Name: Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a injeção intra-cardíaca de células PC3 de câncer de próstata em camundongos para criar modelo de metástase óssea. Este método permite estudar mecanismos moleculares e testar terapias in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado por subsídios do Programa Nacional de P&&D da China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), da National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408), dos projetos de pesquisa dentro do orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047) e do Centro de Inovação Colaborativa de Xangai de Transformação Industrial da Preparação de MTC Hospitalar.

Camundongos machos BALB/c com seis a oito semanas de idade (n = 10) foram alojados em gaiolas de camundongos ventilados individualmente (5 camundongos/gaiola) em um biotério específico livre de patógenos (FPS) sob condições de ciclo claro/escuro de 12 h, com livre acesso à ração FPS e água estéril. Os camundongos foram alimentados adaptativamente por uma semana antes dos experimentos. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai.
1. Preparação celular
<ol><li>No dia da injeção de células de câncer de próstata, lavar 80%-90% de células PC-3 marcadas com luciferase confluente (PC-3-luciferase) cultivadas em uma placa de cultura de células de 10 cm com PBS estéril pré-frio (pH 7,4) duas vezes. Tripsinizar por 3 min com 1,5 mL de tripsina a 0,25% e coletar as células em um tubo centrífugo de 15 mL após a supressão da tripsina com 6 mL de meio F-12 contendo 10% de soro. NOTA: A linhagem celular PC-3-luciferase é derivada da linhagem PC-3 após ser transfectada com o vetor pLV-luciferase15.</li>
	<li>Use um contador automático de células e calcule a concentração celular transferindo 20 μL da suspensão celular para a placa de contagem de células (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar as células a 800 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min.</li>
	<li>Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet de célula em meio F-12 (ver Tabela de Materiais) para uma densidade celular final de 1 x 107 células/mL.</li>
	<li>Mantenha as células sempre congeladas até a injeção.</li>
	<li>Levar as células para a sala de cirurgia e terminar a injeção de células dentro de 2 h. NOTA: Prepare suspensões de células adicionais (geralmente volumes duplicados conforme necessário) para garantir doses de injeção precisas (por exemplo, para evitar os espaços mortos dentro das seringas).</li>
</ol>2. Cirurgia para injeção intra-cardíaca das células humanas do câncer de próstata
OBS: O aparato cirúrgico utilizado para injeção intracardíaca é uma seringa de 1 mL (Figura 1). Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento até a recuperação do animal da anestesia.
<ol><li>Mantenha o rato na sala de animais SPF. Realizar todos os procedimentos com aparelhos esterilizados dentro de um gabinete asséptico.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo usando isoflurano a 2% com oxigênio a 98% sob fluxo de oxigênio de 2 L/min. NOTA: Esfregue uma pequena quantidade de pomada oftálmica nos olhos do rato para evitar o ressecamento durante a anestesia. Realizar toda a cirurgia em uma área bem ventilada. Certifique-se de que o rato está profundamente anestesiado, beliscando os dedos dos pés do rato antes da injeção de células. Se as respostas (por exemplo, um empurrão ou contração) permanecerem, aguarde um tempo adicional para que a anestesia faça efeito.</li>
	<li>Coloque o camundongo em posição de supona e imobilize ambos os membros superiores perpendicularmente esticados para longe da linha média (Figura 2A).</li>
	<li>Imobilizar o camundongo do abdome para baixo com fita adesiva cirúrgica. Evitar pressionar com força e deslocar os órgãos internos (Figura 2B). NOTA: A manutenção da anatomia topográfica (isto é, a fixação com fita adesiva) é essencial, uma vez que a injeção intracardíaca é cega (ou seja, o local preciso da injeção no coração é invisível a olho nu).</li>
	<li>Desinfete a pele do tórax com um cotonete de etanol a 70%.</li>
	<li>Identificar o processo xifoide de camundongo na depressão na extremidade inferior do esterno médio palpando o meio da parede torácica anterior. Identificar a incisura jugular do rato na depressão central na borda superior do manúbrio, palpando-se a partir do meio da parede torácica anterior.</li>
	<li>Marcar o ponto mais inferior do processo xifoide e a incisura jugular com caneta marcadora (Figura 2A). Faça uma terceira marca no meio desses dois pontos e ligeiramente à direita (esquerda do animal) logo acima do coração no terceiro espaço intercostal. NOTA: O local de injeção é 1-2 mm à esquerda da linha média, e o ponto de injeção está entre a terceira e quarta costelas do mouse (Figura 2A).</li>
