Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Falando em significado, a geração de células NK a partir de uma fonte expansível é fundamental para aplicações como a imunoterapia contra o câncer. A vantagem dessa tecnologia é que células-tronco potenciais expandidas que possuem maior capacidade de diferenciação podem ser usadas em vez de células IP regulares. Para a pré-diferenciação de hEPSCs, remova o meio hEPSC no qual as células foram mantidas e adicione um mililitro de meio DFK.

Incubar por dois a três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para verificar a formação de corpos embrionários, depois de remover o meio DFK gasto, lave as células uma vez com um mililitro de PBS. Adicionar 500 microlitros de tripsina a 0,05% e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três a sete minutos, com base na morfologia.

Uma vez que a tripsina é removida, e dois mililitros de meio DFK para colher as células. Gire as células a 300 G por três minutos à temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante, adicione um mililitro de meio DFK e um microlitro de Y-27632 e ressuspenda as células por agitação.

Conte as células usando um hemocitômetro e dilua a suspensão celular com meio DFK e Y-27632 para obter 4.000 células por 25 microlitros de meio. Coloque 30 a 40 gotas de suspensão celular na tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros e despeje um pouco de PBS no prato inferior para evitar a evaporação das gotículas. Inverta suavemente a tampa para cobrir o prato e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante três dias.

Para coletar os corpos embrionários da gota, usando uma pipeta de um mililitro contendo PBS, bombeie um pouco de PBS para a gota e aspirar o meio, incluindo os corpos embrionários. Em seguida, transfira esses corpos embrionários para um tubo de 15 mililitros e gire-os a 100 G por um minuto à temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante, adicione um mililitro de meio A.Transfira os corpos embrionários coletados para uma placa de 24 poços não aderente e considere-a dia zero.

Para realizar o padrão mesodérmico dos corpos embrionários, incubar a placa por três dias a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No segundo dia, substitua 500 microlitros do meio gasto A pelo meio fresco A do mesmo volume. Para realizar a especificação hematoendotelial do corpo embrionário, retire 700 microlitros do meio A do poço e adicione o mesmo volume do meio B.Cultura por sete dias, trocando o meio-meio a cada dois dias.

Para transferir os corpos embrionários padronizados para uma interface ar/líquido, incline ligeiramente a placa para que os corpos embrionários se agreguem na parte inferior e, usando uma pipeta de um mililitro, remova o máximo possível de B médio. Agora pegue os corpos embrionários com uma pipeta, aspirando o meio restante e transferindo-os para um trans-poço em uma placa de 24 poços, Para realizar a expansão do progenitor linfoide, adicione 500 microlitros de meio NK-1 ao compartimento inferior do trans-poço, cultura por 14 dias e realize uma mudança de meio a cada dois dias. Para revestir a placa, dilua o material de revestimento em PBS, adicione um mililitro de solução de revestimento diluída a cada poço de uma placa de 12 poços e cubra a abertura da placa com filme de embalagem.

Incube a placa a quatro graus Celsius durante a noite. Adicione 200 microlitros de PBS no poço trans e pipete lentamente para cima e para baixo cerca de cinco a seis vezes para colher as células liberadas dos organoides. Transfira a suspensão da célula colhida para um tubo de dois mililitros e gire as células a 500 G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de meio NK-1. Remova toda a solução de revestimento do poço e lave cada poço de uma placa de 12 poços com um mililitro de PBS duas vezes. Em seguida, divida as células colhidas na proporção de 1:2 e transfira a suspensão celular para uma placa revestida de 12 poços.

Adicione um mililitro de meio NK-1 para que cada poço tenha 1,5 mililitros de meio. Para mudar o meio, permita que as células afundem no fundo por um a dois minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente 750 microlitros de meio e girá-lo para baixo, como demonstrado anteriormente.

Após o descarte do sobrenadante, ressuscite o pellet obtido em 750 microlitros de meio NK-1 pipetando de cinco a seis vezes e transfira-o para o poço original. No presente estudo, os produtos derivados de hEPSC no desfecho foram analisados. Aproximadamente 15% das células dissociadas do sistema de cultura 3D de dois lotes induzidos em diferentes pontos de tempo eram CD3-negativas, CD56-positivas, e 16% das células eram CD45-positivas, CD-56-positivas, o que está de acordo com as porcentagens de células CD3-negativas, CD56-positivas observadas em ensaios anteriores.

As porcentagens de células CD3-negativas, CD56-positivas nas células colhidas do sistema de cultura 2D variaram de 30 a 6%Os produtos derivados de hEPSC durante o dia 18 de cultura do sistema 2D mostraram expressão de CD56 ectópico e CD107a em 12% das células após duas horas de estimulação de anticorpos, e aproximadamente 28% das células colhidas foram CD94-positivas, CD159a-positivo. Os produtos de diferenciação in vitro foram testados quanto à citotoxicidade contra células de eritroleucemia humana K562. Quando co-cultivados com alvos tumorais por três horas, os produtos diferenciados exibem citotoxicidade leve em comparação com uma linhagem celular permanente independente de interleucina 2 células NK92mi.

Seguindo este método, células como células T, células B e eritrócitos podem ser geradas.