Name: Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprenda o implante ortotópico de células cancerosas derivadas do paciente em camundongos imunodeficientes para estudar câncer colorretal avançado. Este modelo recapitula metástases hepáticas e pulmonares, permitindo avaliação de novos fármacos terapêuticos em contexto clinicamente relevante.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos à Fundação Cellex , à rede CIBERONC e ao Instituto de Salud Carlos III pelo apoio. Além disso, agradecemos também à plataforma de imagem pré-clínica do Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), onde os experimentos foram realizados.

Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Vall d'Hebron, Barcelona, Espanha (parecer ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Amostras de tecido colônico humano consistiram de biópsias de áreas não necróticas de adenocarcinomas primários ou metástases hepáticas, correspondendo a pacientes com câncer de cólon e reto submetidos à ressecção tumoral. Os experimentos foram conduzidos seguindo a diretriz de cuidados com animais da União Europeia (86/609/CEE) e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do VHIR - Instituto de Pesquisa Vall d'Hebron (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA e 12/18 CEEA).
NOTA: Fêmea NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) camundongos de 8 semanas de idade foram comprados do Charles River Laboratories.
1. Derivação de células do paciente
<ol><li>Extração tumoral NOTA: O procedimento a seguir é realizado em um gabinete biológico à temperatura ambiente (TR) no biotério.<ol><li>Obter amostras tumorais de cirurgias ou biópsias dos pacientes e de PDXs crescendo subcutaneamente em camundongos.</li>
		<li>Para a injeção ortotópica, preparar as células tumorais a partir de modelos estabelecidos de tumor PDX subcutâneo em vez de tecido obtido diretamente dospacientes9.</li>
		<li>Gerar tumores PDX inoculando uma suspensão de 1 x 105 células tumorais em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (50 μL) misturada com matriz de Matrigel (50 μL) por via subcutânea no flanco de camundongos NOD-SCID2.<ol><li>Medir o crescimento do tumor usando um paquímetro a cada dois dias. NOTA: É importante ressaltar que nosso laboratório gerou um biobanco de mais de 350 modelos PDX. Os modelos tumorais de CRC-PDX utilizados no protocolo são modelos PDX estabelecidos em laboratório que foram amplificados mais de três passagens em camundongos, e passaram os critérios de inclusão/exclusão com resultado positivo (Tabela 1).</li>
		</ol></li>
		<li>Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical quando os tumores subcutâneos atingirem o tamanho máximo estabelecido pelo CEEA (1 cm de diâmetro), ou quando os animais atingirem os critérios de desfecho.</li>
		<li>Extrair o tumor e removê-lo cuidadosamente da pele e tecido não tumoral circundante usando tesoura e pinça.</li>
		<li>Armazenar os tumores colhidos em PBS a 4 °C até a próxima etapa. NOTA: Dissociar os tumores em suspensão celular o mais rápido possível após a remoção de sua localização original nas lesões dos pacientes ou xenoenxertos subcutâneos em camundongos. A viabilidade celular é significativamente reduzida 24 h após a remoção do tecido, resultando em uma implantação ineficiente em camundongos receptores.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação celular NOTA: O procedimento a seguir é realizado em um gabinete biológico à temperatura ambiente (TR) na sala de cultura de tecidos.<ol><li>Dissociar os tumores usando uma lâmina em uma placa de cultura de 10 cm com 1 mL de meio CoCSCM 6Ab completo (Tabela 2) (para facilitar a picagem). Colocar a amostra dissociada homogénea num tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Adicionar o meio CoCSCM 6Ab completo a um volume final de 5 mL (não usar mais de 3 mL de amostra dissociada no mesmo tubo). NOTA: O CCR primário ressecado de pacientes está naturalmente contaminado com bactérias e fungos. É essencial remover patógenos presentes na amostra original do paciente usando um coquetel de seis antibióticos (penicilina, estreptomicina, fungizona, canamicina, gentamicina e nistatina). A injeção de células tumorais contaminadas com bactérias em camundongos imunodeficientes pode resultar em morte animal.</li>
		<li>Incubar com 50 μL de DNase I (0,08 kU/mL) e 50 μL de colagenase (1,5 mg/mL) (meio de digestão; Tabela 2) durante 1 h a 37 °C numa incubadora de cultura celular, a uma posição de 45°. Misturar bem a solução a cada 15 minutos com uma pipeta de 5 mL antes da incubação. NOTA: Dissociar o tecido tumoral e digeri-lo por pipetagem várias vezes para obter uma solução de célula única. Isso é essencial para contar as células antes de injetar em camundongos receptores e, portanto, conseguir uma implantação homogênea de células tumorais.</li>
		<li>Adicione 5 mL do meio completo de CoCSCM 6Ab e misture bem com uma pipeta de 5 mL.</li>
		<li>Classificar a solução com um filtro celular de 100 μm usando um novo tubo estéril de 50 mL.</li>
		<li>Gire as células classificadas a 500 x g por 8 min no TR.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o pellet em 3 mL de solução tampão de lise 1x hemácias.</li>
		<li>Incubar por 10 min no TR.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de meio CoCSCM 6Ab completo, pipetar a amostra e girar a 500 x g por 10 min no TR.</li>
		<li>Ressuspender o pellet com 5-10 mL de meio CoCSCM 6Ab completo e usar um contador de células para calcular o número total de células.</li>
