplo, um rendimento de 100 ng de 1 μL após 16 ciclos corresponde a um rendimento de 1.900 ng amplificado a partir de 19 μL. Nesse cenário, 12 ciclos devem idealmente gerar uma biblioteca de sequenciamento de 118 ng a partir do DNA total (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). A amostra restante de 9 μL da PCR mínima pode então ser usada para avaliar a qualidade da biblioteca por eletroforese em gel de agarose (Figura 1C). A visualização deve mostrar uma banda distinta a 420 pb e nenhuma banda para dímeros adaptadores (120 pb). Fragmentos menores também podem aparecer, e estes correspondem a iniciadores de PCR não utilizados.
Em seguida, recomenda-se analisar e confirmar a preparação bem-sucedida de amostras Micro-C por meio de sequenciamento de baixa entrada antes de se comprometer com o sequenciamento profundo com uso intensivo de recursos. Normalmente, as bibliotecas são sequenciadas a uma profundidade de leitura de 5 x 106 a 1 x 107 e avaliadas com base nos seguintes critérios: a taxa de duplicação de leitura de sequenciamento, a taxa de interação cis- versus transcromossômica e a frequência de orientação de leitura de sequenciamento. As bibliotecas Micro-C são processadas com o Distiller, um pipeline de serviço completo que processa os dados de sequenciamento de arquivos de leitura (formato Fastq) para arquivos de pares de leitura (formato Bedpe) e matrizes de interação escaláveis (formatos Cool e Mcool) usando cooler, pairtools e cooltools10,11,12. O pipeline também gera um arquivo de resumo que é ideal para avaliar a qualidade das bibliotecas Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). A taxa de duplicação de PCR fornece informações sobre a complexidade da biblioteca de sequenciamento e pode ser extraída do arquivo *.stats gerado. Bibliotecas Micro-C de alta qualidade têm taxas de duplicação de PCR inferiores a 5%-10% quando geradas a partir de 5 milhões ou mais células. Notavelmente, algumas plataformas de sequenciamento geram duplicatas de PCR durante a formação do cluster, independentemente da complexidade da biblioteca de sequenciamento. A Figura 2A mostra as taxas de duplicação relativa de dois experimentos: um que consideramos uma amostra boa e outra amostra ruim. Neste exemplo, ambos os exemplos exibiram taxas de mapa aceitáveis. Os próximos critérios para avaliar a qualidade das bibliotecas Micro-C são a razão cis versus trans e as frequências de orientação de leitura. Dentro do núcleo, os cromossomos habitam territórios cromossômicos individuais e, portanto, raramente interagem com outros cromossomos. Uma alta taxa de interações transcromossômicas detectadas indica uma alta taxa de ligações aleatórias. Ressalta-se que, nesse nível de análise, a amostra ruim apresentou alta taxa de interações transcromossômicas em relação à amostra boa (Figura 2B). Para Micro-C, uma taxa de interação cis-cromossômica de 70% ou mais é desejável.
Uma biblioteca Micro-C tem um tamanho de fragmento semelhante à banda de DNA dinucleossomal, que pode co-purificar com a amostra ligada de proximidade e contaminar o experimento. Esses contaminantes são sempre interações cromossômicas cis. Portanto, é importante avaliar também as taxas de orientação de leitura. A taxa de contaminação dinucleossômica pode ser estimada por sequenciamento de baixa entrada. O DNA dinucleossomal provém de dois nucleossomos vizinhos que não foram clivados pela MNase. Assim, as leituras de sequenciamento resultantes sempre exibirão uma orientação de leitura para frente e para trás (F e R), e a distância entre os pares de leitura será de cerca de 320 pb. Fragmentos ligados por proximidade, em comparação, podem ser ligados em quatro orientações, produzindo pares de leitura com F-R, R-R, R-F e F-F, idealmente com igual abundância (Figura 2C). Além disso, eles exibem várias distâncias entre os dois pares de leitura. Para estimar a quantidade de contaminantes dinucleossomais, a frequência das orientações de leitura pode ser calculada a partir dos arquivos *stats gerados pelo destilador (Figura 2D). Notadamente, neste trabalho, a fração de leitura de F-R (vermelho) foi maior na amostra ruim em relação à amostra boa, e isso se tornou mais evidente quando as orientações de leitura foram estratificadas por distância (Figura 2E). A fração F-R é dominada por fragmentos dinucleossomais em comparação com bibliotecas Micro-C quando os pares de leitura são estratificados em leituras com distâncias &lt;562 pb ou ≥562 pb. Aqui, a fração