	<li>Carregar 200 μL da suspensão celular numa seringa de 1 ml. NOTA: Mantenha uma bolha de ar na seringa, como mostrado na Figura 2C, para garantir que o sangue está pulsando. A suspensão celular deve ser cuidadosamente misturada antes do carregamento.</li>
	<li>Inserir verticalmente uma agulha 26 G através do local da injeção (Figura 2D).</li>
	<li>Mantenha a mão segurando a seringa estável sobre a mesa, ou use a outra mão para segurá-la estável. Certifique-se de que o eixo longo da seringa é perpendicular ao local de injeção e introduza a seringa cerca de 2 mm por via subcutânea.</li>
	<li>A pulsação do sangue vermelho-vivo é visível no cubo da agulha e/ou na suspensão celular quando a ponta da agulha é inserida corretamente no ventrículo esquerdo. Se a pulsação do sangue for invisível, a ponta da agulha não está no coração. Retraia e substitua a agulha (caso a coagulação do sangue dentro da agulha pare a pulsação do sangue). Insira a agulha mais uma vez.</li>
	<li>Injete as células. Injete a suspensão celular (100 μL) muito lentamente ao longo de 40-60 s e mantenha a mão segurando a seringa estável o tempo todo. NOTA: Fique atento à suspensão celular na seringa e não injete a bolha de ar dentro da seringa no coração.</li>
	<li>Aplique pressão no local da injeção com um cotonete seco por 15 s para garantir a hemostasia quando a agulha estiver retraída.</li>
	<li>Devolva o rato à gaiola limpa e monitorize o animal até que recupere completamente da anestesia.</li>
	<li>Imagem do rato com um sistema de bioluminescência in vivo dentro de 24 h após a injeção para garantir que as células cancerosas entraram na circulação sistémica. NOTA: As células cancerosas injetadas corretamente entram na circulação arterial através do ventrículo cardíaco esquerdo, que é visto pela sinalização de bioluminescência visível em todo o corpo (por exemplo, ver Figura 3A).</li>
	<li>Realizar imagens de bioluminescência in vivo .<ol><li>Ligue o instrumento e o computador. Abra o software quando o indicador de energia no instrumento e no computador brilhar e, em seguida, abra a janela Aquisição de imagem .</li>
		<li>Identifique o sistema de imagem in vivo conectado ao computador no painel do dispositivo. Coloque o mouse a ser fotografado na câmara de imagem em posição supina. Em seguida, feche a porta da câmara de imagem.</li>
		<li>Defina os parâmetros no painel Configuração fornecido na janela Aquisição de Imagem .<ol><li>Defina os parâmetros com Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 e Lens > Iris > F 2.8 para tornar as imagens claras.</li>
			<li>Defina o canal de disparo em Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF e Filter&Light > Light Intensity > Middle.</li>
			<li>Defina o tipo de imagem a ser tirada: Imaging > Type > Single-Frame, Imaging > Exposure Time > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Clique no botão Adquirir para adquirir a imagem.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Visualize o crescimento do câncer metastático com bioluminescência in vivo . OBSERVAÇÃO: Em cada momento da visualização, injetar intraperitonealmente 200 μL do substrato de luciferina em um camundongo de 20 g (150 mg/kg) e aguardar 15 minutos antes da anestesia (isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 98% em uma câmara de indução). Coloque o mouse na plataforma do sistema de imagem de bioluminescência. Manter a anestesia através de máscara nasal com isoflurano a 2%.</li>
</ol>3. Investigação patológica
<ol><li>Quatro semanas após a injeção celular, sacrificar o camundongo por inalação de CO2 e, em seguida, luxação cervical.</li>
	<li>Imobilizar o rato em decúbito dorsal. Faça uma incisão vertical (cerca de 6 cm) do abdome ao tórax com tesoura cirúrgica para expor e examinar grosseiramente todos os órgãos do abdome e tórax em busca de lesões cancerígenas e/ou alterações patológicas. NOTA: Para um estudo de injeção de células cancerosas intracardíacas, lesões cancerígenas no mediastino adjacente ao coração sugerem células cancerosas injetadas incorretamente (células não injetadas no ventrículo cardíaco esquerdo); portanto, esses camundongos não são incluídos na coleta final de dados.</li>
	<li>Excisar os tumores metastáticos com tesoura. Medir os diâmetros longos (a) e curtos (b) do tumor usando paquímetros para calcular o volume tumoral (V) usando a fórmula V = 1/2 × a × b2, e pesar o tumor usando uma balança eletrônica.</li>
	<li>Fixar os tecidos tumorais em solução de formalina a 10% seguida de inclusão em parafina. Alternativamente, congelar os tumores em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Excisar os ossos (membros posteriores, vértebras e/ou costelas) com lesões metastáticas. Fixar o espécime de cada camundongo em um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução de formalina a 10% por 24 h após a remoção da pele e dos músculos, seguido de descalcificação por 14 dias em solução de EDTA a 10% com troca frequente de tampão (a cada 3 dias).</li>
