Name: Microssonda de Radiometria Intratecidual para Medição de Radiância In Situ em Tecido Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a construir microssondas de radiometria para medir radiância in situ em tecidos vivos. Esta técnica permite medições espectrais espacialmente resolvidas em materiais espessos e altamente absorventes.

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Os autores agradecem a Sanaz Vahidinia por nos apresentar aos colegas do Dr. Jorgensen e seu trabalho. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Escritório de Pesquisa do Exército (nº W911NF-10-0139), do Escritório de Pesquisa Naval (por meio do prêmio MURI nº N00014-09-1-1053) e do prêmio NSF-INSPIRE NSF-1343158.

Este estudo está em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes da Universidade de Yale em relação à pesquisa com animais vertebrados e invertebrados.
1. Construção da micro-sonda óptica
<ol><li>Construção da manga de vidro, material: pipeta Pasteur, 5,75 pol (ver Tabela de Materiais)<ol><li>Usando um clipe de jacaré montável (Tabela de Materiais), monte a pipeta de vidro pela extremidade larga de modo que a extremidade cônica esteja voltada para baixo em direção ao chão e a orientação da pipeta seja perpendicular ao chão.</li>
		<li>Pendure um punho de plástico de 50 g (Tabela de Materiais) na extremidade cônica da pipeta. Coloque uma almofada de fita eléctrica entre a pipeta e o punho do vício para ajudar a evitar derrapagens.</li>
		<li>Aqueça a extremidade cônica da pipeta usando uma pequena tocha de butano (Tabela de Materiais). Aplique a chama 1 cm acima do punho do vício. Segure a tocha de tal forma que a parte mais brilhante da chama esteja a 3 cm do vidro e o vidro esteja na ponta da chama. Quando o comprimento da pipeta tiver aumentado em cerca de 5 pol, remova imediatamente a chama.</li>
		<li>Utilize uma tesoura pequena ou um cortador de vidro para aparar a extremidade puxada da pipeta no ponto em que o novo diâmetro puxado é aproximadamente o dobro do da fibra óptica utilizada na secção seguinte (ver passo 1.2). Arquive todas as áreas pontiagudas da extremidade aparada usando papel carborundum (Tabela de Materiais). Enxágue quaisquer cacos de vidro pequenos resultantes ou poeira usando um frasco de álcool isopropílico seguido de ar comprimido.</li>
	</ol></li>
	<li>Puxando a fibra óptica (Figura 1D)<ol><li>Use uma lâmina de barbear para cortar a fibra óptica, removendo um conector SMA de uma fibra óptica terminada em SMA de 200 μm de diâmetro (Tabela de Materiais). Corte perto de uma das terminações SMA. Em seguida, use a lâmina de barbear para remover os próximos 5 cm de revestimento de plástico e fibra de vidro para que a fibra óptica nua fique exposta e se projete do resto do conjunto intacto.</li>
		<li>Use a tocha de butano para queimar o revestimento de polímero de poliimida da fibra de vidro. Enxágue com isopropanol. Limpe a fibra de vidro nua usando um lenço sem fiapos.</li>
		<li>O próximo passo é montar a fibra nua para que ela também possa ser puxada com uma chama. Monte a extremidade nua da fibra óptica diretamente em um alicate (Tabela de Materiais) em uma borda de mesa ou prateleira, deixando a extremidade da fibra terminada em SMA pender em direção ao chão. Adicione os pesos para puxar na forma de duas pequenas braçadeiras (peso total: 10 g) na extremidade encamisada da fibra cerca de 12 polegadas para baixo de onde a fibra óptica nua é mantida na braçadeira do alicate.</li>
		<li>Para puxar a fibra, comece com a chama da tocha de butano acesa. Com a chama acesa, segure a tocha de butano a 1 cm da fibra nua para que a chama fique perpendicular à fibra óptica e 3 cm para baixo verticalmente de onde a braçadeira do alicate segura a fibra nua. Deixe a fibra esticar, puxar, separar e cair no chão.</li>
		<li>Examine a extremidade da fibra óptica puxada resultante. Lixe suavemente quaisquer irregularidades com papel carborundum, limpe com álcool isopropílico e um lenço sem fiapos e seque com ar comprimido. NOTA: Neste ponto, pode-se usar um microscópio para caracterizar e documentar o tamanho e a forma da fibra puxada.</li>
		<li>Use uma caneta para escurecer as laterais da fibra e evitar a entrada de luz dispersa (Tabela de Materiais). Puxe suavemente a fibra pela ponta da caneta, deixando apenas uma pequena área na ponta descoberta.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem da fibra puxada dentro da capa da pipeta de vidro (Figura 1A)<ol><li>Trabalhando sob um estereomicroscópio, insira cuidadosamente a fibra óptica cônica da etapa 1.2 na extremidade larga da pipeta de vidro alterada a partir da etapa 1.1 e empurre a fibra até que ~1 mm de fibra nua esteja saindo da extremidade cônica da pipeta.</li>
