Name: Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a preparar emulsões padronizadas para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) usando homogeneização com esferas de aço. Este método reduz a variabilidade entre experimentos e pode ser aplicado em modelos de doenças autoimunes e vacinas contra câncer.

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O autor gostaria de agradecer às unidades de alojamento de animais da Universidade de Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, por seu apoio, e Richard Williams, do Instituto Kennedy de Reumatologia, Universidade de Oxford, Reino Unido, pela crítica construtiva e apoio linguístico na produção deste manuscrito.

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as práticas do Conselho Sueco de Pesquisa Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Lund-Malmö, Suécia (número de permissão: M126-16).
Observação : um fluxo esquemático do método é descrito na Figura 1.
1. Preparação do material
NOTA: Preparar todos os reagentes assepticamente num exaustor estéril, alíquota e conservar à temperatura indicada. Os reagentes podem ser armazenados até 2 anos sem perder o seu efeito.
<ol><li>Prepare CFA contendo 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis conforme descrito abaixo.<ol><li>Adicionar 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizado (ver Tabela de Materiais) e cinco esferas de aço de 3,2 mm a um tubo de 7 ml (ver Tabela de Materiais). Agite o tubo em um homogeneizador (consulte Tabela de materiais) por 60 s na configuração de velocidade mais alta (5.000 rpm).</li>
		<li>Adicione 5 mL de adjuvante de Freund (IFA) incompleto ao tubo e agite novamente por 60 s na velocidade mais alta. Transfira a pasta de M. tuberculosis homogeneizada em IFA (agora denominada CFA) para um tubo fresco com uma pipeta, deixando as contas para trás, e armazene a 4 °C até o uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar água ultrapura ao pó liofilizado do péptido MOG35-55 (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de péptido de 10 mg/ml. Esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 60 μL e conservar a -20 °C até à utilização. NOTA: O peptídeo MOG35-55 utilizado para este experimento é de pureza ImmunoGrade (~70%), é clivado em TFA, dissolve-se facilmente em água e contém uma amida C-terminal (-NH2) para aumentar a estabilidade in vivo 14. As alíquotas peptídicas nunca foram descongeladas e recongeladas mais de duas vezes, sendo armazenadas a -20 °C até o uso.</li>
	<li>Preparar 100 mL de tampão toxina pertussis: Dissolva 2,9 g de NaCl em 80 mL de PBS livre de 1x Ca 2+/Mg2+ e adicione 100 μL de Triton X-100 a 10%. Ajustar o volume para 100 ml com PBS e esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 10 ml e conservar a 4 °C até à utilização.</li>
</ol>2. Preparação de emulsões CFA/peptídicas
<ol><li>Calcule a quantidade de emulsão necessária para a imunização. Neste protocolo padrão, cada camundongo recebe 50 μg de peptídeo MOG35-55 e 300 μg de M. tuberculosis dispersos no adjuvante de Freund (CFA). A quantidade de cada reagente (peptídeo MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) necessária para a preparação das emulsões pode ser calculada usando o Arquivo Suplementar 1. Um adicional de 20% de todos os reagentes, para compensar a pequena perda de emulsão, é incluído no cálculo. NOTA: O kit de emulsão comercial (ver Tabela de Materiais) utilizado neste estudo compreende um tubo, uma tampa de rosca e um êmbolo numa bolsa esterilizada. Cada tubo do kit de emulsão contém um máximo de 9,6 mL, tornando possível preparar seringas de 8 x 1 mL suficientes para imunizar 40 camundongos (ou 80 camundongos se usarem 100 μL de emulsão por animal).</li>
	<li>Coloque o tubo tampado por parafuso (do kit de emulsão comercial) e os reagentes a serem usados no gelo.</li>
	<li>Adicione os componentes da emulsão na seguinte ordem nos volumes calculados na etapa 2.1: PBS, depois o peptídeo, depois M. tuberculosis em CFA e, finalmente, IFA.</li>
	<li>Feche o tubo com a tampa firme, apertando-o e soltando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente por 5-10 s à mão para pré-misturar os reagentes.</li>
	<li>Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 s. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por 3 min. Repita a execução mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 300 x g durante 1 min para remover o ar preso e compactar a emulsão.</li>
	<li>Remova a tampa do tubo, insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão. Remova o fecho de encaixe na parte inferior do tubo torcendo-o.</li>
	<li>Remova o êmbolo de uma seringa de injeção (1 ml; ver Tabela de Materiais). Adicione uma agulha (de preferência 25-27 G) à seringa de injeção.</li>
