Name: Pupilometria para Avaliar a Sensação Auditiva em Cobaias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a usar pupilometria para avaliar sensação auditiva em cobaias. Este método não invasivo quantifica reconhecimento de sons complexos, permitindo estudar efeitos da perda auditiva em modelos animais.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01DC017141), pela Pennsylvania Lions Hearing Research Foundation e por fundos dos Departamentos de Otorrinolaringologia e Neurobiologia da Universidade de Pittsburgh.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo demonstra o uso da pupilometria como método não invasivo e confiável para estimar limiares auditivos em animais ouvintes passivos. Seguindo o protocolo aqui descrito, foram estimados os limiares de categorização call-in-noise em GPs ouvintes normais. Os limiares estimados por meio da pupilometria mostraram-se consistentes com os obtidos com o treinamento operante62. Em comparação com o treinamento operante, no entanto, o protocolo de pupilometria foi relativamente simples e rápido d...

O diâmetro da pupila (DP) pode ser afetado por um grande número de fatores e a medida da DP que muda ao longo do tempo é conhecida como pupilometria. A DP é controlada pelo músculo do esfíncter da íris (envolvido na constrição) e pelo músculo dilatador da íris (envolvido na dilatação). O músculo de constrição é inervado pelo sistema parassimpático e envolve projeções colinérgicas, enquanto o dilatador da íris é inervado pelo sistema simpático envolvendo projeções noradrenérgicas e colinérgicas 1,2,3. O estímulo mais conhecido para induzir alterações da DP é a luminância-constrição e as respostas de dilatação da pupila podem ser produzidas por variações na intensidade da luz ambiente2. A DP também muda em função da distância focal2. Sabe-se há décadas, no entanto, que a DP também apresenta flutuações não relacionadas à luminância 4,5,6,7. Por exemplo, mudanças nos estados mentais internos podem provocar alterações transitórias da DP. A pupila dilata-se em resposta a estímulos emocionalmente carregados ou aumenta com a excitação 4,5,8,9. A dilatação da pupila também pode estar relacionada a outros mecanismos cognitivos, como o aumento do esforço mental ou da atenção10,11,12,13. Devido a essa relação entre as variações do tamanho da pupila e os estados mentais, as alterações da DP têm sido exploradas como marcadores de distúrbios clínicos como esquizofrenia 14,15, ansiedade16,17,18, doença de Parkinson 19,20 e doença de Alzheimer 21 , entre outros. Em animais, as alterações da DP acompanham estados comportamentais internos e estão correlacionadas com os níveis de atividade neuronal em áreas corticais 22,23,24,25. O diâmetro da pupila também demonstrou ser um indicador confiável do estado de sono em camundongos26. Essas mudanças de DP relacionadas à excitação e ao estado interno geralmente ocorrem em longas escalas de tempo da ordem de várias dezenas de segundos.
No domínio da pesquisa auditiva, tanto na audição normal quanto em indivíduos com deficiência auditiva, o esforço auditivo e a percepção auditiva têm sido avaliados por meio da pupilometria. Esses estudos geralmente envolvem sujeitos de pesquisa treinados27,28,29,30 que realizam vários tipos de tarefas de detecção ou reconhecimento. Devido à relação supracitada entre excitação e DP, o aumento do engajamento da tarefa e do esforço de escuta tem se mostrado correlacionado com o aumento das respostas de dilatação pupilar 30,31,32,33,34,35. Assim, a pupilometria tem sido utilizada para demonstrar que o aumento do esforço de escuta é despendido para reconhecer a fala espectralmente degradada em ouvintes normo-ouvintes29,36. Em ouvintes com deficiência auditiva, como humanos com perda auditiva relacionada à idade 27,30,37,38,39,40,41 e usuários de implante coclear 42,43, as respostas dos alunos também aumentaram com a diminuição da inteligibilidade de fala; no entanto, os ouvintes com deficiência auditiva apresentaram maior dilatação pupilar em condições de escuta mais fáceis em comparação com os indivíduos normo-ouvintes 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Mas experimentos que exigem que o ouvinte execute uma tarefa de reconhecimento nem sempre são possíveis - por exemplo, em bebês ou em alguns modelos animais. Assim, as respostas não relacionadas à luminância das pupilas evocadas por estímulos acústicos poderiam ser um método alternativo viável para avaliar a detecção auditiva nesses casos44,45. Estudos anteriores demonstraram uma dilatação pupilar transitória e ligada a estímulos como parte do reflexo orientador46. Estudos posteriores demonstraram o uso de dilatações pupilares ligadas a estímulos para derivar curvas de sensibilidade de frequência em corujas47,48. Recentemente, esses métodos foram adaptados para avaliar a sensibilidade da resposta de dilatação da pupila em lactentes humanos48. A pupilometria tem se mostrado uma abordagem confiável e não invasiva para estimar os limiares de detecção e discriminação auditiva em cobaias (GPs) que ouvem passivamente, utilizando uma ampla gama de estímulos simples (tons) e complexos (vocalizações GP)49. Essas alterações de DP relacionadas ao estímulo geralmente ocorrem em escalas de tempo mais rápidas da ordem de vários segundos e estão ligadas ao tempo do estímulo. Aqui, a pupilometria de alterações da DP relacionadas a estímulos é proposta como um método para estudar os impactos comportamentais de vários tipos de deficiência auditiva em modelos animais. Em particular, os protocolos de pupilometria para uso em GPs, um modelo animal bem estabelecido de vários tipos de patologias auditivas 50,51,52,53,54,55,56 (ver também a referência 57 para uma revisão exaustiva) é descrito.
Embora esta técnica seja demonstrada em clínicos gerais de audição normal, esses métodos podem ser facilmente adaptados a outros modelos animais e modelos animais de várias patologias auditivas. É importante ressaltar que a pupilometria pode ser combinada com outras medidas não invasivas, como o EEG, bem como com registros eletrofisiológicos invasivos, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a possíveis déficits de detecção e percepção sonora. Finalmente, essa abordagem também pode ser usada para estabelecer amplas semelhanças entre modelos humanos e animais.

