Name: Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Aprenda a diferenciar adipócitos marrons a partir de tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo reprodutível permite estudar termogênese e mecanismos relacionados à obesidade.

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O financiamento foi fornecido pela FONDECYT (1181214 e 1221146) e Anillos (ACT210039) para bolsas de VC e doutorado ANID 21171743 para AMF e ANID 21150665 para FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga pela ajuda no processamento das amostras e assessoria técnica para a microscopia eletrônica de transmissão. As ilustrações foram produzidas usando BioRender.

Os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Pontifícia Universidade Católica do Chile. Camundongos recém-nascidos P0,5 de ambos os sexos, derivados de um fundo misto de cepas C57BL/6J e 129J, foram usados para este estudo.
1. Extração de tecido
<ol><li>Limpe e desinfete a bancada com uma solução de etanol a 70% e use material cirúrgico estéril.</li>
	<li>Eutanasiar filhotes recém-nascidos P0,5 por decapitação com tesoura cirúrgica seguindo o protocolo aprovado institucionalmente.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito ventral (virado para baixo) e faça uma incisão de 1 cm de comprimento na pele ao nível médio das costas do animal com uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado. NOTA: Esta etapa é crítica porque, se a pele não for bem removida, pode rasgar e danificar o iBAT e impedir a preparação ideal do SVF.</li>
	<li>Separe cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena. NOTA: O IBAT é visualizado como dois lóbulos gordurosos que podem ser removidos independentemente.</li>
	<li>Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.</li>
	<li>Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mL de PBS estéril em temperatura ambiente. Mantenha os tecidos em seus tubos individuais até que a extração de tecido seja concluída para todos os filhotes necessários.</li>
</ol>2. Digestão de tecidos
<ol><li>Alíquota de 300 μL de tampão de digestão de colagenase tipo II (0,2% de colagenase tipo II em tampão [25 mM de KHCO3, 1,2 mM de MgSO4, 120 mM de NaCl, 5 mM de glicose, 12 mM de KH2PO4, 4,8 mM de KCl, 1,2 mM de CaCl2, 2,5% de BSA e 1% de penicilina/estreptomicina, em pH 7,4]) (Tabela 1) em tubos de 1,5 mL em gabinete de biossegurança. NOTA: Prepare tubos suficientes para o número de tecidos individuais a serem extraídos. No presente estudo, foram utilizados sete tubos, correspondendo a uma ninhada de sete filhotes.</li>
	<li>Vá para a bancada e coloque os lobos do iBAT no tampão de digestão da colagenase tipo II para degradar a matriz extracelular.</li>
	<li>Incubar os tecidos do iBAT durante 45 min a 37 °C com agitação suave contínua a 800 rpm (figura 1).</li>
</ol>3. Processamento de tecidos
NOTA: Após a digestão, execute todas as etapas a seguir em uma capela de cultura de tecidos de fluxo laminar classe II.
<ol><li>Prepare e rotule dois conjuntos de tubos de plástico de 1,5 mL para cada amostra individual.</li>
	<li>Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão da colagenase tipo II pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1.000 e pontas filtradas. Use uma nova ponta para cada amostra. NOTA: Esta é uma etapa crítica. Certifique-se de desagregar mecanicamente o tecido com a ponta e pipetar para cima e para baixo até que a homogeneização macroscópica esteja completa.</li>
	<li>Passe os tecidos desagregados através de filtros de células individuais de 100 μm (consulte a Tabela de Materiais) em novos tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão ACK (consulte a Tabela de Materiais) às amostras de tecido filtrado, inverta os tubos 4-5 vezes e incube em temperatura ambiente por 4 min. NOTA: Não exceda o tempo de incubação, pois isso pode danificar as células de interesse.</li>
	<li>Centrifugue as amostras de tecido a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico antimicótico a 1%, pH 7,2) (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Passe as suspensões por um filtro de células de 40 μm em novos tubos de 1,5 mL usando uma micropipeta P1.000 e pontas filtradas.</li>
	<li>Centrifugue as amostras a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. NOTA: O pellet corresponde ao SVF contendo pré-adipócitos.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de cultura pipetando.</li>
	<li>Prepare um tubo de 15 mL para cada amostra, adicionando 5 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Adicione cada pellet ressuspenso ao seu tubo de 15 ml correspondente, contendo 5 ml de meio de cultura. Inverta o tubo 4-5 vezes para misturar o conteúdo da célula.</li>
	<li>Semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços adicionando 1 mL da suspensão a cada poço (Figura 1).</li>