		<li>Girar as células a 500 x g por 10 min em TR e ressuspender em 10 mL de PBS.</li>
		<li>Ressuspender o pellet para obter uma concentração de 20 x 106 células/mL, e misturar bem para obter uma suspensão celular homogênea.</li>
		<li>Preparar seringas de 29 G (agulha 0,5 mL U 100, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) para injeção de ceco na cultura de tecidos (uma seringa/camundongo). Coloque 50 μL da suspensão de células tumorais (1 x 106 células/injeção) na seringa e mantenha-a congelada. Certifique-se de que as bolhas de ar são removidas da suspensão celular. NOTA: A eliminação de bolhas de ar quando as células tumorais são carregadas na seringa é essencial para evitar a injeção de um volume excessivo na parede do ceco, o que poderia resultar em ruptura tecidual e perda de amostra. É imperativo misturar bem a suspensão celular ao carregar a seringa para evitar o tamanho irregular do tumor entre camundongos no mesmo experimento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Injeção ortotópica no ceco
NOTA: O procedimento a seguir é realizado em uma bancada em uma sala específica livre de patógenos (SPF) no biotério. Os equipamentos utilizados são previamente limpos e esterilizados. Além disso, é esterilizado novamente em um esterilizador portátil entre indivíduos ou zonas no biotério.
<ol><li>Limpe o local cirúrgico pulverizando com detergente desinfetante e limpando.</li>
	<li>Depilar o abdômen de camundongos usando uma máquina de depilação de camundongos.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito dorsal. Utilizar isoflurano a 2% para anestesiar o animal. Confirme o efeito da anestesia beliscando suavemente a extremidade e observando a ausência de estimulação.</li>
	<li>Coloque uma gota de 50-100 μL de pomada veterinária (3 mg/g Lacryvisc) nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.</li>
	<li>Desinfete o abdome de camundongos esfregando com clorexidina ou iodopovidona várias vezes em movimento circular.</li>
	<li>Faça uma incisão longitudinal de 1 cm sobre o abdome inferior usando tesoura cirúrgica. Separe cuidadosamente a pele para cada local para apresentar o peritônio que está sob a pele.</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5-1 cm na membrana do peritônio, grande o suficiente para exteriorizar o ceco. OBS: Exteriorizar o ceco sem manipular excessivamente os órgãos internos, o que poderia aumentar drasticamente a letalidade do procedimento.</li>
	<li>Isole cuidadosamente o ceco do rato utilizando uma gaze pré-cortada e estéril.</li>
	<li>Umedeça o ceco com soro fisiológico durante todo o procedimento.</li>
	<li>Imobilizar o ceco segurando-o cuidadosamente com pinça e introduzir a agulha superficialmente na parede do ceco. Evite capilares e vasos no local da injeção. Remova as bolhas da suspensão celular.</li>
	<li>Injetar os 50μL inteiros da suspensão de células tumorais lentamente. Geralmente leva cerca de 10 s para administrar. Evite perfurar o lúmen do ceco com a agulha, pois isso resulta na eliminação da suspensão de células tumorais do corpo através do peristaltismo intestinal. NOTA: Injetar a suspensão de células tumorais no ceco dos camundongos é a etapa mais desafiadora de todo o procedimento. Uma luz brilhante focada no local da injeção e uma lupa de aumento devem ser usadas nesta parte do protocolo. Introduzir a agulha paralelamente à superfície do ceco. O ceco é um tecido muito frágil; Portanto, a imobilização do ceco deve ser realizada com pinça cirúrgica e aplicação de pressão suave para evitar ruptura tecidual resultando em hemorragia. O sucesso da implantação resulta em uma bolha branca (pastilha de células) na parede do ceco. Se a bolha não puder ser visualizada, pode indicar que o ceco foi perfurado e as células terminaram no lúmen do ceco, resultando em sua depuração pelo trato intestinal.</li>
	<li>Após a injeção, remova lentamente a agulha do ceco e aplique uma pressão suave no local da injeção com um aplicador com ponta de algodão, para evitar que as células tumorais escapem e reduzir o sangramento leve.</li>
	<li>Limpe o ceco com solução salina para remover quaisquer detritos.</li>
	<li>Devolva o ceco de volta para o abdômen do animal.</li>
	<li>Fechar o peritônio com pontos 5/0.</li>
	<li>Feche a pele do abdome com pontos 5/0.</li>
	<li>Administrar antibióticos no pós-operatório (100 mg/kg de amoxicilina ou 20 mg/kg de enrofloxacina) e analgésicos (5 mg/mL de metacam/meloxicam) por injeção subcutânea. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento e mantenha-os lá até que tenham se recuperado totalmente. Em seguida, devolva-os à gaiola com outros animais.</li>
</ol>3. Avaliação do crescimento do tumor ortotópico pela μCT
NOTA: O procedimento a seguir é realizado na plataforma de imagem pré-clínica (PIP) da instalação animal.
<ol><li>Realizar todos os procedimentos com animais seguindo as normas do comitê de ética institucional.</li>
	<li>Iniciar o monitoramento do volume tumoral por μCT 2 semanas após a injeção das células e, posteriormente, a cada semana.</li>
	<li>Diluir recentemente o contraste iopamiro (300 mg/mL) em solução salina, na proporção de 3:1 para ambas as doses. Administrar 300 mL de iopamiro por gavagem oral. NOTA: Devido ao baixo contraste de partes moles da μCT, um agente de contraste é recomendado para melhorar a sensibilidade da técnica. O protocolo inclui a administração oral de um agente à base de iodo (iopamiro) para delimitar a carga tumoral intraluminal e a administração intraperitoneal secundária do mesmo agente para definir a carga tumoral na face visceral do intestino. Experimentos piloto foram realizados anteriormente para determinar o tempo exato que o agente de contraste precisa para chegar ao ceco de camundongos antes de sua eliminação. No caso do iopamiro, é em torno de 2 h.</li>