<table><tbody><tr><td>Placa de saída analógica</td><td>Measurement Computing Corporation, Norton, MA</td><td>PCI-DDA02/12</td><td></td></tr><tr><td>Espuma anecóica</td><td>Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfone condensador</td><td>Behringer, Willich, Alemanha</td><td>C-2</td><td></td></tr><tr><td>Microfone de campo livre</td><td>Bruel & Kjaer, Dinamarca)&nbsp;</td><td>Tipo 4940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td>Versão 2018a</td></tr><tr><td>Câmera remota monocular e sistema iluminador</td><td>Arrington Research, Scottsdale, AZ</td><td>MCU902</td><td>Matriz LED infravermelha + câmera com filtro infravermelho</td></tr><tr><td>Dispositivo de E/S multifuncional&nbsp;</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>PCI-6229</td><td></td></tr><tr><td>Processador de interface neural</td><td>Ripple Neuro, Salt Lake City, UT</td><td>SCOUT</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de movimento piezoelétrico</td><td>SparkFun Electronics, Niwot, CO</td><td>SEN-10293</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de aperto&nbsp;</td><td>Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL</td><td>EW98302-02</td><td></td></tr><tr><td>Atenuador programável</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL</td><td>PA5</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de silício</td><td>Cole-Parmer</td><td></td> <td>~ 3 mm</td></tr><tr><td>Câmara de atenuação de som</td><td>IAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alto-falante acústico Driver de faixa completa Alto-falante</td><td>Tang Band, Taipei, Taiwan</td><td>W4-1879</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador estéreo</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL</td><td>SA1</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop - CleanTop Controle óptico</td><td>de vibração TMC / Ametek, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de ponto de vista</td><td>ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pupilometria para avaliar a sensação auditiva em cobaias