		<li>Usando fita elétrica, prenda a extremidade encamisada da fibra óptica à extremidade larga da pipeta.</li>
		<li>Coloque uma gota de adesivo de cianoacrilato em uma agulha de bitola pequena (Tabela de Materiais). Toque cuidadosamente a gota de adesivo na borda cortada da pipeta puxada, evitando a extremidade nua da fibra puxada.</li>
		<li>Permitir a ação capilar para prender o adesivo na pipeta, molhando a área entre a parede da pipeta e a fibra óptica. Deixe o adesivo curar por pelo menos 15 minutos antes de mover o conjunto da sonda.</li>
	</ol></li>
	<li>Modificação da ponta da fibra com uma esfera de espalhamento (Figura 1C)<ol><li>Crie a matéria-prima para a ponta da esfera de espalhamento misturando uma gota de adesivo curável por UV com pó de dióxido de titânio (Tabela de Materiais) a ~1:1 v/v.</li>
		<li>Conecte a sonda a um micromanipulador com um suporte de haste de montagem (Tabela de Materiais) de modo que a sonda esteja em uma orientação horizontal. Preparar um reservatório de trabalho do material de espalhamento mergulhando a ponta de um fio ou agulha na mistura de adesivo/TiO2 preparada acima, de modo que uma gota de adesivo se forme. Monte o fio ou agulha com a gota perto da ponta da sonda horizontal. É conveniente fazer isso usando um clipe de jacaré montado no banco.</li>
		<li>Deposite uma esfera de espalhamento na ponta da sonda. Use o micromanipulador para empurrar lenta e cuidadosamente a ponta da fibra óptica da sonda para dentro da gota de adesivo/TiO2. Em seguida, retire rapidamente a ponta da cola. Repita de duas a três vezes até que uma gota esférica de adesivo do tamanho desejado seja depositada na ponta da fibra óptica. NOTA: A esfera de espalhamento será estável em diâmetros de duas a oito vezes maiores que o diâmetro da fibra óptica cônica. O tamanho final ótimo depende da aplicação final desejada.</li>
		<li>Cure a esfera conectando a extremidade da fibra óptica terminada em SMA a uma fonte de luz UV acoplada à fibra (Tabela de Materiais). OBS: A fonte de luz utilizada neste estudo apresentou potência de 5,3 mW. Nesta potência, o tempo de cura recomendado é de pelo menos 12 h ou durante a noite. Após a cura é um bom momento para caracterizar e medir o tamanho da ponta da sonda óptica final.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparo e montagem do tecido para medidas ópticas (Figura 2 e Figura 3)
<ol><li>Prepare os pratos para montar as amostras para um experimento. Aqueça a extremidade grande de uma pipeta de Pasteur usando uma tocha de butano para fazer um soco para derreter um furo de 0,5 cm de diâmetro no fundo de uma placa de Petri de plástico de 35 mm x 10 mm. Sele o orifício no lado inferior do prato com fita elétrica ou fita adesiva. Faça vários de cada vez para eficiência.</li>
	<li>Preparar gelatina líquida (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções da embalagem. NOTA: A gelatina sem sabor de grau alimentício comercial do supermercado é melhor para este fim do que a gelatina de grau químico de fornecedores químicos, porque a gelatina de grau químico é menos opticamente clara e menos confiável mecanicamente do que o produto alimentício.</li>
	<li>Realizar a dissecção e preparo do tecido que será utilizado. NOTA: Por experiência, qualquer tecido plano de até 1 cm de espessura pode ser medido com sucesso neste experimento usando qualquer técnica de dissecção apropriada para o sistema de interesse. Para o tecido de moluscos gigantes, um punch de biópsia de 8 mm foi usado para fazer um círculo plano e regular de tecido de molusco para uso no experimento12. Para este sistema, apenas uma amostra poderia efetivamente ser preparada de cada vez, dado o período de tempo necessário para completar uma medição para garantir que a amostra ainda estivesse em condições de vida no final do experimento.</li>
	<li>Encha duas placas de Petri do passo 2.1 um quarto do caminho com a gelatina líquida e deixe arrefecer até à temperatura ambiente (RT) logo após a gelificação. Em um prato, coloque a biópsia na almofada de gelatina viscosa que se forma no buraco no fundo do prato. Use uma pipeta de Pasteur para adicionar suavemente gelatina RT ao redor da biópsia até que a placa de Petri esteja cheia (Figura 3). Encha o segundo prato com gelatina para fazer uma amostra em branco.</li>
	<li>Coloque os pratos de amostra em uma geladeira por cerca de 10-30 minutos até que a gelatina esteja totalmente curada e ligeiramente elástica ao toque. NOTA: Em uma sala fria, isso pode não ser necessário; Ao trabalhar nos trópicos, esta etapa é necessária para curar totalmente a gelatina.</li>
