Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae
2 de dezembro de 2022
Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.
Este protocolo é um método simples para quantificar a eficiência com que diferentes cepas e espécies de leveduras se acasalam entre si. O método proposto é simples, robusto e eficiente. O método pode ser estendido a qualquer cepa de levedura.
O método descrito neste estudo pode ser usado para entender como ocorre a especiação em leveduras. Além disso, as cepas que descrevemos podem ser particularmente úteis para projetar experimentos com fluxo gênico. A força do método é que ele é muito simples.
Alguns pequenos ajustes, como o tempo de incubação, podem ser necessários, dependendo da cepa específica usada. Comece a reviver os haploides A e Alpha de estoques congelados, dedilhando o inóculo de levedura em um extrato de levedura peptona dextrose, ou placa de ágar YPD. Deixe-os crescer por 48 horas a 30 graus Celsius para obter colônias únicas.
Após a incubação, inocular colônias únicas da placa YPD e cinco mililitros de meio YPD e incubar a 30 graus Celsius por 48 horas com agitação a 250 RPM. As células encontram-se na fase estacionária de crescimento após este período de incubação. Em uma placa YPD fresca, desenhe a grade de eficiência de acasalamento como um retângulo de 1 por 1,5 centímetro dividido em três caixas, cada uma com uma dimensão de 1 por 0,5 centímetro.
Inocular cinco microlitros da cultura YPD dos dois tipos de acasalamento nos retângulos mais à esquerda e mais à direita. Este volume corresponde a cerca de 5 vezes 10 a quinta células haploides em cada seção. Incubar as placas por 24 horas a 30 graus Celsius.
Para misturar um número igual de células de levedura, remova cerca de 1/3 do crescimento de levedura desenvolvido nas caixas externas usando um palito estéril e ressuspenda as células removidas em 20 microlitros de água em um frasco estéril de 1,5 mililitro. Siga isso para cada haploide. Em seguida, diluir cinco microlitros dessa suspensão em dois mililitros de água e medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro a 600 nanômetros.
Com base no valor da densidade óptica e no número de células por mililitro em uma densidade óptica, adicione os volumes necessários de ambos os haploides em um frasco fresco e estéril de 1,5 mililitro. Misture bem usando uma pipeta. O volume final desta suspensão é geralmente em torno de seis a oito microlitros.
Em seguida, inocular essa suspensão na grade central. Incubar a placa a 30 graus Celsius por sete horas, permitindo que os haploides se acasalem. Após sete horas de incubação, raspe as células do retângulo central usando um palito ou uma ponta de pipeta e dilua em dois mililitros de água estéril.
Realizar diluições adicionais e, em seguida, espalhar a suspensão celular em ágar YPD para obter colônias únicas. Após o plaqueamento, incubar as placas de YPD a 30 graus Celsius por 36 a 48 horas para desenvolver colônias únicas. Certifique-se de que algumas centenas de colônias individuais sejam obtidas de cada experimento de acasalamento para triagem para garantir a significância estatística dos dados.
Para identificar as colônias diploides na placa, transfira as colônias únicas, strandando-as individualmente em uma placa de gotejamento duplo, sem os aminoácidos para os quais as cepas são auxotróficas. Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas e calcular a eficiência de acasalamento, nu. A robustez do protocolo permitiu fácil diferenciação da eficiência reprodutiva entre as duas linhagens, SK1AM e ScAM.
Enquanto as cepas SK1 acasalaram com uma eficiência muito alta, as cepas ScAM acasalaram com uma eficiência relativamente menor. A eficiência de acasalamento das linhagens ScAM caiu significativamente quando o ambiente não continha glicose como fonte primária de carbono, indicando que o acasalamento é um processo energeticamente caro e o crescimento em fontes alternativas de carbono reduz qualitativamente a eficiência do acasalamento. Quando permitido acasalar por diferentes períodos de tempo, nenhum acasalamento foi observado nas primeiras quatro a cinco horas.
Os primeiros diploides apareceram somente após quatro a cinco horas, indicando que este é o tempo necessário para que o processo de acasalamento seja concluído no ambiente dado. Depois disso, a eficiência de acasalamento aumentou rapidamente. Após sete horas, os cálculos de eficiência de acasalamento foram influenciados pelo fato de que o crescimento mitótico começou na placa.
Certifique-se de que o mesmo número de ambos os haploides sejam misturados. Desvios disso levariam a variações nas repetições independentes do protocolo. Como o fluxo gênico afeta a adaptação e a especiação é uma questão em aberto.