	<li>Após 2 h, administrar uma injeção intraperitoneal de 300 mL de iopamiro previamente diluído. A administração ajuda a definir os limites do tumor na face parietal.</li>
	<li>Anestesiar os animais com isoflurano a 2%.</li>
	<li>Após confirmar que o animal está corretamente anestesiado apertando o pé do camundongo, coloque-o no leito de varredura do μCT. A melhor posição é supina (de bruços).</li>
	<li>No software de controle, inicie o modo ao vivo (modo fluoroscopia) para colocar a área abdominal no campo de visão (FOV) do scanner. Para isso, mova o leito para frente e para trás e lateralmente até atingir a posição desejada. Gire o tubo de raios X e o detector a 90° e mova o leito de varredura no eixo y para centralizar completamente o animal.</li>
	<li>Use os seguintes parâmetros para as imagens de μCT: FOV de 30 mm, 26 s de tempo de aquisição, 90 kV de tensão de corrente e 200 μA de amperagem de corrente, usando um sistema de imagem FX μCT.</li>
	<li>Devolva os animais às suas gaiolas para recuperação quando a varredura terminar. Fornecer suporte térmico e monitorar os animais até que eles se recuperem da anestesia antes de retornar ao alojamento.</li>
	<li>A aquisição do μCT produz um arquivo de 250 Mb para cada exame. Os arquivos de dados criados têm um formato VOX. A fim de torná-los acessíveis para qualquer software de análise de imagem, converta os arquivos para o formato DICOM usando o software de gerenciamento de banco de dados do μCT. Armazene o lote de arquivos criados em um disco rígido portátil para analisá-los usando qualquer computador com software de imagem disponível. NOTA: Durante a análise de imagem, o ceco está localizado como um intestino dilatado com um conteúdo radiodenso (iopamiro), frequentemente no lado esquerdo do abdome caudal. Na flexura visceral do ceco, observa-se espessamento parietal em relação às regiões intestinais adjacentes. O espessamento corresponde ao crescimento tumoral.</li>
	<li>Uma vez localizado o tumor, encontrar o maior diâmetro nas diferentes incidências (axial, coronal e sagital). Medir esses três eixos e calcular o volume tumoral seguindo a fórmula elipsoide: volume = 4/3π x (semieixo x semieixo x semieixo y x semieixo z)10.</li>
</ol>4. Intervenção terapêutica em camundongos portadores de tumores ortotópicos
<ol><li>Monitorar os camundongos portadores de tumores ortotópicos semanalmente.</li>
	<li>Quando um sinal de μCT tumoral é detectado na maioria dos camundongos, realize outra μCT na semana seguinte para confirmar a presença do tumor. NOTA: O tempo para iniciar o tratamento depende do modelo PDX utilizado, e varia de 3 a 12 semanas após a inoculação de células tumorais no ceco.</li>
	<li>Randomizar os camundongos em quatro grupos: um grupo veículo (n = 10-15 camundongos), um grupo de drogas de teste (n = 10-15 camundongos), um grupo de quimioterapia padrão de tratamento (n = 10-15 camundongos) e um grupo de tratamento combinado (n = 10-15 camundongos).</li>
	<li>Tratar os ratinhos por via intraperitoneal com solução salina (grupo veículo), o fármaco de teste (20 mg/kg) (grupo de droga de teste), irinotecano (50 mg/kg) (grupo de tratamento padrão) ou o medicamento de teste (20 mg/kg) com irinotecano (50 mg/kg) (grupo de tratamento combinado). Realizar a administração uma vez por semana até o final do experimento.</li>
	<li>Monitorar o crescimento do tumor semanalmente por μCT durante todo o curso do experimento.</li>
	<li>Ao final do experimento, eutanasiar os camundongos por deslocamento cervical e coletar fígados, pulmões e quaisquer outras possíveis lesões em outros órgãos.</li>
	<li>Incluir as amostras de tecido em e incubá-las em formalina a 4% durante a noite. Use o tecido do intestino de um camundongo sem um tumor no ceco como controle.</li>
	<li>Retire os da formalina e incube com etanol 70% por pelo menos 3 h.</li>
	<li>Embutir as com parafina, utilizando-se protocolos padrão de instalações histopatológicas.</li>
	<li>Realizar coloração de hematoxilina e eosina (H&E) do ceco, fígado e pulmão, utilizando protocolos padrão de instalações de histopatologia.</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer%3A+Metastases+to+a+single+organ%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer: Metastases to a single organ.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+micro-CT+colonography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small animal micro-CT colonography.</a> Methods. 50 (1), 36-41 (2010).</li>
<li>Boll, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-contrast+micro-CT+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Colorectal+Disease%22%5BJournal%5D)">Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice.</a> International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+volume+in+subcutaneous+mouse+xenografts+measured+by+microCT+is+more+accurate+and+reproducible+than+determined+by+18F-FDG-microPET+or+external+caliper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper.</a> BMC Medical Imaging. 8, 16(2008).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+colorectal+cancer+orthotopic+patient-derived+xenograft+models+for+cancer+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research.</a> Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).</li>
</ol>