</ol>4. Cultura da fração vascular estromal (SVF)
<ol><li>Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam 100% de confluência. NOTA: Durante este período, as células aderentes não plásticas são removidas, resultando em uma cultura primária enriquecida com um SVF contendo pré-adipócitos.</li>
	<li>Quando as células se tornarem 100% confluentes, remova o meio de cultura e lave as células com 800 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Adicione 150 μL de tripsina-EDTA a 0,25% (consulte a Tabela de Materiais) a cada poço e coloque a placa de cultura por 3 min na incubadora para o descolamento das células. NOTA: Verifique se as células estão separadas usando um microscópio de luz de contraste de fase.</li>
	<li>Inative a tripsina adicionando 850 μL de meio de cultura a cada poço.</li>
	<li>Colete as células dos seis poços semeados na etapa 3.12 e transfira-as para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Faça o volume total até 12 mL adicionando 6 mL de meio de cultura. Inverta o tubo 4-5 vezes para misturar o conteúdo.</li>
	<li>Semeie 1 mL da amostra em cada poço de uma placa de 12 poços. Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam a confluência.</li>
	<li>Quando as células se tornarem 100% confluentes, separe-as com 150 μL de tripsina-EDTA a 0,25% seguindo as mesmas condições de incubação da etapa 4.3 e semeie-as de acordo com a área de superfície do poço necessária para o experimento.</li>
	<li>Realize imagens de alta resolução após fixar as células seguindo a etapa 8. NOTA: Uma densidade de 35.000 células/cm² é recomendada para experimentos posteriores (extração de proteína e RNA total, 330.000 células [um poço de uma placa de 6 poços]; imunofluorescência [IF], 10.500 células [um poço de uma placa de 96 poços]).</li>
</ol>5. Diferenciação adipogênica
<ol><li>Incubar as células com meio de indução (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico antibiótico a 1%, pH 7,2, suplementado com dexametasona 500 nM, indometacina 125 nM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM [IBMX], rosiglitazona 5 μM, T3 1 nM e insulina 20 nM) (Tabela 1) por 72 h (dia 0 ao dia 2) (Figura 2). NOTA: O meio de cultura deve ser trocado em dias alternados; Assim, a primeira mudança do meio deve ocorrer no dia 2 após a indução inicial.</li>
	<li>Mude para meio de manutenção (DMEM-F12 com 10% de FBS, antibiótico a 1%, pH 7,2, suplementado com 5 μM de rosiglitazona, 1 nM de T3 e 20 nM de insulina) (Tabela 1) no dia 3 e mantenha esse meio de manutenção até o dia 7 (Figura 2). NOTA: O meio de manutenção deve ser trocado no dia 5 e no dia 7. Pequenas gotículas lipídicas podem ser visualizadas por microscopia de contraste de fase a partir do dia 3 de diferenciação. Grandes gotículas lipídicas são evidentes no dia 7 de diferenciação. Procedimentos de diferenciação com mais de 7 dias resultam em perda celular por descolamento, provavelmente devido à alta flutuabilidade das células carregadas de lipídios.</li>
</ol>6. Preparação do homogeneizado celular
<ol><li>Remova o meio de cultura no dia 0 e no dia 7 de diferenciação e lave as células 3 vezes com PBS estéril.</li>
	<li>Após a última limpeza, adicione 1,3 mL de PBS estéril a cada poço. NOTA: Mantenha as células no gelo até a limpeza da última placa.</li>
	<li>Colha as células mecanicamente de um poço de uma placa de 6 poços (~ 330.000 células) com um raspador de células e coloque a suspensão celular em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugue as amostras a 2.800 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova o PBS com uma micropipeta e mantenha os tubos no gelo.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet celular em tampão RIPA com inibidores de protease e fosfatase (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 30 min em gelo. NOTA: Para lisar o pellet celular, 70-80 μL são suficientes.</li>
	<li>Centrifugue as amostras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL e descarte o pellet. NOTA: O sobrenadante representa o homogeneizado celular.</li>
	<li>Determinar a concentração proteica do homogeneizado celular usando ácido bicinconínico (BCA) para a detecção colorimétrica e quantificação da proteína total18,19.</li>
</ol>7. Western blotting
<ol><li>Preparar 30 μg do homogeneizado celular (a partir do passo 6.8) e adicionar tampão de carregamento de amostras SDS-PAGE disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Resolva em eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS20 (PAGE-SDS) de acordo com o peso molecular de cada proteína. NOTA: Use 10% PAGE-SDS para PPARγ, C / EBPα, PLIN1, CD36 e UCP1, 12% PAGE-SDS para OXPHOS e 15% PAGE-SDS para TOM20 (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Eletrotransfira as proteínas para a membrana de PVDF (consulte a Tabela de Materiais) a 350 mA por 2 h. NOTA: O recipiente de gelo deve ser trocado após 1 h. Durante todo o processo, mantenha a câmara no gelo.</li>