	<li>Ligue a extremidade traseira da seringa de injeção à fechadura dedicada na parte inferior do tubo e bloqueie-a com uma torção curta.</li>
	<li>Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injeção, empurrando o êmbolo suavemente. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 ml da seringa de injeção.</li>
	<li>Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo com cuidado, tomando cuidado para que nenhum ar entre na seringa. Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha. NOTA: Neste ponto, parte da emulsão pode ser usada para controle de qualidade (consulte a etapa 3).</li>
	<li>Repita os passos 2.8-2.11 para o resto da emulsão presente no tubo. NOTA: Para minimizar o desperdício de emulsões caras de CFA/antígeno, seringas de 1 mL devem ser usadas. Podem ser utilizadas outras seringas que se ajustem à fechadura dedicada no fundo do tubo; no entanto, um volume maior de emulsão pode precisar ser preparado. A emulsão peptídica CFA/MOG35-55 pode ser armazenada a 4 °C por até 15 semanas sem perder sua capacidade indutora de EAE.</li>
</ol>3. Controle de qualidade da emulsão
<ol><li>Drop-test: Adicione uma pequena gota da emulsão em um tubo cônico estéril de 50 mL preenchido com 20 mL de água fria. Feche o tubo e agite-o com a mão por alguns segundos. O aparecimento de minúsculas gotículas distintas confirma a formação de uma emulsão de água em óleo.</li>
	<li>Examine a emulsão usando microscopia de contraste de fase.<ol><li>Para analisar o tamanho das partículas de água em óleo, adicione uma pequena gota (2-3 μL) da emulsão a uma lâmina de microscópio, espalhe-a com um deslizamento de tampa e, em seguida, empurre com força em um movimento circular para achatar a emulsão.</li>
		<li>Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase (consulte Tabela de materiais) com ampliação de 400x e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão. Certifique-se de que pequenas partículas cinza/brancas uniformes estejam visíveis (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Analise o tamanho da partícula da emulsão usando difração a laser. NOTA: A difração a laser mede as distribuições de tamanho de partícula usando um feixe de laser. Este é o melhor teste de controle de qualidade para emulsões. Um resultado representativo das distribuições de tamanho de partícula usando o método descrito aqui é mostrado na Figura 2B (para uma descrição detalhada, ver Topping et al.6). No entanto, o teste de gota e o exame microscópio são suficientes para validar se uma emulsão satisfatória foi formada.<ol><li>Defina os índices de refração para os lasers vermelho e azul para o dispersante (ver Tabela de Materiais) para 1,456 e para a amostra para 1,33 no analisador de tamanho de partícula (ver Tabela de Materiais). Defina a absorvância do índice de refração para 0,02.</li>
		<li>Adicionar uma gota da seringa que contém a emulsão peptídica à unidade de dispersão que contém óleo mineral leve. Inicie a aquisição de dados instantaneamente após a dispersão da emulsão. NOTA: Um modelo de uso geral foi aplicado, e partículas esféricas foram assumidas, para a estimativa da distribuição do tamanho das partículas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Indução de EAE usando a emulsão peptídica MOG 35-55 em camundongos C57BL6/J
NOTA: Em todos os experimentos, cinco camundongos C57BL6/J fêmeas de 8-12 semanas de idade foram utilizados.
<ol><li>Antes da imunização, anestesiar os ratos usando isoflurano vaporizado a 2,5% e confirmar usando uma pitada firme do dedo do pé.</li>
	<li>Injetar cada rato por via subcutânea utilizando seringas de 1 ml em dois locais diferentes, nos lados direito e esquerdo do flanco posterior com 200 μL de emulsão contendo 50 μg de péptido MOG35-55 numa proporção de 1:1 (v/v) de péptido/CFA.</li>
	<li>Pelo menos 1,5 h após a imunização com a emulsão, e depois novamente após 24 h, administrar um total de 80 ng de toxina Bordetella pertussis em 200 μL de tampão de toxina pertussis a cada rato, através de injeções intraperitoneais (100 μL à esquerda e 100 μL no local direito da barriga). NOTA: A localização precisa da injeção intraperitoneal com toxina pertussis tem se mostrado essencial para a ativação de células T no linfonodo drenante15.</li>
	<li>Opcional: Injete o peptídeo MOG35-55 novamente no dia 7 (como usado em alguns protocolos16) repetindo a etapa 4.2. NOTA: Mais importante ainda, certifique-se de que as seringas e agulhas usadas para imunização contendo MOG / CFA ou toxina pertussis sejam adequadamente descartadas em sacos/recipientes de risco biológico.</li>
	<li>Avaliar o escore clínico diariamente, utilizando uma escala de 0 a 6 conforme descrito anteriormente6.</li>
</ol>

