Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos
3 de fevereiro de 2023
Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.
Este protocolo permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que expressam os principais fatores de transcrição adipogênicos, marcadores de adipócitos maduros e têm potencial termogênico e fenótipo morfológico de adipócitos marrons maduros. Este é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável para obter células com características de adipócitos marrons maduros a partir de tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo permite estudar os mecanismos de ativação do tecido adiposo marrom como alvo para o tratamento da obesidade.
Tem sido um modelo para determinar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da lipodistrofia. Espera-se que a execução dessa técnica pela primeira vez seja um desafio. É essencial ter um protocolo detalhado e enfatizar pontos críticos para ter resultados bem-sucedidos.
Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito ventral e faça uma incisão na pele de um centímetro de comprimento no nível médio das costas do animal usando uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado, retire cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena. Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.
Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mililitros de PBS estéril em temperatura ambiente. Incubar os tecidos do iBAT em tampão de digestão colagenase tipo dois por 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave contínua a 800 RPM. Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão colagenase tipo dois, pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000 e pontas de filtro.
Use uma nova ponta para cada amostra. Passe os tecidos dessegregados através de filtros de células individuais de 100 micrômetros para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de tampão ACK às amostras de tecido filtrado.
Inverter os tubos quatro a cinco vezes e incubar à temperatura ambiente durante quatro minutos. Em seguida, passe as suspensões por um filtro de células de 40 micrômetros em novos tubos de 1,5 mililitro usando uma micropipeta P1000 e pontas filtradas. Centrifusion ressuspende o pellet conforme descrito no manuscrito do texto.
Em seguida, semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços, adicionando um mililitro da suspensão a cada poço. Os pré-adipócitos indiferenciados apresentaram níveis muito baixos ou indetectáveis de ppar-gama, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Em contraste, esses marcadores foram significativamente maiores no sétimo dia de diferenciação.
O acúmulo de múltiplas gotículas lipídicas nos pré-adipócitos marrons foi consistente com os resultados publicados anteriormente. Um aumento significativo foi observado nos níveis de proteína do marcador de massa mitocondrial TOM 20 e do complexo de fosforilação oxidativa no sétimo dia de diferenciação. UCP1, um marcador genuíno deste tipo de célula, não foi detectado em pré-adipócitos indiferenciados, enquanto foi substancialmente expresso em adipócitos marrons maduros no sétimo dia de diferenciação.
As mitocôndrias evoluíram de uma forma tubular alongada no dia zero para uma forma arredondada ou semelhante a um feijão no dia sete. A estrutura interna mitocondrial também foi modificada pela adipogênese, resultando em maior densidade dos cristais compactados paralelamente. É importante ressaltar que as mitocôndrias estavam intimamente associadas a gotículas lipídicas nos adipócitos marrons diferenciados, de modo que nenhuma distância discernível entre a membrana externa da mitocôndria e as superfícies das gotículas lipídicas pôde ser detectada, mesmo com microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução.
A remoção cirúrgica do tecido adiposo interescapular é crítica. Uma quantidade ineficiente de tecido limita a disponibilidade de células que serão diferenciadas. Esta técnica de imagem ajuda a caracterizar a morfologia de adipócitos marrons diferenciados in vitro.
É possível realizar ensaios para função mitocondrial, ativação beta androgênica e inibição autofágica.
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Visão Geral
Este estudo fornece um protocolo detalhado para a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos marrons maduros utilizando tecido adiposo marrom interscapular obtido de camundongos recém-nascidos. As células diferenciadas exibem acúmulo característico de lipídios, expressam marcadores adipogênicos-chave e apresentam adaptações mitocondriais indicativas de funcionalidade termogênica.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia dos adipócitos
- Pesquisa sobre obesidade
- Mecanismos da termogênese
Contexto
- Investigação do papel do tecido adiposo marrom no metabolismo energético
- Modelagem de condições relacionadas à obesidade e lipodistrofia
- Importância da diferenciação de pré-adipócitos para o estudo da adipogênese
Métodos Utilizados
- Imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão
- Tecido adiposo marrom interescaupal de camundongos recém-nascidos
- Protocolos de diferenciação celular e ensaios para características mitocondriais
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de pré-adipócitos em adipócitos maduros, marcada pelo acúmulo de gotículas lipídicas
- Expressão aumentada de fatores de transcrição adipogênicos e marcadores termogênicos no sétimo dia de diferenciação
- Caracterização das alterações na morfologia mitocondrial associadas à adipogênese
Conclusões
- Este protocolo permite o estudo reproduzível da diferenciação e das funções dos adipócitos marrons.
- Relevância para a compreensão da obesidade e de potenciais alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A diferenciação eficiente e a imagem de adipócitos marrons a partir do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos permitem um modelagem in vitro robusta da biologia da gordura termogênica. Essa capacidade apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em portfólios de doenças metabólicas, particularmente na pesquisa de obesidade e lipodistrofia. A reprodutibilidade do protocolo e a preservação de características-chave do tecido adiposo marrom facilitam a confiança preditiva em ensaios funcionais subsequentes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de ativação de adipócitos marrons relevantes para alvos de doenças metabólicas.
- Apoia a desmistificação biológica ao confirmar a expressão de marcadores termogênicos e adipogênicos.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de fenótipos mitocondriais e lipídicos quantificáveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um sistema padronizado para o preparo de adipócitos marrons maduros para triagem de compostos.
- Garante reprodutibilidade e avaliação quantitativa de marcadores de diferenciação e função mitocondrial.
- Permite leituras baseadas em imagem para avaliar os efeitos de compostos sobre a morfologia e função de adipócitos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha fenótipos de adipócitos in vitro com a biologia do tecido adiposo marrom (BAT) relevante para doenças, garantindo continuidade translacional.
- Apóia o avanço de programas para doenças metabólicas com ajuste de risco, modelando a ativação e disfunção do BAT.
- Facilita o alinhamento de biomarcadores por meio da quantificação de UCP1 e adaptações mitocondriais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer um sistema validado para testes de hipóteses, triagem e estudos mecanicistas da biologia dos adipócitos marrons.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre ativação do tecido adiposo marrom e vias de diferenciação adipogênica.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para avaliação de compostos em adipócitos marrons maduros.
- Análises: Permite a medição da expressão de fatores de transcrição, massa mitocondrial e associação de gotículas lipídicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à função do tecido adiposo marrom in vivo e modelos de doenças metabólicas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para iniciativas contínuas de pesquisa metabólica e obesidade.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na descoberta direcionada à BAT e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de diferenciação e de imagem para garantir reprodutibilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não em alvos para doenças metabólicas, ao permitir ensaios funcionais robustos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas terapêuticos relacionados à BAT.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecidos, cultivo celular e técnicas avançadas de imagem.
- Requer acesso à infraestrutura de microscopia de imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica de transmissão.
- Necessita padronização de protocolos para reprodutibilidade entre equipes de pesquisa.
- Pode exigir adaptação para diferentes linhagens de camundongos ou estágios de desenvolvimento.
- O rendimento celular e a eficiência de diferenciação dependem do manuseio e processamento preciso dos tecidos.
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