Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae
December 2nd, 2022
Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.
Este protocolo é um método simples para quantificar a eficiência com que diferentes cepas e espécies de leveduras se acasalam entre si. O método proposto é simples, robusto e eficiente. O método pode ser estendido a qualquer cepa de levedura.
O método descrito neste estudo pode ser usado para entender como ocorre a especiação em leveduras. Além disso, as cepas que descrevemos podem ser particularmente úteis para projetar experimentos com fluxo gênico. A força do método é que ele é muito simples.
Alguns pequenos ajustes, como o tempo de incubação, podem ser necessários, dependendo da cepa específica usada. Comece a reviver os haploides A e Alpha de estoques congelados, dedilhando o inóculo de levedura em um extrato de levedura peptona dextrose, ou placa de ágar YPD. Deixe-os crescer por 48 horas a 30 graus Celsius para obter colônias únicas.
Após a incubação, inocular colônias únicas da placa YPD e cinco mililitros de meio YPD e incubar a 30 graus Celsius por 48 horas com agitação a 250 RPM. As células encontram-se na fase estacionária de crescimento após este período de incubação. Em uma placa YPD fresca, desenhe a grade de eficiência de acasalamento como um retângulo de 1 por 1,5 centímetro dividido em três caixas, cada uma com uma dimensão de 1 por 0,5 centímetro.
Inocular cinco microlitros da cultura YPD dos dois tipos de acasalamento nos retângulos mais à esquerda e mais à direita. Este volume corresponde a cerca de 5 vezes 10 a quinta células haploides em cada seção. Incubar as placas por 24 horas a 30 graus Celsius.
Para misturar um número igual de células de levedura, remova cerca de 1/3 do crescimento de levedura desenvolvido nas caixas externas usando um palito estéril e ressuspenda as células removidas em 20 microlitros de água em um frasco estéril de 1,5 mililitro. Siga isso para cada haploide. Em seguida, diluir cinco microlitros dessa suspensão em dois mililitros de água e medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro a 600 nanômetros.
Com base no valor da densidade óptica e no número de células por mililitro em uma densidade óptica, adicione os volumes necessários de ambos os haploides em um frasco fresco e estéril de 1,5 mililitro. Misture bem usando uma pipeta. O volume final desta suspensão é geralmente em torno de seis a oito microlitros.
Em seguida, inocular essa suspensão na grade central. Incubar a placa a 30 graus Celsius por sete horas, permitindo que os haploides se acasalem. Após sete horas de incubação, raspe as células do retângulo central usando um palito ou uma ponta de pipeta e dilua em dois mililitros de água estéril.
Realizar diluições adicionais e, em seguida, espalhar a suspensão celular em ágar YPD para obter colônias únicas. Após o plaqueamento, incubar as placas de YPD a 30 graus Celsius por 36 a 48 horas para desenvolver colônias únicas. Certifique-se de que algumas centenas de colônias individuais sejam obtidas de cada experimento de acasalamento para triagem para garantir a significância estatística dos dados.
Para identificar as colônias diploides na placa, transfira as colônias únicas, strandando-as individualmente em uma placa de gotejamento duplo, sem os aminoácidos para os quais as cepas são auxotróficas. Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas e calcular a eficiência de acasalamento, nu. A robustez do protocolo permitiu fácil diferenciação da eficiência reprodutiva entre as duas linhagens, SK1AM e ScAM.
Enquanto as cepas SK1 acasalaram com uma eficiência muito alta, as cepas ScAM acasalaram com uma eficiência relativamente menor. A eficiência de acasalamento das linhagens ScAM caiu significativamente quando o ambiente não continha glicose como fonte primária de carbono, indicando que o acasalamento é um processo energeticamente caro e o crescimento em fontes alternativas de carbono reduz qualitativamente a eficiência do acasalamento. Quando permitido acasalar por diferentes períodos de tempo, nenhum acasalamento foi observado nas primeiras quatro a cinco horas.