<ol><li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide%3A+Insights+from+the+Atlas+of+MS%2C+third+edition%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li>
<li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis%3A+identity%2C+mechanisms+and+potential+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).</li>
<li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+No+One%2C+and+One+Hundred+Thousand%3A+T+Regulatory+Cells%27+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).</li>
<li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li>
<li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li>
<li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).</li>
<li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen%2Fadjuvant+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li>
<li>Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li>
<li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li>
<li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+neuritis%3A+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li>
<li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+%28H-2%29+type%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).</li>
<li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li>
<li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1%2827-35%29+peptide%3A+implications+for+peptide+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li>
<li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li>
<li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL%2F6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li>
<li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778(2012).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603(2022).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612(2022).</li>
<li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li>
</ol>

A BTB Emulsions AB apresentou um pedido de patente para a utilização de um dispositivo e método de preparação de emulsões para imunização e animais e seres humanos (número de pedido de patente europeia: EP3836884A1). BTB é o CEO e fundador da empresa, e um acionista da BTB Emulsions. A Bertin-Instruments está distribuindo os kits de emulsão usados nesta publicação em todo o mundo.

Emulsões de água em óleo, como o antígeno/adjuvante de Freund, têm sido usadas por mais de meio século para induzir EAE17. Atualmente, não existe um método padronizado para preparar emulsões de antígenos que seja independente da influência humana. A mistura manual usando seringas é padrão para a maioria dos laboratórios, no entanto, este método é demorado, muitas vezes resulta em uma perda excessiva de material, e a qualidade difere dependendo do cientista que o prepara.
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Uma quebra da tolerância imunológica pode resultar na geração de distúrbios autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). Estima-se que 2,8 milhões de pessoas vivam com EM em todo o mundo1. Embora a causa exata da SM ainda seja amplamente desconhecida, a desregulação das células T e B auto-reativas, bem como defeitos na função Treg, desempenham papéis importantes na patogênese da doença 2,3.
Modelos animais de doenças autoimunes são ferramentas essenciais para investigar possíveis modalidades terapêuticas. O modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) tem sido usado por quase um século por pesquisadores interessados na EM4. Nos primeiros experimentos, a incidência da doença era relativamente baixa. A introdução do adjuvante de Freund completo (CFA), contendo Mycobacterium e toxina pertussis, possibilitou a indução consistente de EAE em camundongos4. Mais importante ainda, é necessário misturar CFA com um antígeno específico do sistema nervoso central (SNC) para gerar uma emulsão homogênea de água em óleo para induzir EAE. Os modelos de EAE mais comuns atualmente disponíveis são baseados na imunização ativa de camundongos com peptídeos encefalitogênicos. O fundo genético dos camundongos desempenha um papel importante na suscetibilidade à doença, com peptídeos glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e proteína proteolipídica de mielina (PLP139-151) usados para induzir EAE em camundongos C57BL/6J e SJL, respectivamente5. No entanto, outras cepas de camundongos e peptídeos derivados do SNC também podem ser usados.