	<li>Incluir o espécime em parafina e seccionar as amostras para exame histológico de rotina16.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cancerstatistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Cancerstatistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+complications+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal complications of malignancy.</a> Cancer. 80, 1588-1594 (1997).</li>
<li>Macedo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+metastases%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bone metastases: An overview.</a> Oncology Reviews. 11 (1), 321(2017).</li>
<li>Rea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+prostate+cancer+translational+research%3A+From+xenograft+to+PDX%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX.</a> BioMed Research International. 2016, 9750795(2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+GFP+intravital+imaging+of+the+differences+in+cellular+and+angiogenic+behavior+of+subcutaneous+and+orthotopic+nude-mouse+models+of+human+PC-3+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).</li>
<li>Stephenson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+model+for+human+prostate+cancer+using+orthotopic+implantation+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice.</a> Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal models of bone metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).</li>
<li>Corey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+osseous+prostate+cancer+models%3A+intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells.</a> The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).</li>
<li>Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cell+line+CWR22+elicits+osteoblastic+response+in+immunodeficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interactions%22%5BJournal%5D)">Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).</li>
<li>Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+inactivation+leads+to+multimodal+inhibition+of+prostate+cancer+cell+dissemination+in+a+preclinical+bone+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model.</a> International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).</li>
<li>Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+established+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Emerging and established models of bone metastasis.</a> Cancers. 10 (6), 176(2018).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+prostate+cancer+cell+line+%28Probasco%29+produces+osteoblastic+metastases+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo.</a> The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Brylka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+Metastases+in+immunocompromised+mice+after+intracardiac+injection+of+MDA-MB-231-SCP2+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells.</a> Cancers. 14 (3), 556(2022).</li>
<li>Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+is+a+more+potent+inhibitor+of+breast+cancer+metastasis+to+bone+and+related+osteolysis+than+EPA%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).</li>
<li>Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+mouse+models+of+human+prostate+cancer+and+their+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).</li>
<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cachexia%3A+mediators%2C+signaling%2C+and+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways.</a> Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-%CE%B2+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).</li>
<li>Talbot, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+body-weight+reduction+as+a+humane+endpoint%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal.</a> Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Yin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+blockade+inhibits+PTHrP+secretion+by+breast+cancer+cells+and+bone+metastases+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).</li>
<li>Schneider, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((turnover+mediates+preferential+localization+of+prostate+cancer+in+the+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton.</a> Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).</li>
<li>Padalecki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+18+suppresses+prostate+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Urologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases.</a> Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).</li>
</ol>