	<li>Montagem da placa de Petri no micromanipulador (Figura 2)<ol><li>Corte um quadrado de 6 cm x 6 cm de 1/4 em plexiglass grosso (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Faça ou derreta um furo no quadrado de plástico do mesmo diâmetro da placa de Petri (~35 mm). Certifique-se de que a placa de Petri se encaixe perfeitamente neste orifício e seja mantida no lugar com atrito. Adicione fita adesiva nas bordas do prato para aumentar ligeiramente o tamanho e o contato com o atrito.</li>
		<li>Fure ou derreta um furo de 1/4 de diâmetro no canto do quadrado de plástico. Use este orifício para fixar o quadrado ao micromanipulador usando um parafuso e parafuso de 1/4.</li>
		<li>Cubra o quadrado de plástico com fita elétrica preta para reduzir a luz perdida que atinge a sonda. Da mesma forma, use fita adesiva para criar uma saia ao redor das laterais do quadrado que se estenda abaixo da parte inferior da placa inserida (>10 mm) para reduzir a luz perdida (Figura 2B).</li>
		<li>Use um parafuso e hardware apropriado para fixar o suporte da placa de Petri a um micromanipulador que permita ajustes tridimensionais e movimento vertical bem resolvido em uma extensão maior do que a espessura das amostras (parte 1 e parte 2 do manipulador mencionado na Tabela de Materiais são bons exemplos). Afixe este micromanipulador em uma protoboard óptica.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Configuração de medição para biópsias teciduais
<ol><li>Monte uma fonte de luz acima da área onde a medição é realizada, de modo que a luz seja colimada quando atingir o plano onde a amostra será colocada (Figura 2A). Por exemplo, anexe uma lente de colimação de 5 cm (Tabela de Materiais) a uma guia de luz líquida de 5 mm (Tabela de Materiais) e eleve acima da amostra em >0,6 m usando um vício e uma estrutura anexados a uma protoboard óptica (Tabela de Materiais). Em seguida, conecte a guia de luz a uma fonte de luz de banda larga, como a fonte de luz de plasma listada na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Conecte a sonda a um suporte orientado verticalmente de tal forma que ele aponte para a fonte de luz. Fixe a sonda com grampos, abraçadeiras de mangueira ou fita adesiva em um poste de mesa óptico. NOTA: No experimento de moluscos gigantes, um suporte de haste especificamente projetado, como o micromanipulador listado na Tabela de Materiais, é usado. Neste trabalho, ele foi fixado por ímãs a uma protoboard óptica (Tabela de Materiais). Os graus adicionais de liberdade para alinhamento obtidos por ter a sonda e a amostra em manipuladores são convenientes, mas não necessários. Tenha cuidado para não apertar demais o poste, pois isso pode quebrar a carcaça da pipeta.</li>
	<li>Posicione o manipulador de amostras perto da sonda montada verticalmente. Use o manipulador de amostra para ajustar a posição do estágio da amostra de modo que a sonda fique centralizada na abertura de 0,5 cm na parte inferior da placa de Petri. Tenha extremo cuidado para evitar tocar ou bater na ponta da sonda montada. NOTA: Um estereomicroscópio montado na lança posicionado sobre a área da amostra pode ser útil. Dessa forma, o alinhamento de cima para baixo da ponta da sonda, do estágio e da amostra pode ser visualizado antes de iniciar um experimento (Figura 2A).</li>
	<li>Conecte a extremidade da fibra óptica da sonda terminada por SMA a um espectrômetro de fibra óptica USB (Tabela de Materiais) e conecte o espectrômetro ao computador usando um cabo USB.</li>
</ol>4. Coleta de dados
<ol><li>Arranjo experimental<ol><li>Tenha a sonda e os manipuladores na posição exata alinhada em que os dados serão coletados, como na etapa 3.4.</li>
		<li>Use um cotonete ou agulha de calibre fino para aplicar cuidadosamente uma pequena quantidade de lubrificante de silicone (Tabela de Materiais) na parte da sonda que será inserida no tecido para diminuir o atrito entre os lados da sonda e a amostra de tecido. Reaplique o lubrificante de silicone antes de cada medida basal ou tecidual.</li>
		<li>Retire a fita que cobre o orifício da placa de Petri da amostra em branco e coloque-a no suporte da amostra (passo 2.7), certificando-se de que é mantida firmemente no lugar por atrito.</li>
		<li>Use o micromanipulador para abaixar a amostra na sonda. Deixe a sonda entrar na gelatina através do orifício na parte inferior da placa de Petri. Continue até que a sonda esteja a aproximadamente 5 mm do fundo da camada de gelatina.</li>
		<li>Ligue a fonte de luz. Usando o software do espectrômetro, ajuste o tempo de integração do espectrômetro até que o sinal seja o mais alto possível, mas não esteja saturando. Defina o número de varreduras médias entre dois e cinco e o valor de pixels de suavização como seis. Os tempos de integração utilizáveis neste estágio podem variar entre 1-50 ms para essa linha de base.</li>