A qualidade da emulsão CFA/peptídeo é um fator crítico que determina a penetrância da doença no modelo 6 de imunização ativaEAE. Uma emulsão homogênea de água em óleo deve ser preparada misturando os peptídeos encefalitogênicos dissolvidos em tampão aquoso com CFA, caso contrário, os animais não desenvolverão a doença. Numerosos protocolos foram publicados sobre a preparação de emulsões CFA/peptídicas. Exemplos incluem o uso de um vórtice7, sonicação8, seringas e um conector T de três vias9, ou uma seringa apenas5. No entanto, todos esses métodos são difíceis de padronizar e são frequentemente associados a protocolos longos e complicados.
Em comparação com todos os métodos acima, o método simples descrito aqui para a preparação da emulsão oferece as vantagens de não ter diferenças de pessoa para pessoa e ser relativamente rápido. A emulsão é gerada por um homogeneizador agitando os reagentes com uma velocidade, tempo e temperatura definidos, garantindo resultados rápidos e consistentes. Além de induzir a doença no modelo EAE, esse método também pode ser utilizado para estudar outros modelos de doenças autoimunes, como a artrite induzida por colágeno (CIA) e a artrite induzida por antígeno (AIA)6. Portanto, espera-se que esse método possa ser utilizado para induzir consistentemente a doença em outros modelos animais que dependem de emulsões de água em óleo com autoantígenos, como neurite autoimune experimental (EAN)10, tireoidite autoimune experimental (EAT)11, uveíte autoimune (EAU)12 e miastenia gravis (MG)13. Esse método também induz respostas imunes gerais, como hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) de forma consistente6 e, portanto, poderia ser usado para administrar vacinas contra câncer e malária (ver discussão).
Assim, um método rápido (tempo total de preparação ~ 30 min), simples (todos os reagentes podem ser preparados com antecedência e armazenados) e padronizado (a emulsão é realizada usando um homogeneizador de agitação) foi desenvolvido e é apresentado aqui. As emulsões CFA/antígeno preparadas usando este protocolo induzem consistentemente a doença em modelos animais autoimunes.

<table><tbody><tr><td>Seringa de injeção de 1 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de injeção de 1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683531</td><td></td></tr><tr><td>tubos vazios de 7 ml com tampas</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000944LYSK0A.0</td><td>Tubo de 7 mL</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 50 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>tubo de 50 mL</td></tr><tr><td>Bordetella pertussis toxina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2980</td><td>Armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dispersante, óleo mineral leve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Armazene na RT</td></tr><tr><td>Kit de emulsão</td><td>Bertin-Instruments</td><td>D34200.10 ea</td><td>Contendo um tubo, tampa e êmbolo</td></tr><tr><td>Adjuvante de Freund incompleto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; F5506</td><td>Loja em +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF3114-33-8</td><td>Armazene a +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mastersizer 2000&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td>Analisador de tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Minilys-Personal homogeneizador</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td>Homogeneizador de agitação</td></tr><tr><td>MOG 35-55 Peptídeo&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Innovagen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Montanide ISA 51 VG</td><td>Seppic</td><td>36362Z</td> Adjuvante <td>de óleo aprovado pela FDA</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc Filtros de Seringa 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>17124381</td><td>Sterlie filtro</td></tr><tr><td>PBS, Ca2+/Mg2+ livre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Phase-Constrast Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX40-B</td><td></td></tr><tr><td>Steel Beads 3.2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>NC0445832 Autoclave e loja na RT</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648463</td><td>Store na RT</td></tr></tbody></table>