	<li>Bloqueie as membranas com 5% de BSA ou leite sem gordura em solução salina tamponada com Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) por 2 h seguindo as recomendações das folhas de dados dos anticorpos.</li>
	<li>Incubar com os anticorpos primários (os anticorpos utilizados neste estudo são detalhados na Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C. NOTA: Todos os anticorpos utilizados neste estudo foram diluídos para 1:1.000 em solução de bloqueio.</li>
	<li>Lave as membranas 3 vezes com 0,1% de TBS-T e incube-as com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (consulte a Tabela de Materiais) por 2 h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as membranas 3 vezes com 0,1%. TBS-T. Faça uma última lavagem com 1x TBS. Armazene as membranas em 1x TBS até a visualização. Recomenda-se armazenar por no máximo 1 h.</li>
	<li>Visualize as membranas por quimioluminescência20 ou qualquer outro método preferido.</li>
</ol>8. Imagens de alta resolução
<ol><li>Realize o ensaio de imunofluorescência seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Semeie e diferencie as culturas primárias de pré-adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos P0,5 (seguindo a etapa 4.8) em placas de 96 poços com fundo óptico (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Fixe as células no dia 0 e no dia 7 de diferenciação com PFA a 4% por 20 min e lave 3 vezes com PBS estéril.</li>
		<li>Permeabilize as células com Triton X-100 a 0,1% por 15 min e bloqueie-as com gelatina de peixe a 3% (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave 3 vezes com PBS estéril e incube com anticorpo PLIN1 (1:400, consulte a Tabela de Materiais) em 1% BSA / PBS durante a noite a 4 ° C em uma câmara úmida.</li>
		<li>Lave 3 vezes com PBS estéril e incube com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente.</li>
		<li>Manchar os núcleos com 1 μg/mL Hoechst 33342 e as gotículas lipídicas com 1 μg/mL BODIPY por 30 min à temperatura ambiente. NOTA: As imagens de fluorescência foram adquiridas usando um sistema de imagem celular (consulte a Tabela de Materiais). No geral, 9 ou 16 fotos por poço foram adquiridas com dois a três canais com uma ampliação de 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a microscopia eletrônica de transmissão seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Cultive e diferencie os pré-adipócitos marrons em placas de cultura de células de 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>No dia 0 e no dia 7 de diferenciação, remova o meio e fixe as células por 1 h com glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,0 (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Lave as células 3 vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M por 10 min e trate-as com tetróxido de ósmio aquoso a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 15 min.</li>
		<li>Lave as células 3 vezes com água bidestilada por 5 min e trate-as com acetato de uranila a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 15 min.</li>
		<li>Desidrate as células com um gradiente de etanol de 30%, 50%, 70%, 95% e 100% por 5 minutos de cada vez.</li>
		<li>Pré-incorpore as células em epon / etanol 1: 1 por 30 min e depois em epon por 1 h (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: A inclusão de células é realizada diretamente no prato, adicionando epon fresco para cobrir toda a monocamada de cultura de células. Deixe o epon polimerizar em um forno a 60 ° C por 24 h.</li>
		<li>Mergulhe a placa de cultura de células em nitrogênio líquido por 2 min e, em seguida, frature-a usando um alicate para soltar a inclusão de plástico.</li>
		<li>Cole os segmentos de inclusão com células em um bloco de resina para obter cortes finos (80 nm) paralelos à superfície em um ultramicrótomo (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Manchar os cortes com acetato de uranila a 1% por 4 min e citrato de chumbo por 5 min, de acordo com Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualize as grades em um microscópio eletrônico (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O presente protocolo é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável (Figura 2) para gerar células com as características moleculares e morfológicas de adipócitos marrons maduros. A colheita cirúrgica do iBAT é o primeiro passo crítico porque a ruptura do tecido limita severamente a viabilidade do material de partida. O processamento de tecidos também é fundamental porque uma suspensão celular homogênea e livre de detritos aumenta muito a quantidade de SVF que pode ser culti...