	</ol></li>
	<li>Coletando os espectros de referência<ol><li>Colete uma medida escura.<ol><li>Uma vez que os parâmetros do espectrômetro tenham sido definidos com a amostra em branco, desconecte a fibra da sonda do espectrômetro e cubra a porta com a tampa metálica opaca que acompanha o espectrômetro.</li>
			<li>Obtenha uma medição escura do espectrômetro (geralmente usando o ícone de lâmpada escura na GUI) para caracterizar o ruído do espectrômetro sem luz de entrada. Salve essa medição de acordo com a estratégia de aquisição de dados.</li>
		</ol></li>
		<li>Coletar uma medida de lâmpada. Reconecte a fibra da sonda ao espectrômetro, aguarde o sinal se estabilizar e adquira outro espectro. Essa medida caracteriza a luz que atinge a sonda através da gelatina na ausência de tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Coletando os espectros teciduais<ol><li>Retire a fita no fundo da placa de Petri da amostra e coloque-a no suporte da amostra.</li>
		<li>Alinhe a placa da amostra com a sonda usando manipulação tridimensional para que a biópsia de tecido fique centralizada acima da ponta da sonda.</li>
		<li>Aplicar gel de silicone na sonda (ver ponto 4.1.2) e abaixar lentamente a amostra sobre a sonda até que a ponta da sonda tenha passado através da gelatina que suporta a amostra de tecido e tenha acabado de entrar na amostra de tecido. NOTA: Alguns espectrômetros e programas de computador permitem o monitoramento em tempo real da luz detectada. Use isso para determinar quando a sonda entra no tecido. A intensidade do espectro diminuirá abruptamente assim que a ponta da sonda estiver em contato direto com o tecido.</li>
		<li>Verifique se o tempo de integração é apropriado para a medição, garantindo que o espectro medido não seja nem muito barulhento nem saturado. Altere o tempo de integração, se necessário.<ol><li>Sempre que o tempo de integração for ajustado, execute e armazene uma nova medição escura (etapa 4.2.1). Não altere o número de varreduras médias ou o número de pixels suavizados.</li>
			<li>Depois de encontrar parâmetros de medição adequados, faça as medições e salve o espectro.</li>
		</ol></li>
		<li>Mova a amostra para uma distância especificada usando o micromanipulador. Para o manipulador utilizado neste estudo, cada pequena marca de carrapato foi de 0,001 pol ou 25,4 μm. A amostra foi movida para baixo através de cinco marcas de carrapato, ou 127 μm, para cada medida. Repita a etapa 4.3.4.</li>
		<li>Continue a salvar os espectros em cada posição vertical dentro do tecido. NOTA: Para o sistema aqui descrito, os tempos de integração necessários variaram entre 1 ms a 5 s para as medições dentro de uma única amostra de tecido. Eventualmente, a ponta da sonda sairá do topo do tecido e ficará visível ali (Figura 4A). Esta é a medida final e caracteriza a luz incidente no topo do tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregamento e processamento dos dados<ol><li>Use o software do espectrômetro para converter todos os espectros coletados (espectros escuros, espectros de lâmpadas e medidas de tecido) em arquivos de texto delimitados.</li>
		<li>Usando o Matlab ou uma linguagem de codificação de sua escolha, carregue todos os arquivos de medição de uma amostra. Para cada espectro de medição de tecido, subtraia o espectro escuro com o tempo de integração correspondente e, em seguida, divida pelo tempo de integração. OBS: Neste estudo, foi utilizado um script Matlab para carregamento e processamento dos dados (Arquivo Suplementar 1).</li>
		<li>Calcular a porcentagem de luz incidente atingindo cada posição no tecido dividindo os espectros obtidos com a sonda dentro do tecido pelo espectro basal obtido na gelatina vazia. NOTA: A medida no topo do tecido (passo 4.3.6) deve ser muito semelhante à medida basal em gelatina (passo 4.1) e, quando dividida, deve ser próxima de 100%. Dependendo do contexto experimental, o espectro da lâmpada (o espectro da gelatina vazia ou do topo do tecido) pode ser usado como referência. No entanto, ainda é importante coletar um espectro de lâmpada antes de iniciar o experimento. Isso ocorre porque, se a sonda quebrar ou o experimento falhar antes de atingir o topo do tecido, os dados obtidos antes da falha ainda são utilizáveis, o que não é o caso se não houver espectro de referência de lâmpada inicial correspondente.</li>
		<li>Visualize os dados; gráficos de contorno podem ser úteis (Figura 4B).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse.