Nas últimas décadas, muitas novas terapias antineoplásicas têm sido desenvolvidas e testadas em pacientes com diferentes tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal (CCR). Embora resultados promissores em modelos pré-clínicos tenham sido observados em muitos casos, a eficácia terapêutica em pacientes com CCR metastático avançado tem sido frequentemente limitada. Portanto, há uma necessidade urgente de modelos pré-clínicos que permitam testar a eficácia de novas drogas terapêuticas em um cenário metastático clinicamen...

O câncer colorretal (CCR) é a segunda causa de morte por câncer nomundo1. A capacidade de gerar modelos tumorais in vitro ou in vivo derivados de células tumorais individuais de pacientes tem avançado a medicina de precisão em oncologia. Na última década, organoides derivados de pacientes (DOPs) ou xenoenxertos (PDXs) têm sido utilizados por muitos grupos de pesquisa em todo omundo2. As DOPs são estruturas multicelulares in vitro que se assemelham às características do tecido tumoral original e podem se auto-organizar e se auto-renovar3. Esses promissores modelos in vitro podem ser usados com sucesso para triagem de fármacos e facilitar a pesquisa translacional. Por outro lado, os modelos PDX recapitulam fielmente o CCR original em todos os níveis relevantes, desde a histologia até as características moleculares e a resposta a drogas 2,4.
In vivo Os modelos PDX são principalmente cultivados como tumores subcutâneos em camundongos imunodeficientes. Usando essa abordagem, PDXs tornaram-se o padrão-ouro na pesquisa do câncer, particularmente para estudar a sensibilidade ou resistência a drogas. No entanto, as mortes relacionadas ao CCR estão principalmente associadas à presença de lesões metastáticas no fígado, no pulmão ou na cavidade peritoneal, e nenhuma das duas abordagens (DOP ou PDX) pode recapitular o quadro clínico avançado. Além disso, demonstrou-se que o sítio específico de crescimento tumoral determina características biológicas importantes que têm impacto na eficácia da droga e no prognóstico dadoença2. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos pré-clínicos que possam ser usados para avaliar a eficácia de drogas antineoplásicas em um cenário metastático clinicamente relevante6.
Os tomógrafos microcomputadorizados (μCT) podem funcionar como tomógrafos clínicos reduzidos, fornecendo imagens de tumor primário e metástase em camundongos com uma resolução de imagem em escala proporcional à das imagens de TC de pacientes comcâncer7. Para neutralizar o baixo contraste de partes moles da técnica de μCT, agentes de contraste iodados radiológicos podem ser usados para melhorar o contraste e avaliar a carga tumoral. Usando uma abordagem de duplo contraste, iodo oral e intraperitoneal é administrado em diferentes momentos. O contraste administrado por via oral ajuda a definir os limites entre o tecido tumoral e o conteúdo ceco no interior do intestino.  Por outro lado, o contraste administrado por via intraperitoneal permite a identificação dos limites externos da massa tumoral, que frequentemente cresce e invade operitônio8.
O manuscrito descreve um protocolo para realizar implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes e a metodologia para monitorar o crescimento de tumores intestinais usando a tomografia computadorizada. O presente artigo mostra que o modelo recapitula o cenário clínico de tumores intestinais avançados e doença metastática em pacientes com CCR que não podem ser estudados usando modelos DOP ou PDXO. Uma vez que os modelos PDX ortotópicos de CCR recapitulam o cenário clínico de pacientes com CCR, concluímos que eles são os melhores até o momento para testar a eficácia de drogas antitumorais em tumores intestinais avançados e doença metastática.