de leituras com distância &lt;562 pb é dominada por leituras F-R, enquanto a fração com distâncias ≥562 pb exibe uma distribuição uniforme entre as quatro orientações possíveis, indicando que a super-representação global de leituras F-R deriva de contaminantes dinucleossomais. A escolha de 562 bp como limite para subconfiguração é definida pelo binning no arquivo *stats gerado. Embora não seja necessário para esse controle de qualidade, uma subconfiguração mais definida pode ser obtida extraindo as distâncias do arquivo *pairs, que também é gerado pelo destilador. É importante notar que as leituras dinucleossômicas não diminuem a qualidade da amostra de Micro-C, pois podem ser identificadas e ignoradas durante o processamento de dados. No entanto, eles não contêm informações valiosas sobre interações 3D e diluem as leituras informativas.
Assim, a titulação cuidadosa da MNase e o controle de qualidade minucioso com sequenciamento de baixa entrada são as melhores ferramentas para otimizar a qualidade dos experimentos Micro-C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Figura 1: Estágios intermediários do protocolo Micro-C . (A) Eletroforese em gel de agarose da cromatina de 2,5 x 105 células ES de camundongo digeridas com concentrações variáveis de MNase. As bandas mono, di e trinucleossômicas são indicadas por setas. M: Escada de DNA (Faixa 1/6); 10 U de MNase por 250.000 células (Faixa 2); 2,5 U de MNase por 250.000 células (Faixa 3); 0,625 U de MNase por 250.000 células (Faixa 4); 0,156 U de MNase por 250.000 células (Faixa 2). (B) A eletroforese em gel de agarose a 1,0% das amostras preparadas com Micro-C (Faixa 3 e Faixa 4) e o controle de entrada digerido pela MNase (Faixa 1). A faixa 1 e a faixa 2 (M: escada de DNA) são aprimoradas para enfatizar a mudança relativa na intensidade do fragmento mono a dinucleossomal. As bandas mono e dinucleossomal são indicadas por setas. A banda dinucleossomal na amostra ligada à proximidade combina DNA dinucleossomal e biblioteca Micro-C. (C) A eletroforese em gel de agarose a 1,0% das bibliotecas de sequenciamento Micro-C amplificada a partir de amostra de 1 μL para avaliar a qualidade. Faixa 1 (M): Escada de DNA; Faixa 2 (S): Biblioteca Mirco-C. (D) Rastreio do Analisador de Fragmentos da biblioteca Micro-C final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Figura 2: Estatísticas amostrais para o sequenciamento de baixa entrada de uma amostra boa e uma amostra ruim . (A) Gráfico de barras da porcentagem mapeada (verde) e não mapeada (vermelho) lida. (B) Fração normalizada de leituras mapeando interações cis e transcromossômicas. Os conjuntos de dados foram normalizados para a leitura do mapeamento cis. As leituras do mapeamento cis foram estratificadas pela distância entre a primeira e a segunda leituras das amostras sequenciadas pareadas: ≤1 kbp (amarelo), &gt;1 kbp e ≤10 kbp (laranja) e &gt;10 kbp (vermelho). (C) Esquema das espécies moleculares potenciais com os tamanhos dinucleossomais. (D) Porcentagens de orientações de pares de leitura de todas as leituras da amostra boa e da amostra ruim. (E) O mesmo que o painel (D), mas estratificado por distâncias (esquerda, &lt;562 pb e direita, ≥562 pb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT de 100 mM</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Mistura mestre Micro-C 1. Composição da mistura mestre para a reação mastigatória final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotina-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotina-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>Mistura de 10 mM de dTTP e dGTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x T4 DNA Ligase Tampão</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200x BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Micro-C master mix 2. Composição da mistura mestre para a reação de marcação final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr><tr><td>10x tampão de reação NEB T4 Ligase</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Mistura mestre Micro-C 3. Composição da mistura mestre para a reação de ligadura de proximidade.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1x</td>
			<td>4,4x</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 1,1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>Nuclease ExoIII</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 4: Mistura mestre Micro-C 4. Composição da mistura mestre para a reação de remoção de biotina.