um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) compartilha características imunológicas e clínicas semelhantes com a esclerose múltipla (EM) e, portanto, é amplamente utilizada como modelo para identificar novos alvos de medicamentos para um melhor tratamento do paciente. A EM é caracterizada por vários cursos diferentes da doença: EM remitente-recorrente (EMRR), EM progressiva primária (EMPP), EM progressiva secundária (EMSP) e uma forma rara de EM progressiva-recidivante (EMPR). Embora os modelos animais não imitem com precisão todos esses fenótipos contrastantes de doenças humanas, existem modelos EAE que refletem algumas das diferentes manifestações clínicas da EM. Por exemplo, o EAE induzido por glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG) em camundongos C57BL/6J imita PPMS humanos, enquanto o EAE induzido por proteína proteolipídica (PLP) de mielina em camundongos SJL/J se assemelha ao RRMS. Outros autoantígenos, como a proteína básica de mielina (MBP) e várias cepas diferentes de camundongos também são usados para estudar EAE. Para induzir a doença nesses modelos EAE de imunização de autoantígenos, uma emulsão de água em óleo é preparada e injetada por via subcutânea. A maioria dos modelos EAE também requer uma injeção de toxina pertussis para que a doença se desenvolva. Para uma indução consistente e reprodutível de EAE, é necessário um protocolo detalhado para preparar os reagentes para produzir emulsões de antígeno/adjuvante. O método descrito aqui aproveita um método padronizado para gerar emulsões de água em óleo. É simples e rápido e usa um homogeneizador de agitação em vez de seringas para preparar emulsões de qualidade controlada.

O protocolo rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões CFA/MOG está representado na Figura 1. Este método foi recentemente descrito em outro lugar6. As emulsões CFA/MOG também podem ser preparadas com outros métodos, como o método tradicional da seringa ou por vórtice. Esses métodos foram comparados aqui avaliando a qualidade das emulsões. Todos os métodos produziram emulsões de água em óleo; a homogeneidade e a qualidade dessas emulsões foram avaliad...

Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

A encefalomielite autoimune experimental ou EAE é um modelo animal usado para desenvolver tratamentos novos e aprimorados para pacientes com esclerose múltipla. Induzir doenças em EAE requer uma emulsão perfeita de óleo e água para alcançar resultados consistentes. O método de preparação da emulsão aqui apresentado é livre da influência humana, limitando assim as inconsistências de um experimento para outro.Embora o método tenha sido otimizado para EAE, ele também pode ser usado para outros modelos de doenças autoimunes e também para testar vacinas contra o câncer. Para preparar a pasta CFA a 100 miligramas de M tuberculosis H37 RA liofilizada e cinco esferas de aço de 3,2 milímetros para um tubo de sete mililitros. Agite o tubo no homogeneizador durante 60 segundos à velocidade mais elevada.Adicione cinco mililitros de adjuvante IFA ao tubo e agite novamente durante 60 segundos à velocidade mais alta. Em seguida, transfira a pasta para um tubo fresco com uma pipeta deixando as contas para trás e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Para preparar uma emulsão CFA/Peptídeo, baixe o arquivo suplementar um para calcular a quantidade necessária para cada reagente.Em seguida, coloque o tubo tampado por parafuso e os reagentes a serem usados no gelo. Em seguida, adicione os componentes de emulsão. Primeiro PBS, depois o peptídeo, a pasta CFA.E, finalmente, a IFA. Feche o tubo com a tampa firme, apertando-o e soltando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente durante 5 a 10 segundos à mão para pré-misturar os reagentes.Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 segundos. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por três minutos e repita a corrida mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.Centrifugar o tubo a 300 G a partir de um minuto para remover o ar preso e compactar a emulsão. Remova a tampa do tubo. Insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão.Remova o invólucro de encaixe na parte inferior do tubo torcendo-o. Em seguida, remova o êmbolo de todas as seringas de injeção e adicione uma agulha às seringas de injeção. Em seguida, prenda a parte de trás da seringa de injeção à fechadura dedicada na parte inferior do tubo e trave-a com uma torção curta.Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injeção, empurrando o êmbolo suavemente. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 mililitros da seringa de injeção. Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo cuidadosamente tomando cuidado para que nenhum ar entre nesta seringa.Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha e repita o processo para o resto da emulsão presente no tubo. Para analisar o tamanho das partículas de água e óleo, adicione uma pequena gota da emulsão a uma lâmina de microscópio, espalhe-a com um deslizamento de tampa e, em seguida, empurre com força em um movimento circular para achatar a emulsão. Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão.Certifique-se de que partículas pequenas, uniformes, cinzas ou brancas estejam visíveis. As emulsões produzidas pelo método de homogeneização exibiam partículas em forma de feijão cinza ou branco representando minúsculas gotículas de emulsões de água e óleo. Em contraste, as gotículas de emulsão produzidas usando o método da seringa eram maiores e mais largas.No método do vórtice, grandes partículas cinza ou pretas foram observadas correspondendo a bolhas de ar presas na emulsão. Mudanças na distribuição do tamanho das partículas ao longo do tempo medidas usando um analisador de tamanho de partícula de desfração a laser para emulsões de água e óleo não mostraram nenhuma mudança no tamanho das partículas durante um período de seis semanas. As emulsões frescas de 3 semanas e 15 semanas de idade induziram doenças EAE semelhantes em todos os animais testados ao longo do experimento.Os camundongos desenvolveram um padrão de doença semelhante em todos os experimentos, revelando que o método de homogeneização aqui apresentado produziu emulsões que induziram EAE de maneira consistente e reprodutível. Antes de fazer a emulsão para um experimento, baixe o arquivo suplementar número um para calcular a quantidade de cada componente necessária para minimizar o desperdício. O método aqui apresentado poderia ser usado para padronizar a preparação da emulsão não apenas para pesquisas pré-clínicas, mas também no futuro para preparar vacinas contra o câncer na clínica.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Hipofisite auto-imune pode ser reproduzido em ratos através da injeção de um extrato de proteínas do mouse pituitária.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Linhagens determinados são capazes de resistir a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) com proteína básica de mielina. Descrito aqui é um simples protocolo de imunização que reverte a apatia e induz a doença paralítica em vários típicos EAE manchas resistentes do mouse.

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Este vídeo demonstra uma técnica de homogeneização eficiente para gerar uma emulsão antigénio-adjuvante para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) num modelo murino. A emulsão contém um autoantígeno - glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - na fase aquosa, cercada por uma fase oleosa contínua composta por uma bactéria patogênica inativada. A emulsão garante uma liberação sustentada de antígenos para uma resposta imune prolongada.

Preparando uma emulsão adjuvante de antígeno para induzir encefalomielite autoimune

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal estabelecido de esclerose múltipla. C57BL / 6 são imunizados com mielina de oligodendrócitos glicoproteína (MOG) peptídeo 35-55 (MOG 35-55), o que resulta em uma paralisia flácida ascendente causada por células imunes autorreactivas no sistema nervoso central. Protocolos para indução e monitoramento de doenças serão discutidos.

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Descrevemos um protocolo simples usando apenas equipamentos básicos de laboratório para gerar e purificar grandes quantidades de uma proteína de fusão que contém glicoproteína de oligodendrócitos de mielina de camundongo. Esta proteína pode ser usada para induzir encefalomielite autoimune experimental impulsionada por células T e B.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Aprenda a preparar emulsões padronizadas para induzir encefalomielite autoimune experimental (EAE) usando homogeneização com esferas de aço. Este método reduz a variabilidade entre experimentos e pode ser aplicado em modelos de doenças autoimunes e vacinas contra câncer.

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental (Vídeo) | JoVE Journal

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

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