Este protocolo descreve uma técnica para caracterizar sistematicamente o ambiente óptico através de um grande volume de tecido vivo com resolução espacial aproximadamente na escala de células únicas. Este método barato, flexível e tratável em campo poderia ser útil para qualquer pesquisador que estudasse a propagação da luz dentro de sistemas vivos. Pela experiência, em comparação com os métodos existentes7, essas sondas requerem um pouco mais de prática e habilidade para serem construídas, mas re...

Surpreendentemente, animais terrestres e habitantes rasos do oceano têm luz suficiente dentro de seu corpo para fisiologia visual e até fotossíntese. Por exemplo, os níveis de luz no centro da cabeça de um rato (fora das bandas de forte absorvância da hemoglobina) são atenuados por três ou quatro ordens de magnitude em relação ao mundo exterior. Esta é aproximadamente a diferença entre os níveis de luz dentro e fora de casa. Assim, a opacidade de um tecido ou material devido à forte dispersão não é o mesmo que opacidade devido à forte absorção de luz. A luz pode continuar se propagando por longas distâncias em um sistema fortemente espalhador, semelhante à luz que se propaga através de sistemas aquáticos com altas concentrações de células e partículas1. Esta observação é particularmente saliente à luz do fato de que as proteínas opsina são quase onipresentes expressas em todos os tecidos de todos os animais. Assim, é importante entender como e onde a luz é atenuada e espalhada dentro do tecido vivo. No entanto, ao contrário dos sistemas aquáticos, com tecido vivo, é impossível imergir um instrumento na coluna d'água e obter medidas de radiância e irradiância, sendo necessária uma nova técnica.
Outros métodos previamente utilizados para caracterizar as propriedades de absorção e espalhamento de tecidos vivos incluem a mensuração de sondas de reflectância tecidual e/ou esferas integradoras2,3, métodos microscópicos como a microscopia confocal de varredura4, a medição da difusão da luz laser na superfície5 e técnicas de modelagem como a transferência radiativa Monte Carlo6. Os métodos experimentais mencionados frequentemente requerem equipamentos específicos, grandes e caros ou conhecimento detalhado sobre a estrutura do tecido e geralmente são limitados em sua capacidade de caracterizar a estrutura espacial da luz no interior do tecido.
Existem também métodos similares baseados em sonda que utilizam uma agulha hipodérmica para inserir uma fibra óptica através do tecido 7,8,9. Em nossa experiência, agulhas modificadas são eficazes em puncionar tecidos, mas requerem força considerável e geralmente rasgam tecidos delicados ao passar através de células densamente embaladas. Portanto, essas agulhas geralmente requerem um procedimento cirúrgico para inserir mais de um milímetro ou mais em uma camada de tecido. O método aqui descrito, utilizando um suporte de vidro lubrificado e puxado, é capaz de deslizar entre as células com mínima lesão do tecido e sem cirurgia adicional.
Este manuscrito apresenta um método inspirado no trabalho de Jorgenson e colaboradores sobre a medição de luz dentro de esteiras algais10,11, usando microssondas ópticas suportadas em vidro e eletrônica portátil que são passíveis de sondagem profunda em tecido denso e de construção e uso no campo. Essas sondas podem ser construídas para caracterizar a irradiância escalar (luz atingindo um ponto de todas as direções) e a radiância descendente (luz que cruza um plano horizontal) dentro do tecido vivo em altas resoluções espaciais. Essas sondas foram originalmente desenvolvidas para medir a transferência radiativa dentro do tecido de moluscos gigantes fotossimbióticos12. Medidas padronizadas de absorção e transmissão do tecido total não foram suficientes para caracterizar o desempenho fotossintético do tecido, pois faz uma grande diferença se toda a luz incidente é absorvida por poucas células experimentando alta intensidade na superfície do tecido ou muitas células experimentando baixas intensidades em todo o volume do tecido. Em um segundo projeto, essas sondas foram utilizadas para medir a irradiância in vivo dentro do cérebro de camundongos13,14, caracterizando assim o ambiente luminoso de opsinas expressas profundamente no interior do cérebro. Essas microssondas são pequenas e sensíveis o suficiente para medir a irradiância dentro do tecido cerebral de camundongos com toda a pele, pele e osso intactos e demonstrar que os níveis fisiológicos de luz são facilmente altos o suficiente para estimular as opsinas cerebrais profundas.
Esta sonda micro-óptica e configuração de medição poderia ser útil para pesquisadores que precisam quantificar e caracterizar a luz interna ao tecido biológico, particularmente para uma compreensão mais matizada da fotossíntese ou das funções dos pigmentos visuais expressos fora dos olhos. Este método pode ser usado sozinho ou em conjunto com outras técnicas para caracterizar completamente as propriedades ópticas e a propagação da luz dentro de tecidos vivos a um baixo custo, com pequenos equipamentos portáteis construídos internamente e com parâmetros ajustáveis dependentes da tarefa.