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata para gerar metástase óssea é um modelo de camundongo ideal para explorar as funções e mecanismos da metástase óssea do câncer de próstata e avaliar a eficácia terapêutica. Estudos têm demonstrado que o dano ósseo provavelmente ocorre na tíbia proximal e no fêmurdistal17, o que pode ser devido à sua alta vascularização e atividade metabólica.
Como a metástase óssea é uma lesão metastática frequentemente obs...

O câncer de próstata é o câncer mais frequente em homens em 112 países e ocupa o segundo lugar em mortalidade em países com maior índice de desenvolvimento humano 1,2. A maioria das mortes em pacientes com câncer de próstata é causada por metástase, e cerca de 65%-75% dos casos desenvolverão metástaseóssea3,4. Portanto, a prevenção e o tratamento das metástases ósseas do câncer de próstata são urgentemente necessários para melhorar a evolução clínica dos pacientes com câncer de próstata. O modelo animal de metástase óssea é uma ferramenta indispensável para explorar o processo em múltiplos estágios e os mecanismos moleculares envolvidos em cada estágio da metástase óssea do câncer de próstata, identificando alvos terapêuticos e desenvolvendo novasterapêuticas5.
Os métodos mais comuns para gerar modelos animais experimentais de metástase óssea de câncer de próstata incluem a injeção ortotópica, intra-diafise (como intra-tibial) e intra-cardíaca de células de câncer de próstata. O modelo de metástase óssea com injeção ortotópica é gerado pela injeção direta de células do câncer de próstata na próstata decamundongos6,7. Este modelo experimental animal apresenta características clínicas muito semelhantes às metástases ósseas do câncer de próstata. No entanto, as metástases ocorrem principalmente no linfonodo axilar e no pulmão e não no osso 8,9. O modelo de injeção intra-tibial para câncer de próstata injeta diretamente células do câncer de próstata na tíbia com alta taxa de formação de tumor no osso (tíbia)10,11; no entanto, o córtex ósseo e a cavidade da medula óssea são facilmente danificados. Além disso, o método de injeção tibial não pode estimular o processo patológico de metástase óssea do câncer de próstata em que as células cancerosas colonizam o osso através da circulação. Para investigar a circulação, o extravasamento vascular e as metástases à distância com maior taxa de metástases ósseas de células cancerosas, uma técnica de injeção intracardíaca foi desenvolvida injetando diretamente células do câncer de próstata no ventrículo esquerdo do camundongo8,12,13. Isso o torna um modelo animal valioso para a pesquisa de metástasesósseas8. O método de injeção intracardíaca apresenta uma taxa de metástases ósseas de cerca de 75%9,14, muito superior ao método de injeção ortotópica. Portanto, a injeção intracardíaca é um método ideal para gerar um modelo animal com metástase óssea de câncer de próstata.
Este trabalho tem como objetivo descrever o processo de estabelecimento de um modelo murino de metástases ósseas para câncer de próstata, permitindo ao leitor visualizar o estabelecimento do modelo. O presente trabalho fornece processos detalhados, precauções e imagens ilustrativas para gerar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea via injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata em camundongos atímicos. Este método fornece uma ferramenta eficaz para explorar ainda mais os mecanismos moleculares e os efeitos terapêuticos in vivo da metástase óssea do câncer de próstata.