Os primeiros diploides apareceram somente após quatro a cinco horas, indicando que este é o tempo necessário para que o processo de acasalamento seja concluído no ambiente dado. Depois disso, a eficiência de acasalamento aumentou rapidamente. Após sete horas, os cálculos de eficiência de acasalamento foram influenciados pelo fato de que o crescimento mitótico começou na placa.
Certifique-se de que o mesmo número de ambos os haploides sejam misturados. Desvios disso levariam a variações nas repetições independentes do protocolo. Como o fluxo gênico afeta a adaptação e a especiação é uma questão em aberto.
Uma vez que os marcadores auxotróficos são inseridos próximos ao locus MAT em nossas linhagens, isso ajuda a resolver essa importante questão.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método robusto e simples para quantificar a eficiência de acasalamento de várias cepas da levedura Saccharomyces cerevisiae, focando em barreiras pré-zigóticas relevantes para estudos de especiação.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Eficiência de acasalamento de levedura
- Estudos de especiação
- Experimentos de fluxo gênico
Fundamentos
- A eficiência de acasalamento é crucial para entender a especiação em leveduras.
- O protocolo permite a experimentação com diferentes cepas e condições de levedura.
- A variabilidade no sucesso de acasalamento pode fornecer insights sobre processos evolutivos.
Métodos Utilizados
- Revitalização de cepas de levedura a partir de estoques congelados e crescimento em meio YPD
- Quantificação da eficiência de acasalamento haplóide através de incubações controladas
- Medições de densidade óptica para avaliar a concentração celular
Principais Resultados
- Diferenças significativas na eficiência de acasalamento observadas entre as cepas SK1AM e ScAM.
- A eficiência de acasalamento diminui na ausência de glicose, destacando as demandas metabólicas.
- Padrões de eficiência de acasalamento dependentes do tempo foram documentados, enfatizando a importância da duração da incubação.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para medir a eficiência de acasalamento, oferecendo insights sobre fluxo gênico e adaptação.
- Os resultados podem ajudar a responder questões sobre especiação e biologia evolutiva.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantifying mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of pre-zygotic reproductive barriers, supporting mechanistic de-risking in genetic and evolutionary studies. This robust protocol provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in yeast-based model systems. Reliable measurement of mating efficiency informs portfolio decisions in strain engineering and gene flow experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of reproductive isolation and gene flow between yeast strains.
- Supports functional validation of genetic modifications impacting mating pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pre-zygotic barriers in model systems.
- Provides reproducible data for hypothesis-driven strain selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs for mating efficiency across diverse yeast backgrounds.
- Supports assay reproducibility through controlled mixing, incubation, and colony quantification.
- Enables scalable screening of genetic or environmental variables affecting mating success.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic or phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by quantifying functional reproductive outcomes.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation in yeast models.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for further study.
- Provides predictive confidence for gene flow and adaptation studies relevant to evolutionary biology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling robust hypothesis testing and biological de-risking in yeast genetics workflows.
- Discovery Biology: Quantifies mating efficiency to test genetic or environmental hypotheses about reproductive barriers.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative comparison of strain performance.
- Analytics: Employs optical density and colony counts for objective, statistical measurement of mating outcomes.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical model validation in yeast-based systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, strain-agnostic protocol for repeated use across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of yeast mating assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in strain engineering pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of strains and experimental conditions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and sterile technique for accurate execution.
- Needs access to standard microbiology instrumentation, including incubators and spectrophotometers.
- Demands cross-team standardization of incubation times, cell mixing, and colony quantification.
- Adaptable to various yeast strains with minor protocol adjustments for strain-specific growth rates.
- Dependent on auxotrophic marker availability for clear haploid/diploid distinction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Patching of Haploids in the Mating Efficiency Grids
1:55
Mixing of Haploids and Mating
2:55
Plating of Mixed Cells on YPD Agar and Screening for Diploids using Auxotrophic Markers
3:53
Results: Quantification and Dynamics of Mating Efficiency in Saccharomyces cerevisiae (Yeast)
5:03
Conclusion