<table><tbody><tr><td>Centro de rolamento de esferas de viagem de 1" + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31</td><td>Edmond Optics</td><td>37-935</td><td>Parte 2 do manipulador para abaixar a amostra</td></tr><tr><td>Folha de acrílico de 1/4 "de espessura</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K754</td><td>Para fazer suporte de placa de Petri</td></tr><tr><td>3/4 "mini grampo de mola</td><td>Bigorna</td><td>99693</td><td>Use como peso para puxar fibra óptica</td></tr><tr><td>8 mm punção de biópsia</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9324386</td><td>Para amostra de tecido</td></tr><tr><td>Tocha de butano</td><td>McMaster-Carr</td><td>MT-51</td><td>Fonte de calor para puxar fibra e pipeta</td></tr><tr><td>Lente de colimação</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5A1-A</td><td>Para colimar a fonte de luz através de guia de luz líquida</td></tr><tr><td>Ar comprimido</td><td>McMaster-Carr</td><td>7437K35</td><td>Para secar fibra puxada e pipeta</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato - líquido</td><td>McMaster-Carr</td><td>66635A31</td><td>Para prender a extremidade da fibra cônica na parte superior da pipeta puxada</td></tr><tr><td>Fita isolante</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>Para prender a fibra na pipeta e para adicionar aderência aos grampos</td></tr><tr><td>Papel de carborundum de grau fino</td><td>McMaster-Carr</td><td>4649A24</td><td>Pequeno triângulo no porta-faca exato funciona bem Gelatina</td></tr><tr><td></td><td>Knox</td><td>10043000048679</td><td>Para fixar a biópsia do tecido na placa</td></tr> <tr><td>de PetriPipeta de vidro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td>Pipeta de vidro descartável 5,75" de comprimento</td></tr><tr><td>Seringas de insulina, agulha 31G</td><td>BD</td><td>320440</td><td>Para aplicação de cola</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>McMaster-Carr</td><td>54845T42</td><td>Para limpeza de fibra puxada e pipeta</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Cole-Parmer</td><td>SKU 33670-04</td><td>Para limpar fibra óptica e pipeta de vidro LED limpo</td></tr><tr><td> driver</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>Para alimentar os LEDs UV</td></tr><tr><td>Fonte de luz para medições</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-78905-05</td><td>Fonte de luz branca de baixo calor para medições</td></tr><tr><td>Estágio de cremalheira e pinhão do eixo métrico linear XYZ</td><td>Edmond Optics</td><td>55-023</td><td>Parte 1 do manipulador para baixar a amostra</td></tr><tr><td>Guia de luz líquida</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5-4T</td><td>Para fonte de luz em medições</td></tr><tr><td>Pés magnéticos</td><td>Siskiyou</td><td>MGB 8-32</td><td>Para uso com tiras magnéticas Fitas magnéticas</td></tr><tr><td></td><td>Siskiyou</td><td>MS-6.0</td><td>Para montagem magnética em placa de ensaio</td></tr><tr><td>Manipulador #1</td><td>Manipulador de 4 eixos Siskiyou</td><td>MX10R</td><td>com suporte de pipeta</td></tr><tr><td>Caneta opaca, pequena</td><td>WindowTint</td><td>TOP01</td><td>Para operar o lado da fibra óptica para evitar que a luz difusa entre na sonda</td></tr><tr><td>Placa de ensaio óptica</td><td>Edmond Optics</td><td>03-640</td><td>Para fixação estável do suporte da sonda, amostra, microscópio e fonte de luz</td></tr><tr><td>Fibras ópticas</td><td>Ocean Optics</td><td>P-100-2-UV-VIS</td><td>Cerca de 4 fibras são boas para ter</td></tr><tr><td>Fonte de luz de plasma</td><td>Thorlabs</td><td>HPLS345</td><td>Para medições de radiometria tecidual</td></tr><tr><td>Grampo de alicate de plástico</td><td>McMaster-Carr</td><td>5070A11</td><td>Braçadeira de alicate usada para peso na pipeta de</td></tr><tr><td>puxar placas de Petri de poliestireno</td><td>Thomas scientific</td><td>3488N10</td><td>Porta-amostras, volume suficiente para segurar a espessura da amostra mais ~10 mm de gelatina na parte superior</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>McMaster-Carr</td><td>3962A3</td><td>Para descascar o revestimento de fibra óptica</td></tr><tr><td>Lubrificante de óleo de silicone</td><td>Thomas scientific</td><td>1232E30</td><td>Para reduzir o atrito entre a sonda e o tecido</td></tr><tr><td>Software para análise de dados</td><td>Matlab</td><td></td><td>Software escolhido para análise de dados</td></tr><tr><td>Espectrômetro + software espectrômetro</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-2048L</td><td>O espectrômetro pode ser de qualquer marca, este é compatível com fibras ópticas terminadas em sma e vem com seu próprio software para executar o espectrômetro</td></tr><tr><td>Pó de dióxido de titânio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>718467-100G</td><td>Para fazer esfera</td></tr> <tr><td>de espalhamentoClipe de mesa Toolour</td><td></td><td>Toolour0004</td><td>Para segurar a pipeta enquanto puxa e para segurar sondas acabadas</td></tr><tr><td>Grampos de barra de ação de gatilho</td><td>mcMaster-Carr</td><td>51755A2</td><td>Bom para segurar fibras ópticas enquanto puxa ou cura</td></tr><tr><td>adesivo curável por UV</td><td>Delo Photobond</td><td>GB368</td><td>Para fazer esfera de dispersão</td></tr><tr><td>Fonte de luz UV</td><td>Thorlabs</td><td>M365FP1</td><td>Fonte de luz para cura de adesivo em bola de dispersão, esta é compatível com fibra sma, maior intensidade = menor tempo de cura</td></tr><tr><td>Fonte de luz LED branca</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHF2</td><td>Para caracterizar fibra puxada e esfera de dispersão</td></tr></tbody></table>