<table><tbody><tr><td>Seringas e agulhas de 1 mL</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>As células foram injetadas nos ventrículos de camundongos</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>Equipamento para anestesiar camundongos</td></tr><tr><td>Contador automático de células</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>&nbsp; Para contagem de células</td></tr><tr><td>BALB/c camundongos atímicos</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>Camundongos</td><td>machos de 6-8 semanas de idade, camundongos machos</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>Para rastrear o crescimento do tumor e metástase pulmonar se as células injetadas forem marcadas por luciferase</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL, 50 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, solução Corning</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1105</td><td>&nbsp; Para descalcificação do meio de tissura</td></tr><tr><td>óssea F-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>21700075, GIBCO</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Solução de formalina</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL539A</td><td>Para fixar a amostra de cada camundongo</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Para anestesia&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>Reagente de transfecção de plasmídeo</td></tr><tr><td>PC-3 linha celular</td><td>Banco de células da Academia Chinesa de Ciências</td><td>TCHu 158</td><td>Linha celular de câncer de próstata</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>Lave as células de osteossarcoma humano</td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co. , Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>Para destacar as células</td></tr><tr><td>Vetor (pLV-luciferase)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plasmídeo para</td></tr><tr><td>sistema de imagem de raios-X</td> de transfecção <td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Para obter imagens de raios-x para detectar o crescimento do tumor</td></tr><tr><td>&mu; CT80</td><td>Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd</td><td>Scanco Medical AG, Suíça</td><td>Para detecção de destruição óssea. O micro-CT está equipado com 3DCalc, reconstrução de cone,&nbsp; e &mu; Software de visualização de modelos CT Ray V3.4A.</td></tr></tbody></table>

injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

Como malignidade masculina mais comum, o câncer de próstata (PC) ocupa o segundo lugar em mortalidade, principalmente devido a uma taxa de metástases ósseas de 65%-75%. Portanto, é essencial compreender o processo e os mecanismos relacionados da metástase óssea do câncer de próstata para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Para isso, um modelo animal de metástase óssea é uma ferramenta essencial. Aqui, relatamos procedimentos detalhados para gerar um modelo de metástase óssea em camundongos via injeção intracardíaca de células de câncer de próstata. Um sistema de imagem por bioluminescência pode determinar se as células do câncer de próstata foram injetadas com precisão no coração e monitorar a metástase das células cancerosas, uma vez que tem grandes vantagens no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas. Este modelo replica o desenvolvimento natural de células cancerosas disseminadas para formar micrometástases no osso e imita o processo patológico da metástase óssea do câncer de próstata. Ele fornece uma ferramenta eficaz para uma maior exploração dos mecanismos moleculares e dos efeitos terapêuticos in vivo desta doença.

A imagem por bioluminescência oferece enormes vantagens no monitoramento do desenvolvimento da lesão metastática para um modelo de injeção intracardíaca. Logo após a injeção das células cancerosas (dentro de 24 h), imagens de bioluminescência foram usadas para visualizar as células cancerosas entrando na circulação geral (Figura 3A). A sinalização de bioluminescência óbvia em todo o corpo será vista quando as células cancerosas são injetadas na circulação arterial corretamente. Os dados de r...

Aqui, apresentamos um protocolo para a injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata para gerar um modelo de camundongo com lesões de metástase óssea.

Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

Este método pode ajudar a produzir um modelo ideal que imita de perto o progresso natural da metástase óssea de células de câncer de próstata in vivo. Esta técnica tem a vantagem de uma metástase óssea e representa o processo natural de metástase óssea de células do câncer de próstata in vivo. Esta técnica beneficia a exploração dos mecanismos moleculares e a investigação dos efeitos terapêuticos in vivo da metástase óssea do câncer de próstata.No dia da injeção, tome 80 a 90% de células PC3 marcadas com luciferase confluentes cultivadas em uma placa de cultura de células de 10 centímetros e comece a preparar as células para injeção lavando-as duas vezes com PBS estéril frio. Tripsinizar as células lavadas com 1,5 mililitros de tripsina a 0,25% por três minutos, após o que extinguir a tripsina adicionando seis mililitros de meio F12 contendo 10% de soro e coletar as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Transfira 20 microlitros da suspensão celular coletada para uma placa de contagem de células e calcule a concentração celular usando um contador automático de células.Em seguida, centrifugar as células à temperatura ambiente por cinco minutos a 800 G. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet de células em meio F12 para atingir a densidade celular final desejada. Agora carregue as células para a sala de cirurgia e realize a injeção de células dentro de duas horas. Mantenha as células no gelo até a injeção.Para iniciar a cirurgia, colocar o camundongo anestesiado em decúbito dorsal e imobilizar ambos os membros superiores, alongando-os perpendicularmente para longe da linha média. Usando fita adesiva cirúrgica, imobilize o camundongo do abdômen para baixo sem pressionar com força e deslocar os órgãos internos. Desinfete a pele do tórax usando um swab de etanol 70%.Em seguida, palpar o meio da parede torácica anterior para localizar o processo xifoide de camundongo na depressão na extremidade inferior do esterno médio. Rotular o ponto mais inferior do processo xifoide. Em seguida, palpando a partir do meio da parede torácica anterior, localize a incisura jugular do camundongo na depressão central na borda superior do manúbrio e marque o ponto mais inferior da incisura jugular.Agora localize e marque o ponto médio entre as duas marcas anteriores, ligeiramente para a direita e um pouco acima do coração no terceiro espaço intercostal. Este é o ponto de injeção. Misture bem a suspensão celular antes de carregar 200 microlitros da suspensão em uma seringa de um mililitro montada com uma agulha de calibre 26.Deixe um pouco de ar na seringa entre o êmbolo e a suspensão para permitir a entrada de sangue pulsante durante a injeção. Para realizar a injeção, insira verticalmente a agulha através do local de injeção. Se a ponta da agulha for inserida corretamente no ventrículo esquerdo, o sangue pulsante vermelho vivo será visível no cubo da agulha.Tente injetar novamente se a pulsação do sangue não for visível ou se o sangue estiver coagulando. Uma vez que a agulha é inserida corretamente, injete 100 microlitros da suspensão celular muito lentamente ao longo de 40 a 60 segundos com uma mão estável. Após a conclusão da injeção, retraia a agulha enquanto aplica pressão no local da injeção com um cotonete seco por 15 segundos para garantir a hemostasia.Devolva o rato à gaiola limpa e monitorize o animal até que recupere completamente da anestesia. Imagens de bioluminescência realizadas 24 horas após a injeção de células PC3 marcadas com luciferase no camundongo mostraram sinais de todo o corpo do animal indicando a presença de células cancerígenas na circulação sistêmica. Lesões metastáticas apareceram nos membros posteriores do camundongo duas semanas após a injeção.As lesões metastáticas tornaram-se maiores com o passar do tempo e começaram a aparecer em outros locais. As lesões metastáticas induzidas por células de câncer de próstata nos ossos foram detectadas por meio de radiografias que mostraram destruição óssea na tíbia proximal do animal. O mesmo também foi confirmado por microtomografia.As lesões metastáticas foram confirmadas em tecidos embebidos em parafina pela coloração de hematina e eosina. O local de injeção preciso é muito importante para garantir a taxa de sucesso deste modelo. Isso pode ser alcançado pela prática.

intra-cardiac-injection-human-prostate-cancer-cells-to-create-bone

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

Modelos de metástase óssea

O vídeo demonstra a técnica de inoculação ortotópica do câncer de mama em um modelo de camundongo. Esta técnica produz uma alta taxa de tumorigênese com menos variabilidade no tamanho e forma do tumor em comparação com a injeção subcutânea ou não cirúrgica.

Injeção ortotópica: implante de células cancerígenas específicas do tecido em um camundongo adulto

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para administrar injeção intraprostática de células de câncer de próstata em um modelo de camundongo. Modelos murinos ortotópicos podem ser usados para estudar a origem da doença e a resposta às terapias de tratamento em um ambiente não invasivo e clinicamente relevante.

Injeção intra-prostática de células cancerígenas: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Os modelos PDX de metástases do sistema nervoso central representam as características fenotípicas e moleculares das metástases humanas, tornando-os excelentes modelos para estudos pré-clínicos. Descrevemos aqui como estabelecer modelos de PDX e as rotas de inoculação que são mais bem utilizadas para estudos pré-clínicos.

Estabelecimento e Utilização de Modelos de Xenoenxerto de Metástases do Sistema Nervoso Central Derivados de Pacientes

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Aprenda a injeção intra-cardíaca de células PC3 de câncer de próstata em camundongos para criar modelo de metástase óssea. Este método permite estudar mecanismos moleculares e testar terapias in vivo.

Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

Explorar mais vídeos