O tecido adiposo branco e marrom diferem em sua localização anatômica, origem celular, função, morfologia e massa total. O tecido adiposo branco (TAB) é o principal reservatório de energia fisiológica do corpo e armazena grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) em células altamente especializadas que possuem uma única gotícula lipídica gigante ocupando a maior parte de seu volume celular1. A lipólise TAG libera ácidos graxos livres, que entram na circulação sistêmica para atender às demandas de energia durante o jejum ou outros estados de balanço energético negativo. Além disso, o WAT secreta produtos proteicos e lipídicos, chamados adipocinas e lipocinas, respectivamente, que possuem funções reguladoras metabólicas, imunológicas e reprodutivas, tornando o WAT o maior tecido endócrino do corpo2.
O tecido adiposo marrom (BAT) é um órgão muito menor cuja principal função fisiológica é a termogênese sem tremores para prevenir a hipotermia. Em camundongos e humanos recém-nascidos, o BAT é um órgão bem definido localizado no espaço interescapular. Humanos adultos não têm BAT interescapular (iBAT); no entanto, eles desenvolvem aglomerados de células marrons semelhantes a adipócitos integradas em depósitos que, de outra forma, compreendem principalmente o WAT. Esses adipócitos "marrom-em-branco" (brite) compartilham características morfológicas e moleculares com os adipócitos clássicos do iBAT, mas têm uma origem celular diferente 3,4.
Em contraste com os adipócitos brancos, os adipócitos marrons têm múltiplas gotículas lipídicas pequenas e mitocôndrias abundantes5. A proteína de desacoplamento 1 (UCP1, também conhecida como termogenina) é expressa exclusivamente por adipócitos marrons e brite e medeia o vazamento de prótons na membrana mitocondrial interna (IMM), desacoplando assim o transporte de elétrons da síntese de ATP e gerando calor. A termogênese sem tremores no BAT é ativada pela norepinefrina (NE), que é liberada dos terminais simpáticos no BAT em resposta à estimulação fria6. O NE se liga aos receptores beta-adrenérgicos (principalmente beta 3) na superfície dos adipócitos marrons e desencadeia uma cascata de sinalização mediada por cAMP intracelular. Isso resulta em lipólise de TAG, beta-oxidação de ácidos graxos mitocondriais e geração de calor após a ativação de UCP13. A estreita relação funcional entre gotículas lipídicas e mitocôndrias em adipócitos marrons tem paralelos estruturais, como a interação entre essas organelas em áreas grandes e com contato físico muito estreito 7,8.
O iBAT tem vasos sanguíneos abundantes e terminais simpáticos9. Essas estruturas, juntamente com os pré-adipócitos, células imunes, fibroblastos e moléculas da matriz extracelular, compõem a fração vascular estromal adiposa (FVS)10. Muitos protocolos foram relatados para gerar adipócitos maduros a partir de pré-adipócitos 11,12,13,14,15 (Tabela Suplementar 1); no entanto, eles exibem variações extremas no processamento de tecidos e na composição dos meios de cultura de diferenciação. O protocolo aqui descrito permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que (1) expressam os principais fatores de transcrição adipogênica receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e CCAAT/proteína alfa de ligação ao intensificador (C/EBPα), (2) expressam os marcadores de adipócitos maduros perilipina1 (PLIN1) e determinante de cluster 36 (CD36), (3) acumulam gotículas lipídicas abundantes, (4) têm alta massa mitocondrial e uma alta abundância de complexos OXPHOS, (5) têm potencial termogênico, determinado por altos níveis de UCP1, e (6) têm alterações morfológicas mitocondriais associadas ao fenótipo de adipócitos marrons maduros. Essa metodologia é utilizada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à lipodistrofia generalizada 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído Solução Aquosa</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>35 mm TC-tratado Easy-Grip Estilo Placa de Cultura de Células</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>40% Solução de Acrilamida/Bis, 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços&nbsp;</td><td>SPL Ciências da Vida&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>96 poços ópticos pretos com tampa para cultura de células estéreis</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler RGB Plus Escada de Proteína Pré-manchada&nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lisificação&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>Anti-mouse IgG, Anticorpo Ligado a HRP</td><td>Sinalização Celular</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG, Anticorpo Ligado a HRP&nbsp; &nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de grau de blotting&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alpha; anticorpo</td><td>Sinalização Celular</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>208291</tr><tr><td>CD36 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase tipo II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode</td><td>Reader Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexametasone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, pó</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 KIT DE INCORPORAÇÃO (EPON)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Merck&nbsp;</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele de peixe de água fria</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Solução Aquosa de Glutaraldeído 25%</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário de AngiG (H+L) Anti-Ácido Cruzado Anti-Coelho de Cabra, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inibidor de Fosfatase Coquetel 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Halt Cocktail 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Invitrogen</td><td>H1398</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immun-Blot&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I7378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Lane Marker Reducing Sample Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ estéril à água&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofile Total OXPHOS Anticorpos de roedores WB Cocktail</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>1064041000</tr><tr><td>OmniPur&nbsp; 10x PBS Concentrado Líquido</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio&nbsp;</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Perilipin 1</td><td>Sinalização Celular</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gama; (81B8) anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer lysis&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Cacpdilato de Sódio</td><td>Sciences 12300</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfato de Sódio&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 anticorpo</td><td>Sinalização Celular</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Sinalização Celular</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Grau de Biologia Molecular</td><td>Promega&nbsp;</td><td>Anticorpo H5152</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>Sinalização Celular</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td> <td>de Acetato de Uranila</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sun&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Westar Supernova&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