<table><tbody><tr><td>REAGENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Life Technologies SA (Espanha)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Solução aquosa de clorexidina 2%</td> <td>DH MATERIAL M & Eacute; DICO, S.L.</td><td></td><td></td>1111696250</tr><tr><td>colagenase</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM /F12&nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp; &nbsp;</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>D4263-5VL</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>AF-100-15-500 e micro; g</td><td></td></tr><tr><td>FGF básico</td><td>PEPRO TECH EC LTD.</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life Technologies S.A (Espanha)</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>15750037</tr><tr><td>Sal de Heparina Sódica</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>H4784-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iopamiro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Canamicina</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>15160047</tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>25030032</tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>CULTEK, S.L.U.</td><td>356235/356234/354234</td><td></td></tr><tr><td>Metacam, 5 mg/mL</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>Nistatina</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>N4014-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies S.A. (Espanha)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), estéril</td><td>Labclinics S.A</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P0130-25G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>RBC Tampão de Lise&nbsp;</td><td>Labclinics S.A</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>LIFE TECHNOLOGIES S.A.</td><td></td><td></td>11360039</tr><tr><td>Selenito de Sódio</td><td>MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.</td><td>S5261-25G</td><td></td></tr><tr><td><forte>SUPRIMENTOS ESSENCIAIS</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aceno de 8 semanas de idade. Camundongos CB17-Prkdcscid/NcrCrl</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml U 100 agulha 0,33 mm (29G) x 12,7 mm&nbsp;</td><td>BECTON DICKINSON, S.A.U.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>320926 Lâmina #24</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Célula 100 &micro; m</td><td>Cultek, SLU</td><td>45352360</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps e tesouras cirúrgicas</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Lacrivisco, 3 mg/g, gel oftálmico</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Surfasafe</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Sutura PROLENE 5-0&nbsp;</td><td>JOHNSON& JOHNSON S, A.</td><td>8720H</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT/SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantum FX &micro; Sistema de imagem para tomografia computadorizada</td><td>Perkin Elmer</td><td>Perkin Elmer</td><td>http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083</td></tr></tbody></table>