Pupillometry to Assess Auditory Sensation in Guinea Pigs

A exposição ao ruído é uma das principais causas de perda auditiva neurossensorial. Modelos animais de perda auditiva induzida por ruído geraram uma visão mecanicista sobre as patologias anatômicas e fisiológicas subjacentes da perda auditiva. No entanto, relacionar déficits comportamentais observados em humanos com perda auditiva com déficits comportamentais em modelos animais permanece desafiador. Aqui, a pupilometria é proposta como um método que permitirá a comparação direta de dados comportamentais animais e humanos. O método baseia-se em um paradigma excêntrico modificado - habituando o sujeito à apresentação repetida de um estímulo e apresentando intermitentemente um estímulo desviante que varia de alguma forma paramétrica do estímulo repetido. A premissa fundamental é que, se a mudança entre o estímulo repetido e desviante for detectada pelo sujeito, ela desencadeará uma resposta de dilatação da pupila maior do que a provocada pelo estímulo repetido. Essa abordagem é demonstrada por meio de uma tarefa de categorização de vocalização em cobaias, modelo animal amplamente utilizado em pesquisas auditivas, inclusive em estudos de perda auditiva. Ao apresentar vocalizações de uma categoria de vocalização como estímulos padrão e uma segunda categoria como estímulos excêntricos embutidos no ruído em várias relações sinal-ruído, demonstra-se que a magnitude da dilatação da pupila em resposta à categoria excêntrico varia monotonicamente com a relação sinal-ruído. As análises da curva de crescimento podem então ser usadas para caracterizar o curso do tempo e a significância estatística dessas respostas de dilatação da pupila. Neste protocolo, são descritos procedimentos detalhados para aclimatar cobaias à configuração, realizar pupilometria e avaliar/analisar dados. Embora esta técnica seja demonstrada em cobaias ouvintes normais neste protocolo, o método pode ser utilizado para avaliar os efeitos sensoriais de várias formas de perda auditiva dentro de cada sujeito. Esses efeitos podem então ser correlacionados com medidas eletrofisiológicas concomitantes e observações anatômicas post-hoc.

A pupilometria foi realizada em três GPs pigmentados do sexo masculino, pesando ~600-1.000 g ao longo dos experimentos. Conforme descrito neste protocolo, para estimar os limiares de categorização call-in-noise, um paradigma excêntrico foi utilizado para a apresentação do estímulo. No paradigma excêntrico, chamadas pertencentes a uma categoria (wheeks) embutidas em ruído branco em um determinado SNR foram empregadas como estímulos padrão (Figura 2A), e chamadas de outra categoria (wheeks) embutidas em ruído branco no mes...

A pupillometry, uma técnica simples e não invasiva, é proposta como método para determinar limiares auditivos com ruído em animais normo-ouvintes e modelos animais de várias patologias auditivas.

Pupilometria para Avaliar a Sensação Auditiva em Cobaias

Noise exposure is a leading cause of sensorineural hearing loss. Animal models of noise-induced hearing loss have generated mechanistic insight into the ...