O tecido adiposo marrom (BAT) está presente apenas em mamíferos e tem função termogênica. Os adipócitos marrons são caracterizados por um citoplasma multilocular com múltiplas gotículas lipídicas, um núcleo central, um alto conteúdo mitocondrial e a expressão da proteína desacopladora 1 (UCP1). O BAT foi proposto como um potencial alvo terapêutico para a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados devido à sua capacidade de dissipar energia metabólica como calor. Para investigar a função e regulação do BAT, a cultura de adipócitos marrons é indispensável. O presente protocolo otimiza o processamento de tecidos e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos marrons de camundongos recém-nascidos. Além disso, são mostrados procedimentos para a imagem de adipócitos diferenciados com imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica de transmissão. Nos adipócitos marrons diferenciados com as técnicas aqui descritas, as principais características definidoras do BAT clássico são preservadas, incluindo altos níveis de UCP1, aumento da massa mitocondrial e contato físico muito próximo entre as gotículas lipídicas e as mitocôndrias, tornando este método uma ferramenta valiosa para estudos de BAT.

A adipogênese é regulada por uma rede de fatores de transcrição que são responsáveis tanto pela expressão de proteínas-chave que induzem a formação e o funcionamento dos adipócitos marrons22, incluindo reguladores adipogênicos clássicos como PPARγ e C / EBPα23 , 24 , 25 , bem como marcadores de adipócitos maduros26 , 27. Através do teste das difer...