microssonda de radiometria intratecidual para medição de radiância in situ em tecido vivo

An Intra-Tissue Radiometry Microprobe for Measuring Radiance In Situ in Living Tissue

Os organismos parecem opacos em grande parte porque suas camadas externas de tecido estão fortemente espalhadas para a luz incidente; Pigmentos fortemente absorventes, como o sangue, normalmente têm absorbâncias estreitas, de modo que o caminho livre médio da luz fora dos picos de absorbância pode ser bastante longo. Como as pessoas não conseguem ver através do tecido, geralmente imaginam que tecidos como cérebro, gordura e osso contêm pouca ou nenhuma luz. No entanto, proteínas opsina fotorresponsivas são expressas em muitos desses tecidos, e suas funções são pouco compreendidas. A radiância interna ao tecido também é importante para a compreensão da fotossíntese. Por exemplo, os moluscos gigantes são fortemente absorventes, mas mantêm uma densa população de algas nas profundezas do tecido. A propagação da luz através de sistemas como sedimentos e biofilmes pode ser complexa, e essas comunidades podem ser grandes contribuintes para a produtividade do ecossistema. Portanto, um método para a construção de microssondas ópticas para medir a irradiância escalar (fluxo de fótons cruzando um ponto) e a irradiância descendente (fluxo de fótons cruzando um plano perpendicularmente) para melhor entender esses fenômenos dentro do tecido vivo foi desenvolvido. Esta técnica também é tratável em laboratórios de campo. Essas microssondas são feitas de fibras ópticas puxadas pelo calor que são então fixadas em pipetas de vidro puxadas. Para alterar a aceitação angular da sonda, uma esfera de 10-100 μm de epóxi curável por UV misturada com dióxido de titânio é então fixada na extremidade de uma fibra puxada e aparada. A sonda é inserida em tecido vivo, e sua posição é controlada usando um micromanipulador. Essas sondas são capazes de medir a radiância do tecido in situ em resoluções espaciais de 10-100 μm ou na escala de células únicas. Essas sondas foram usadas para caracterizar a luz que atinge as células adiposas e cerebrais 4 mm abaixo da pele de um camundongo vivo e para caracterizar a luz que atinge profundidades semelhantes dentro do tecido vivo de moluscos gigantes ricos em algas.

Este protocolo descreve o procedimento para a construção de uma sonda micro-óptica que pode ser usada para medir a irradiância de ressurgência (a luz atingindo um ponto de uma direção) ou, com a adição de uma ponta esférica de espalhamento de luz, para medir a irradiância escalar (a luz atingindo um ponto de todas as direções). Essas sondas podem medir a irradiância em resoluções espaciais que se aproximam das escalas de comprimento de células isoladas dentro do tecido vivo. Este protocolo também descreve um método repre...

Neste trabalho, um método para medir a radiância in situ em tecidos vivos é descrito. Este trabalho inclui detalhes da construção de sondas em microescala para diferentes medidas de radiância e irradiância, fornece orientação para a montagem de tecidos para a caracterização da radiância e delineia métodos computacionais para análise dos dados resultantes.

Microssonda de Radiometria Intratecidual para Medição de Radiância In Situ em Tecido Vivo

Organisms appear opaque largely because their outer tissue layers are strongly scattering to incident light; strongly absorbing pigments, such as blood, ...