Uma vez que os marcadores auxotróficos são inseridos próximos ao locus MAT em nossas linhagens, isso ajuda a resolver essa importante questão.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método robusto e simples para quantificar a eficiência de acasalamento de diversas linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae, com foco em barreiras pré-zigóticas relevantes para estudos de especiação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Eficiência de acasalamento em leveduras
- Estudos de especiação
- Experimentos de fluxo gênico
Contexto
- A eficiência de acasalamento é fundamental para compreender a especiação em leveduras.
- O protocolo permite experimentação com diferentes cepas e condições de levedura.
- A variabilidade no sucesso de acasalamento pode fornecer informações sobre processos evolutivos.
Métodos Utilizados
- Revitalização de cepas de levedura a partir de estoques congelados e crescimento em meio YPD
- Quantificação da eficiência de acasalamento de haploides por meio de incubações controladas
- Medições de densidade óptica para avaliar a concentração celular
Resultados Principais
- Diferenças significativas na eficiência de acasalamento observadas entre as linhagens SK1AM e ScAM.
- A eficiência de acasalamento diminui na ausência de glicose, destacando as exigências metabólicas.
- Padrões de eficiência de acasalamento dependentes do tempo foram documentados, enfatizando a importância da duração da incubação.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para medir a eficiência de acasalamento, oferecendo insights sobre fluxo gênico e adaptação.
- Os achados podem ajudar a responder questões relacionadas à especiação e biologia evolutiva.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da eficiência de acasalamento em Saccharomyces cerevisiae permite a investigação precisa de barreiras reprodutivas pré-zigóticas, apoiando a eliminação de riscos mecanicistas em estudos genéticos e evolutivos. Este protocolo robusto fornece saídas padronizadas e reprodutíveis, essenciais para descobertas iniciais e validação de alvos em sistemas modelo baseados em leveduras. A medição confiável da eficiência de acasalamento orienta decisões em portfólios de engenharia de linhagens e experimentos de fluxo gênico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite avaliação quantitativa do isolamento reprodutivo e fluxo gênico entre linhagens de levedura.
- Apoia a validação funcional de modificações genéticas que afetam vias de acasalamento.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer barreiras pré-zigóticas em sistemas modelo.
- Fornece dados reproduzíveis para seleção e triagem de linhagens orientadas por hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece saídas padronizadas e quantitativas para eficiência de acasalamento em diferentes linhagens de levedura.
- Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio de mistura controlada, incubação e quantificação de colônias.
- Permite a realização de triagens em larga escala de variáveis genéticas ou ambientais que afetam o sucesso do acasalamento.
- Prepara sistemas biológicos validados para triagens genéticas ou fenotípicas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se ao desenvolvimento de biomarcadores translacionais ao quantificar desfechos reprodutivos funcionais.
- Garante a continuidade da descoberta genética até a validação pré-clínica em modelos de levedura.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de cepas geneticamente modificadas para estudos adicionais.
- Fornece confiança preditiva para estudos de fluxo gênico e adaptação relevantes para a biologia evolutiva.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, permitindo testes de hipóteses robustos e a redução de riscos biológicos em fluxos de trabalho de genética de leveduras.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a eficiência de acasalamento para testar hipóteses genéticas ou ambientais sobre barreiras reprodutivas.
- Triagem: Padroniza as condições do ensaio para comparação quantitativa e reprodutível do desempenho de cepas.
- Análises: Utiliza densidade óptica e contagem de colônias para mensuração objetiva e estatística dos resultados de acasalamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação em modelos pré-clínicos baseados em sistemas de levedura.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo amplamente aplicável e independente de cepa para uso repetido em diferentes fundos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade em estudos de validação de alvos e mecanismos.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade, padronização e escalabilidade dos ensaios de acasalamento em leveduras.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou interromper e otimiza a alocação de recursos em fluxos de engenharia de cepas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de cepas e condições experimentais para avanço.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em genética de leveduras e técnica estéril para execução precisa.
- Necessita de acesso a instrumentação padrão de microbiologia, incluindo incubadoras e espectrofotômetros.
- Exige padronização entre equipes quanto aos tempos de incubação, mistura de células e quantificação de colônias.
- Adaptável a diversas cepas de levedura com ajustes menores no protocolo para taxas de crescimento específicas de cada cepa.
- Depende da disponibilidade de marcadores auxotróficos para distinção clara entre haploides e diploides.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Patching of Haploids in the Mating Efficiency Grids
1:55
Mixing of Haploids and Mating
2:55
Plating of Mixed Cells on YPD Agar and Screening for Diploids using Auxotrophic Markers
3:53
Results: Quantification and Dynamics of Mating Efficiency in Saccharomyces cerevisiae (Yeast)
5:03
Conclusion