implante ortotópico de células cancerosas derivadas do paciente em camundongos recapitula o câncer colorretal avançado

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Na última década, modelos mais sofisticados de câncer colorretal (CCR) pré-clínicos foram estabelecidos usando células cancerosas derivadas do paciente e tumoroides 3D. Uma vez que organoides tumorais derivados do paciente podem manter as características do tumor original, esses modelos pré-clínicos confiáveis permitem o rastreamento de drogas para câncer e o estudo de mecanismos de resistência a drogas. No entanto, a morte relacionada ao CCR em pacientes está associada principalmente à presença de doença metastática. Portanto, é essencial avaliar a eficácia de terapias anticâncer em modelos in vivo relevantes que realmente recapitulem as principais características moleculares da metástase de câncer humano. Estabelecemos um modelo ortotópico baseado na injeção de células cancerosas derivadas do paciente com CCR diretamente na parede do ceco de camundongos. Essas células tumorais desenvolvem tumores primários no ceco que metastatizam para o fígado e pulmões, o que é frequentemente observado em pacientes com CCR avançado. Este modelo de CRC em camundongos pode ser usado para avaliar as respostas a drogas monitoradas por tomografia microcomputadorizada (μCT), um método de imagem em pequena escala clinicamente relevante que pode facilmente identificar tumores primários ou metástases em pacientes. Aqui, descrevemos o procedimento cirúrgico e a metodologia necessária para implantar células cancerosas derivadas do paciente na parede do ceco de camundongos imunodeficientes.