Este protocolo é significativo porque simplifica e permite medições de radiância em materiais espessos, permitindo-nos reunir informações importantes ao estudar sistemas vivos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite medições espectrais espacialmente resolvidas em materiais altamente absorventes usando equipamentos que podem ser construídos e experimentos que podem ser executados em laboratórios de campo. Este método pode ser adaptado e aplicado a qualquer sistema vivo.A técnica de fazer as sondas tem nuances, mas a prática leva à perfeição. Ajuste a técnica de medição dependendo do material que está sendo sondado e faça alterações que resultem em uma posição mais segura do tecido e menor atrito da sonda. Para começar, construa a manga de vidro com uma pipeta Pasteur de 5,75 polegadas.Usando um grampo de jacaré montável, monte a pipeta de vidro pela extremidade larga de modo que a extremidade cônica fique voltada para baixo em direção ao chão e a orientação da pipeta seja perpendicular ao chão. Coloque uma almofada de fita elétrica em um punho de plástico de 50 gramas para ajudar a evitar deslizamentos e pendure o punho da extremidade cônica da pipeta. Usando uma pequena tocha de butano, aqueça a extremidade cônica da pipeta conforme descrito no manuscrito.Quando o comprimento da pipeta tiver aumentado em cerca de cinco polegadas, remova imediatamente a chama. Em seguida, use uma tesoura pequena ou um cortador de vidro para aparar a extremidade puxada da pipeta. Arquive quaisquer áreas pontiagudas da extremidade aparada usando papel carborundum e enxágue quaisquer pequenos cacos de vidro ou poeira usando álcool isopropílico seguido de ar comprimido.Use uma lâmina de barbear para cortar a fibra óptica e remover um conector SMA de uma fibra óptica terminada em SMA. Certifique-se de cortar perto de uma das terminações SMA. Em seguida, remova os cinco centímetros seguintes de plástico e revestimento de fibra de vidro para que a fibra óptica nua fique exposta e se projete do resto de todo o conjunto.Use a tocha de butano para queimar o revestimento de polímero de poliamida da fibra de vidro. Enxágue com isopropanol e limpe a fibra de vidro nua usando um lenço sem fiapos. Agora, monte a extremidade nua da fibra óptica diretamente em um alicate em uma borda de mesa ou prateleira, deixando a extremidade da fibra terminada em SMA pendurada em direção ao chão.Cerca de quatro a seis centímetros de onde a fibra óptica nua é mantida na braçadeira do alicate, adicione os pesos para puxar usando duas pequenas braçadeiras na extremidade encamisada da fibra. Para puxar a fibra, comece com a chama da tocha de butano acesa. Segure a tocha de butano a um centímetro da fibra nua, conforme descrito no manuscrito.E deixe a fibra esticar, puxar, separar e cair no chão. Verifique a fibra sob o microscópio e corte a extremidade da fibra com uma pequena tesoura de dissecção, se necessário. Use uma caneta de espuma opaca para escurecer as laterais da fibra e evitar a entrada de luz dispersa.Puxe suavemente a ponta da caneta através da fibra, deixando apenas uma pequena área na ponta descoberta. Sob um microscópio estéreo, insira cuidadosamente a fibra óptica cônica na extremidade larga da pipeta de vidro alterada e empurre a fibra até que aproximadamente um milímetro de fibra nua esteja saindo da extremidade cônica da pipeta. Usando fita elétrica, prenda a extremidade encamisada da fibra óptica à extremidade larga da pipeta.Coloque uma gota de adesivo de cianoacrilato em uma agulha de calibre pequeno. Toque cuidadosamente a gota de adesivo na borda cortada da pipeta puxada, evitando a extremidade nua da fibra puxada. Para modificar a ponta da fibra com uma esfera de espalhamento, crie a matéria-prima misturando uma gota de adesivo curável UV com pó de dióxido de titânio em uma proporção igual.Conecte a sonda a um micromanipulador com um suporte de haste de montagem de tal forma que a sonda esteja em uma orientação horizontal. Prepare um reservatório de trabalho do material de espalhamento mergulhando a ponta de um fio ou agulha na mistura preparada, de modo que uma gota de adesivo se forme. Monte o fio ou agulha com a gota perto da ponta da sonda horizontal.Deposite uma esfera de espalhamento na ponta da sonda. Use o micromanipulador para empurrar a ponta da fibra óptica da sonda lenta e cuidadosamente para dentro da mistura preparada. Em seguida, retirava rapidamente a ponta da cola e visualizava a bola espalhada em um microscópio.Repita até que uma gota esférica de adesivo do tamanho desejado seja depositada na ponta da fibra óptica. Prepare os pratos para montar as amostras. Usando uma tocha de butano, aqueça a extremidade grande de uma pipeta de Pasteur para derreter um buraco de 0,5 centímetro de diâmetro no fundo de uma placa de Petri de plástico.Sele o orifício no lado inferior do prato com fita elétrica ou fita adesiva. Em seguida, encha uma placa de Petri um quarto do caminho e uma segunda placa de Petri com a gelatina líquida e deixe esfriar até a temperatura ambiente logo após a gelificação. Em um prato, coloque a biópsia na almofada de gelatina viscosa que se formou no buraco no fundo do prato.Usando uma pipeta de Pasteur, adicione suavemente gelatina à temperatura ambiente ao redor da biópsia até que a placa de Petri esteja cheia. Para a amostra em branco, use o prato recheado apenas com gelatina. Conecte a sonda a um suporte orientado verticalmente de modo que ele aponte para a fonte de luz e prenda a sonda com grampos, grampos de mangueira ou fita adesiva a um poste de mesa óptico.Conecte a extremidade da fibra óptica da sonda terminada por SMA a um espectrômetro de fibra óptica USB e conecte o espectrômetro ao computador usando um cabo USB. Mantenha a sonda e os manipuladores na posição exata alinhada onde os dados serão coletados. Use um cotonete, agulha de calibre fino ou conta-gotas para aplicar cuidadosamente uma pequena quantidade de lubrificante de silicone na parte da sonda que será inserida no tecido para diminuir o atrito entre os lados da sonda e a amostra de tecido.Agora, remova a fita que cobre o orifício na placa de Petri da amostra e coloque-a no suporte da amostra, garantindo que ela seja mantida firmemente no lugar por atrito. Use o micromanipulador para abaixar a amostra na sonda e permitir que a sonda entre na gelatina através do orifício na parte inferior da placa de Petri. Continue até que a sonda esteja a aproximadamente cinco milímetros do fundo da camada de gelatina.Ligue a fonte de luz. Usando o software do espectrômetro, ajuste o tempo de integração do espectrômetro até que o sinal seja o mais alto possível, mas não saturando. Defina o número de varreduras médias entre dois e cinco e o valor dos pixels de suavização como seis.Os tempos de integração utilizáveis neste estágio podem variar de um a 15 milissegundos para essa linha de base. Verifique se o tempo de integração é apropriado para a medição, garantindo que o espectro não seja nem muito barulhento nem saturado. Altere o tempo de integração, se necessário.Mova a amostra por uma distância especificada usando o micromanipulador e execute as medições. Continue a salvar os espectros em cada posição vertical dentro do tecido. A aparência microscópica da sonda que sobe através do tecido é visualizada.A porcentagem de luz em diferentes profundidades de tecido em relação à linha de base é mostrada. A coisa mais importante a lembrar é que essas sondas são frágeis, então tome seu tempo e certifique-se de que as junções da sonda estejam seguras antes de prosseguir. Após a confecção da sonda, as técnicas de medição podem ser adaptadas.Por exemplo, sem a esfera de espalhamento, sondas podem ser usadas para medir a radiância que atinge o detector a partir de uma única direção. Depois de desenvolver essa sonda, os pesquisadores foram capazes de medir a luz dentro do cérebro e do tecido adiposo em camundongos usando uma variação em nosso aparelho de medição. Isso ajudou a responder à questão de se havia luz suficiente para ativar os fotorreceptores presentes profundamente no tecido.

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Research

JoVE Journal

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