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Este protocolo permite a diferenciação eficiente e reprodutível de adipócitos marrons que expressam os principais fatores de transcrição adipogênicos, marcadores de adipócitos maduros e têm potencial termogênico e fenótipo morfológico de adipócitos marrons maduros. Este é um procedimento de diferenciação bifásica simples e replicável para obter células com características de adipócitos marrons maduros a partir de tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo permite estudar os mecanismos de ativação do tecido adiposo marrom como alvo para o tratamento da obesidade.Tem sido um modelo para determinar os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da lipodistrofia. Espera-se que a execução dessa técnica pela primeira vez seja um desafio. É essencial ter um protocolo detalhado e enfatizar pontos críticos para ter resultados bem-sucedidos.Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito ventral e faça uma incisão na pele de um centímetro de comprimento no nível médio das costas do animal usando uma tesoura afiada. Remova a pele com cuidado, retire cirurgicamente o iBAT da carcaça usando uma tesoura pequena. Colha os dois lóbulos do iBAT usando um alicate de ponta curva para remover os lóbulos de forma independente.Coloque os dois lóbulos em um tubo de plástico com 1,5 mililitros de PBS estéril em temperatura ambiente. Incubar os tecidos do iBAT em tampão de digestão colagenase tipo dois por 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave contínua a 800 RPM. Interrompa mecanicamente a suspensão tecidual no tampão de digestão colagenase tipo dois, pipetando para cima e para baixo usando uma micropipeta P1000 e pontas de filtro.Use uma nova ponta para cada amostra. Passe os tecidos dessegregados através de filtros de células individuais de 100 micrômetros para novos tubos de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de tampão ACK às amostras de tecido filtrado.Inverter os tubos quatro a cinco vezes e incubar à temperatura ambiente durante quatro minutos. Em seguida, passe as suspensões por um filtro de células de 40 micrômetros em novos tubos de 1,5 mililitro usando uma micropipeta P1000 e pontas filtradas. Centrifusion ressuspende o pellet conforme descrito no manuscrito do texto.Em seguida, semeie cada amostra em seis poços de uma placa de cultura de 24 poços, adicionando um mililitro da suspensão a cada poço. Os pré-adipócitos indiferenciados apresentaram níveis muito baixos ou indetectáveis de ppar-gama, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Em contraste, esses marcadores foram significativamente maiores no sétimo dia de diferenciação.O acúmulo de múltiplas gotículas lipídicas nos pré-adipócitos marrons foi consistente com os resultados publicados anteriormente. Um aumento significativo foi observado nos níveis de proteína do marcador de massa mitocondrial TOM 20 e do complexo de fosforilação oxidativa no sétimo dia de diferenciação. UCP1, um marcador genuíno deste tipo de célula, não foi detectado em pré-adipócitos indiferenciados, enquanto foi substancialmente expresso em adipócitos marrons maduros no sétimo dia de diferenciação.As mitocôndrias evoluíram de uma forma tubular alongada no dia zero para uma forma arredondada ou semelhante a um feijão no dia sete. A estrutura interna mitocondrial também foi modificada pela adipogênese, resultando em maior densidade dos cristais compactados paralelamente. É importante ressaltar que as mitocôndrias estavam intimamente associadas a gotículas lipídicas nos adipócitos marrons diferenciados, de modo que nenhuma distância discernível entre a membrana externa da mitocôndria e as superfícies das gotículas lipídicas pôde ser detectada, mesmo com microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução.A remoção cirúrgica do tecido adiposo interescapular é crítica. Uma quantidade ineficiente de tecido limita a disponibilidade de células que serão diferenciadas. Esta técnica de imagem ajuda a caracterizar a morfologia de adipócitos marrons diferenciados in vitro.É possível realizar ensaios para função mitocondrial, ativação beta androgênica e inibição autofágica.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método de imagiologia funcional do rato tecido adiposo castanho (BAT), que é descrito no frio estimulada a captação de 18F-fluorodeoxiglicose (FDG) em BAT é avaliada de forma não invasiva com um protocolo padronizado micro-PET/CT. Este método é robusto e sensível para detectar diferenças nas atividades da BAT em modelos do rato.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Neste relatório em vídeo, mostramos a aplicação da Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) para tecido adiposo marrom interescapular em camundongos sob condições ativadas e deprimidas.

Cerenkov luminescência imagem de Interscapular Brown tecido adiposo

O método aqui apresentado utiliza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia por emissão de pósitrons / tomografia computadorizada (PET-CT) e água gordura separada ressonância magnética (MRI), cada digitalizada seguinte 2 exposição hr para termoneutro (24 ° C ) e condições de frio (17 ° C), a fim de mapear tecido adiposo castanho (BAT) em seres humanos adultos.

Brown Human Tissue adiposo Depots automaticamente segmentada por Positron Emission Tomography / Tomografia Computadorizada e registrado ressonância magnética

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.

Isolando Adipócitos Castanhos do Tecido Adiposo Castanho Interescapular Murino para Análise da Expressão Gênica e Proteica

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Aprenda a diferenciar adipócitos marrons a partir de tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos. Este protocolo reprodutível permite estudar termogênese e mecanismos relacionados à obesidade.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos (Vídeo) | JoVE Journal

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

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