A pupilometria pode ser usada para estimar limiares complexos de reconhecimento sonoro e, combinada com outros métodos, pode ser usada para determinar os efeitos de várias formas de perda auditiva nesses limiares. Esta técnica pode ser usada para caracterizar dados da mesma modalidade de seres humanos e de animais não treinados. É relativamente fácil de configurar e minimamente invasivo.Medidas de comportamento e percepção são difíceis de obter em modelos animais de perda auditiva. Este método é uma maneira de quantificar comportamentos complexos de reconhecimento sonoro em animais. Como fazemos todos os experimentos comportamentais com animais, a paciência é a chave.Aproveite o tempo para acostumar o animal à configuração experimental. Mantenha as sessões experimentais curtas e monitore o animal de perto. Para começar, monte um alto-falante calibrado na parede da câmara atenuada de som a uma altura igual à posição em que o animal será colocado.Para a entrega de estímulos de campo livre, coloque o animal no recinto garantindo que grandes movimentos corporais não sejam possíveis e fixe a cabeça do animal na estrutura rígida. Coloque um sensor piezoelétrico sob o gabinete para detectar e registrar os movimentos dos animais. Em seguida, posicione a câmera de imagem da pupila a uma distância de 25 centímetros do olho do sujeito.Para configurar o sopro de ar, use um suporte preso à mesa para colocar uma ponta de pipeta a cerca de 15 centímetros na frente do focinho do animal. Conecte um tubo de silicone de cerca de três milímetros de diâmetro à ponta da pipeta e conecte o tubo a um cilindro de ar regulado. Mantenha a pressão de ar do cilindro entre 20 e 25 psi.E passe o tubo através de uma válvula de pinça para controlar o tempo e a duração do sopro de ar, usando um relé controlado por computador. Ilumine o olho com uma matriz de LED infravermelho colocada a cerca de 10 centímetros de distância. Use iluminação LED branca a uma intensidade de cerca de 2000 candelas por metro quadrado para iluminar o olho fotografado e trazer o diâmetro da pupila basal para cerca de 3,5 milímetros.Abra o software de aquisição da pupila e adquira o vídeo da pupila usando uma câmera com uma lente de 16 milímetros com uma resolução espacial de um ângulo visual de 0,15 graus e um filtro infravermelho colocado a uma distância de 25 centímetros do olho fotografado. Certifique-se de que o olho está centrado na área da imagem. Regule a abertura e o foco da câmera, bem como o nível de infravermelho, até que o contorno da pupila fotografada esteja em foco nítido.No software de aquisição da pupila, defina a área de interesse que contém a pupila selecionando uma área retangular com o mouse. Em seguida, use o painel de controles para ajustar o brilho e o contraste do vídeo adquirido. Defina a densidade de varredura como cinco e ajuste o limite de modo que o ajuste da elipse corresponda de perto ao contorno da pupila no vídeo.Usando o software do processador de interface neural, adquira e salve o sinal analógico do diâmetro da pupila ou traço PD, o traço de tensão do movimento de gravação do sensor piezoelétrico, os tempos de entrega do estímulo e os tempos de entrega do sopro de ar. Selecione oito exemplos diferentes de vocalizações de cobaias de comprimentos semelhantes de duas categorias diferentes de vocalizações. Por exemplo, chamadas wheek e chamadas de lamentação.Uma categoria servirá como estímulo padrão e a outra categoria servirá como estímulos excêntricos ou desviantes. Para gerar um segundo de estímulos padrão e desviantes de comprimento embutidos no ruído em diferentes níveis de relação sinal-ruído ou SNR, adicione ruído branco de igual comprimento às chamadas. A gama de SNRs amostrados neste experimento está entre menos 24 e mais 40 decibéis.Para cada sessão, prepare uma sequência de apresentação de estímulos pseudoaleatórios que contenha estímulos padrão superiores a 90% do tempo. Certifique-se de que entre estímulos desviantes haja pelo menos 20 a 40 tentativas com estímulos padrão. Use uma intensidade de estímulo fixa para todas as apresentações de estímulo.Apresente os estímulos com alta regularidade temporal. Para manter o envolvimento do animal com os estímulos e minimizar a habituação, opcionalmente dê um breve sopro de ar após o estímulo desviante. Certifique-se de que o início do sopro de ar esteja suficientemente separado da duração do estímulo para que o estímulo evoque as respostas de dilatação da pupila.Alcance um pico antes que os artefatos de piscar induzidos por sopro de ar. Execute o código pupil_avg_JOVE_m e selecione o arquivo de dados de uma única sessão na caixa de diálogo pop-up para executar a detecção de movimento e a exclusão de avaliação para cada sessão. Em seguida, execute o mesmo código e selecione todos os arquivos de dados a serem analisados na caixa de diálogo pop-up.Para remover artefatos de piscar os olhos, pré-processe os dados e obtenha a dilatação média da pupila para cada estímulo nas sessões. A média das mudanças no diâmetro da pupila evocado pelo estímulo para cada condição de estímulo em todas as sessões dentro de cada animal e, em seguida, entre os animais para gerar a resposta média de dilatação da pupila a cada condição de estímulo. Concatena verticalmente todas as saídas do código pupil_avg_JOVE.m ou todas as sessões animais, SNRs e atenuações para construir uma matriz contendo as colunas, identificação animal, SNR, nível sonoro e valores de diâmetro da pupila. Para cada SNR, plote os pesos correspondentes ao intercepto para visualizar os resultados. Faça o mesmo para termos lineares e quadráticos.Coloque toda a porcentagem de sessões sábias de ensaios com mudanças significativas na pupila em cada célula de uma matriz de células, onde as células são organizadas de SNR inferior para superior. Usando o código pupil_threshold_estimate_JOVE_m, estime o limite de categorização de chamada no ruído. As respostas médias dos alunos de três animais são mostradas nesta figura.As respostas médias das pupilas aos estímulos padrão do lamento são representadas pela linha azul e o sombreamento corresponde a mais menos um erro padrão de média. Linhas de cinza e sombreamento correspondem à média e mais menos um erro padrão de média das respostas pupilares evocadas por estímulos desviantes wheek. A intensidade do sombreamento cinza corresponde ao SNR.A linha verde e o sombreamento correspondem ao traço médio da pupila no limiar SNR. A linha vertical vermelha corresponde ao início do estímulo. A linha vertical laranja corresponde ao início do sopro de ar e as linhas tracejadas azul-petróleo correspondem à janela da ACG.A função psicométrica ajustada à porcentagem de ensaios com alterações significativas do diâmetro da pupila provocadas pelo estímulo desviante em função do SNR é mostrada nesta figura. Bigodes correspondem a mais menos um erro padrão de média. Note-se que 50% do máximo é atingido a cerca de menos 20 decibéis SNR.Pelos dados adquiridos de alta qualidade, é importante aclimatar bem o animal à configuração experimental e manter condições constantes de eliminação. Mantenha a sessão de experimento curta para minimizar a habitação do animal aos estímulos desviantes. O EEG, ou registros eletrofisiológicos combinados com pupilometria, gerariam informações adicionais sobre os déficits neurais, déficits subjacentes de categorização de chamada em ruído em animais com deficiência auditiva.