Um protocolo para mapeamento da organização tridimensional do genoma com resolução de nucleossomos usando o método de captura de conformação cromossômica Micro-C-XL é apresentado aqui.

Mapeando interações do genoma 3D de mamíferos com Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Este protocolo é significativo, pois mostra loops cromossômicos de alta resolução e outros recursos de interação de curto alcance. A principal vantagem desta técnica é o mapeamento da organização do genoma 3D com resolução nucleossômica com alta relação sinal-ruído. Para realizar a titulação da MNase, descongelar uma pastilha de uma vez 10 até a sexta célula sobre gelo por 10 minutos, ressuspender as células em 500 microlitros de DPBS e incubar a suspensão celular em gelo por 20 minutos.Recolher as células por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em 500 microlitros de buffer MB Número um. Descongelar um frasco de 20 unidades por microlitro de MNase e diluí-lo com Tris 10 milimolares para as condições de digestão descritas no texto.Com intervalos de tempo apropriados de 10 a 20 segundos, adicione um microlitro da primeira solução de digestão de MNase a um dos tubos das quatro amostras, vortex e incube em um ThermoMixer a 37 graus Celsius por 10 minutos a 800 RPM. Continue adicionando um microlitro das diluições de MNase restantes às outras alíquotas celulares. Pare a digestão da MNase adicionando 200 microlitros de tampão de parada recém-preparado a cada tubo na mesma ordem e no mesmo intervalo de tempo em que a MNase foi adicionada.Incubar a 65 graus Celsius por duas horas. Adicione 500 microlitros de PCI a cada amostra e misture bem por vórtice. Centrifugar a 19, 800 G por cinco minutos à temperatura ambiente para separar as fases.E transferir a fase aquosa para novos tubos. Purificar o DNA usando um kit comercial de purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante e eluir as amostras em 12 microlitros de tampão de eluição. Adicione dois a cinco microlitros de corante de carga à amostra de DNA purificada.Execute as amostras em um gel de agarose a 1,5% e escolha o melhor grau de digestão para o experimento. Um grau ótimo de digestão exibe pouco ou nenhum fragmento subnucleossomal, e uma proporção de 70 a 90% mono para dinucleossomo. Nesta amostra representativa, um grau intermediário de digestão entre as pistas três e quatro foi selecionado para os experimentos de acompanhamento.Com base na titulação da MNase, digerir a cromatina adicionando a quantidade adequada de MNase a cada alíquota da amostra. Misture bem e incube no ThermoMixer a 37 graus Celsius, 800 RPM por 10 minutos. Pare a digestão da MNase adicionando 1,6 microlitros de EGTA 0,5 molar a cada alíquota e incube em um ThermoMixer a 65 graus Celsius por 10 minutos com agitação de 800 RPM.Recolher a amostra por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Ressuspender o pellet de célula em 500 microlitros de tampão 1X NEB 2.1. Agrupar amostras equivalentes a uma entrada de cinco vezes 10 para a sexta célula ou menos para processamento posterior.Antes de proceder à ligadura de proximidade, transfira 10% da amostra como controle de entrada para monitorar o nível de digestão da MNase. Adicione 150 microlitros de Tris 10 milimolares, 25 microlitros de SDS 10% e 25 microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K ao controle da digestão e incube durante a noite a 65 graus Celsius. Recolher a amostra restante por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.Ressuspenda o pellet em 90 microlitros de Micro-C master mix one recém-preparado e incube em um ThermoMixer a 37 graus Celsius, 800 RPM por 15 minutos. Adicione 10 microlitros de cinco unidades por microlitro de fragmento de Klenow e incube em um ThermoMixer. Em seguida, adicione 100 microlitros de Micro-C master mix two recém-preparado.Incubar por 45 minutos a 25 graus Celsius, 800 RPM, e extinguir a reação enzimática com EDTA conforme descrito no texto. Incubar em um Termomisturador por 20 minutos a 65 graus Celsius, 800 RPM. Recolher a amostra por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.Ressuspender a amostra em 500 microlitros da mistura mestra Micro-C recém-preparada e incubar por 2,5 horas à temperatura ambiente de 15 a 20 RPM. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda a amostra em 200 microlitros da mistura mestra Micro-C recém-preparada quatro e incube em um ThermoMixer regulado a 37 graus Celsius por 15 minutos a 800 RPM.Para reticulação reversa e desproteinação, adicione 25 microlitros de 20 miligramas por microlitro de proteinase K e 25 microlitros de SDS 10% à amostra e incube a 65 graus Celsius durante a noite com mistura intermitente. Adicione 500 microlitros de PCI às amostras e controle de entrada, em seguida, misture por vórtice. Separe as fases por centrifugação a 19, 800 G por cinco minutos e transfira a fase aquosa superior para um tubo fresco.Concentrar o DNA e eluir as amostras em 30 microlitros, e os controles de entrada em 15 microlitros. Execute um gel de agarose a 1,5% para separar os mononucleossomos e dinucleossomos. Excise os fragmentos de DNA que têm um tamanho dinucleossomal e extraia o DNA conforme descrito no texto.Adicionar 150 microlitros de contas pré-preparadas a 150 microlitros da amostra e incubar à temperatura ambiente. Coloque os tubos em um ímã apropriado e aguarde até que a solução se limpe. Retire o sobrenadante e ressuspenda as contas em 300 microlitros de 1X TBW, e repita esta etapa.Repita a separação magnética e, após a solução limpar, remova o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 100 microlitros de TE0,1X TE. Repita e ressuspenda em 50 microlitros de 0,1X TE. Transfira a solução para tubos de PCR e realize a manipulação do DNA conforme descrito no texto. Após a ligadura do adaptador, lave a amostra em 1X TBW, descarte o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 20 microlitros de 0,1X TE. Otimize o número de ciclos de PCR e amplie as bibliotecas de sequência conforme descrito no texto. Cromatina de 250.000 células por reação foi digerida com uma diluição de quatro vezes de MNase.A maior concentração, 10 unidades, mostrou cromatina superdigerida quase exclusivamente consistindo de DNA mononucleossomal. A digestão de 250.000 células ES de camundongo com 0,625 unidades de MNase ofereceu o ponto de partida mais promissor para digestãos preparativas em experimentos de Micro-C. No entanto, uma concentração intermediária de MNase entre as condições mostradas nas faixas três e quatro, correspondendo a cinco unidades por 1 milhão de células, deve ser considerada.A banda de mononucleossomos ligados por proximidade tinha um tamanho aproximado de 300 pares de bases, semelhante ao dos dinucleossomos. Portanto, a razão de sinal da banda mono para dinucleossomal mudou de predominantemente mononucleossomos para dinucleossomos. A qualidade e a quantidade da biblioteca de sequenciamento preparada foram avaliadas por PCR mínimo.A visualização mostrou uma banda distinta em 420 pares de bases, e nenhuma banda para dímeros adaptadores. Enquanto ambas as amostras deste estudo apresentaram altas taxas de mapas, a amostra boa apresentou maior fração de leituras cis. Uma alta taxa de interações transcromossômicas indica eventos de ligadura aleatória, embora algumas interações transcromossômicas possam ser importantes.Além disso, a boa amostra apresentou uma taxa moderada de pares de leitura de mapeamento reverso-reverso, com distâncias inferiores a 500 pares de base. Isso indicou uma baixa taxa de dinucleossomos não clivados pela MNase com tamanho semelhante a dois nucleossomos ligados por proximidade. Um grau adequado de digestão da MNase é crucial para este experimento.Nucleossomos superdigeridos são ligados ineficientemente, e a cromatina subdigerida tem uma grande fração de dinucleossomos não digeridos que podem contaminar a biblioteca de sequenciamento. O Micro-C pode ser combinado com uma abordagem de captura para mapear a organização do genoma locus-específico com resolução enormemente alta.

mapping-mammalian-3d-genome-interactions-with-micro-c-xl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

O associado armadilha cromossomo ensaio (ACT) é um novo método imparcial para identificar as interações de longo alcance DNA. A caracterização das interações DNA de longo alcance nos permitirá determinar a relação da arquitetura nuclear para a expressão do gene em ambos os fisiologia normal e em estados doente.

Armadilha cromossomo associados para Identificar Interações de longo alcance DNA

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

Identificar os alvos diretos de moléculas-alvo do genoma permanece um grande desafio. Para compreender como as moléculas de ligação de ADN envolver o genoma, foi desenvolvido um método que se baseia em ligação cruzada de moléculas pequenas para isolar cromatina (cósmica).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.

Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Aprenda a mapear a organização tridimensional do genoma em resolução de nucleossomo usando a técnica Micro-C-XL. Este método oferece alta relação sinal-ruído para estudos detalhados de interações cromossômicas de curto alcance.

Mapeando interações do genoma 3D de mamíferos com Micro-C-XL

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