Camundongos implantados ortotopicamente com células cancerosas derivadas do paciente foram monitorados semanalmente por μCT. Ao final do experimento, os animais foram eutanasiados. Intestinos, cecos (Figura 1A,B), fígados, pulmões e qualquer outra possível lesão foram coletados, incluídos em um e fixados com formalina a 4% durante a noite. Tecido intestinal de camundongo sem tumor no ceco foi utilizado como controle (Figura 1C). Finalmente, as f...

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas de pacientes na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. O modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal e permite a avaliação de novas drogas terapêuticas em um cenário clinicamente relevante de metástases pulmonares e hepáticas.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas do paciente na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. Esse modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal. O modelo de câncer colorretal ortotópico aqui apresentado recapitula o cenário clínico de tumores intestinais avançados e doença metastática em pacientes com câncer colorretal que não podem ser estudados usando organoides derivados do paciente ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente.De um camundongo eutanasiado, extraia o tumor removendo-o cuidadosamente da pele e do tecido não tumoral circundante usando tesoura e pinça. Coloque os tumores colhidos em PBS a quatro graus Celsius. Usando uma lâmina, dissociar os tumores em uma placa de cultura de 10 centímetros contendo um milímetro de meio.Coloque a amostra dissociada homogênea em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione o meio a um volume final de cinco mililitros. Em seguida, adicione o meio de digestão ao tubo.Coloque o tubo em uma posição de 45 graus dentro de uma incubadora de cultura celular por uma hora a 37 graus Celsius. Durante a incubação de uma hora, misture a solução a cada 15 minutos co

orthotopic-implantation-patient-derived-cancer-cells-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

Modelo rato ortotópico de câncer colorretal

O vídeo demonstra a técnica de inoculação ortotópica do câncer de mama em um modelo de camundongo. Esta técnica produz uma alta taxa de tumorigênese com menos variabilidade no tamanho e forma do tumor em comparação com a injeção subcutânea ou não cirúrgica.

Injeção ortotópica: implante de células cancerígenas específicas do tecido em um camundongo adulto

Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

Modelos de camundongos com metástase espontânea: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de câncer colorretal injetadas ortotopicamente

O vídeo descreve a técnica de injeção intracecal de células cancerígenas para desenvolver um modelo de camundongo ortotópico com tumores altamente uniformes. Portanto, o modelo ortotópico de camundongo permite a simulação realista de metástases, fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar as mudanças fenotípicas durante o crescimento e disseminação do tumor.

Injeção de células tumorais intracecais: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer colorretal

A capacidade dos clones metastáticos de colonizar locais distantes depende de sua capacidade de proliferação e/ou de sua capacidade de sobreviver no microambiente hospedeiro sem proliferação significativa. Aqui, apresentamos um modelo animal que permite a visualização quantitativa de ambos os tipos de colonização hepática por clones metastáticos.

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

É apresentado um protocolo para o estabelecimento de um modelo de ratinho geneticamente modificado de câncer colorretal por infecção segmentar adeno-cre e sua vigilância através de colonoscopia de alta resolução.

Um modelo de mouse de engenharia genética de câncer colorretal esporádico

Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

A injeção de veia portal de organoides de câncer colorretal (CRC) gera metástase hepática rica em estroma. Este modelo de camundongos de metástase hepática crc representa uma ferramenta útil para estudar interações tumorais-estroma e desenvolver novas terapêuticas dirigidas a estroma, como terapias genéticas mediadas por vírus associados ao adeno.

Portal Injeção de Veia de Organoides de Câncer Colorretal para Estudar o Estroma metástase hepática

Aprenda o implante ortotópico de células cancerosas derivadas do paciente em camundongos imunodeficientes para estudar câncer colorretal avançado. Este modelo recapitula metástases hepáticas e pulmonares, permitindo avaliação de novos fármacos terapêuticos em contexto clinicamente relevante.

Implante Ortotópico de Células Cancerosas Derivadas do Paciente em Camundongos Recapitula o Câncer Colorretal Avançado

Explorar mais vídeos