pupillometry-to-assess-auditory-sensation-in-guinea-pigs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra como cirurgicamente obstruem o ducto endolinfático cobaia para produzir hydrops endolinfático.

Indução cirúrgica da hidropisia endolinfática por obliteração do ducto endolinfático

Habituação e prepulse inibição da startle são medidas operacionais de gating sensorial. Gating sensorial é interrompido na esquizofrenia, e alguns outros transtornos mentais e doenças neurodegenerativas. Nós aqui descrever um protocolo padrão para avaliar a habituação a curto prazo e longo prazo, bem como prepulse inibição de respostas de sobressalto acústico em ratos e camundongos.

Habituação e Prepulse Inibição de sobressalto acústico em Roedores

Um método rápido e barato para a determinação do comportamento de ouvir parâmetros como limiares auditivos, deficiência auditiva ou percepções fantasmas (zumbido subjetivo) é descrito. Ele utiliza pré-pulso de inibição da resposta de alarme acústico e pode ser facilmente implementado num computador pessoal, utilizando um programável AD / DA-conversor e um sensor piezo.

A configuração de Baixo Custo para audiometria comportamental em roedores

Este vídeo demonstra um método para registrar as respostas auditivas do tronco encefálico (ABRs) de filhotes de ratos. Ele descreve as etapas para colocação de eletrodos, aplicação de estímulo sonoro e análise de processamento de sinal no tronco encefálico para avaliar as respostas neurais.

Registrando as respostas auditivas do tronco encefálico em um filhote de rato

Fonte: Lee, D., et. al. Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e danos às células ciliadas externas. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra a medição da resposta auditiva do tronco encefálico (ABR) em um camundongo. Os eletrodos são colocados na cabeça, atrás da orelha e perto da cauda de um camundongo anestesiado. Estímulos acústicos em várias intensidades são entregues e os sinais elétricos gerados são...

Medindo a resposta auditiva do tronco encefálico em camundongos

Apresentamos uma técnica para administração localizada de drogas através da rota trans-timpânicas na cóclea. Entrega da droga através desta rota não iria interferir com a eficácia de anticâncer dos medicamentos quimioterápicos tais como a cisplatina.

Entrega de trans-timpânicas drogas para o tratamento da ototoxicidade

O objetivo do presente protocolo é fornecer um modelo animal de implante coclear, que pode ser usado para resolver uma infinidade de perguntas de pesquisa. As aplicações potenciais incluem a avaliação de intervenções farmacêuticas ou estimulação elétrica para efeitos benéficos sobre limiares auditivos ou impedâncias de eletrodo.

Implante coclear na cobaia

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer uma indução de perda auditiva condutora replicável por meio de punção cirúrgica da membrana de tympanic e verificação por visualização de otoscópio e avaliação comportamental por verino de gonorreia.

Indução cirúrgica simples da perda auditiva condutora com verificação usando a visualização do otoscópio e a resposta comportável do startle do clap no rato

Este artigo demonstra uma abordagem extradural para obliterar o saco endoglifático da cobaia e ferir o ducto endoglicêtico com uma picareta fina, a fim de induzir hidrops endolímfaticos experimentais.

Uma abordagem cirúrgica revisada para induzir hidrops endoglicêsticos na Cobaia

Porcos em miniatura (mini-porcos) são um modelo animal de grande porte ideal para a pesquisa de implantes cocleares. A cirurgia de implante coclear em mini-porcos pode ser utilizada para fornecer evidências iniciais da segurança e do desempenho potencial de novas matrizes de eletrodos e abordagens cirúrgicas em um sistema vivo semelhante aos seres humanos.

O Porco em Miniatura: Um Modelo Animal de Grande Porte para Pesquisa de Implante Coclear

Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.

Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas

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