Name: Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a quantificar complexos MPO-DNA e NE-DNA de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando ELISA sanduíche modificado. Este método sensível avalia a gravidade da sepse em configurações clínicas.

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Os autores agradecem ao Dr. Huq Muhammad Aminul pela assistência na revisão do manuscrito.

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelos comitês de revisão institucional da Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante.
1. Preparação dos reagentes
NOTA: Para realizar o ensaio ELISA sanduíche, os reagentes são preparados conforme descrito abaixo.
<ol><li>Tampão de revestimento:<ol><li>Para fazer um tampão carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L, pesar 10,6 g de carbonato de sódio anidro (peso molecular, 106 g/mol) e 8,4 g de bicarbonato de sódio (peso molecular, 84 g/mol).</li>
		<li>Adicione a aproximadamente 900 mL de água destilada em um copo.</li>
		<li>Ajustar o pH do tampão para 9,6 adicionando a quantidade necessária de ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio.</li>
		<li>Verifique o pH com um medidor de pH.</li>
		<li>Em seguida, adicione o volume necessário de água destilada para atingir um volume total de 1.000 mL.</li>
		<li>Conservar este tampão carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L no frigorífico a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Buffer de bloqueio:<ol><li>Adicionar aproximadamente 250 μL de azida sódica a 20% e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) a 70 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) composta por 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl e 1,47 mol/L de KH2PO 4 (pH7,4) e misturar delicadamente.</li>
		<li>Adicionar água destilada para atingir um volume total de 100 mL. As concentrações finais de albumina sérica bovina e azida sódica são de 1% e 0,05%, respectivamente. Aguarde 10 minutos e, em seguida, a solução está pronta para uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de lavagem: Preparar 0,5% t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol terc-octilfenil éter (Triton X-100) em água destilada.<ol><li>Diluir 100% Triton X-100 a 10% com água destilada e deixar a solução a 10% repousar 1 dia antes da utilização.</li>
		<li>Em seguida, diluir novamente a solução de Triton X-100 a 10% 20 vezes com água destilada para atingir uma concentração de 0,5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluição de anticorpos:<ol><li>Diluir o anticorpo de captura (anticorpo anti-MPO [1 mg/mL] ou anticorpo anti-NE [1 mg/mL]) para 1:2.000 no tampão de revestimento (pH 9,6) antes de usar no dia 1 do ensaio (veja abaixo) e o anticorpo de detecção (anticorpo anti-DNA conjugado à peroxidase) para 1:40 com PBS antes do uso no dia 3 do ensaio (veja abaixo). NOTA: Para o experimento preliminar, diluir os anticorpos do tipo iso (IgG coelho [5 mg/mL] e IgG1 clone de camundongo Ci4 [0,5 mg/mL]) para 1:10.000 e 1:1.000 no tampão de revestimento (pH 9,6).</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de substrato ABTS: Dependendo do número de amostras, dissolver um, dois ou três comprimidos de 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS) em 5 mL, 10 mL ou 15 mL de tampão ABTS (contendo perborato de sódio, ácido cítrico e hidrogenofosfato dissódico); 100 μL são necessários por amostra. Conservar a solução preparada a 2-8 °C protegida da luz. A solução é estável por até 3 meses.</li>
</ol>2. Coleta e armazenamento de amostras
<ol><li>Isolamento de plasma:<ol><li>Coletar 4 mL de amostras de sangue periférico em um tubo de coleta de sangue de heparina de lítio por punção venosa com seringa de 22 G e centrifugar a 1.600 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para um tubo de amostra de 2 mL com fechadura segura.</li>
		<li>Recentrifugar o sobrenadante a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover quaisquer células residuais.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante num novo tubo de amostra com fecho seguro sem perturbar o pellet no fundo do tubo.</li>
		<li>Conservar o plasma obtido a −80 °C até nova utilização. NOTA: Para obter resultados de alto rendimento com este ensaio, amostras de boa qualidade são necessárias. Se forem utilizadas amostras de plasma, efectuar uma segunda centrifugação para remover quaisquer células residuais. Evitar descongelamentos repetidos das amostras. Use heparina como anticoagulante, pois o EDTA afeta a atividade da DNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de polimorfonucleares neutrófilos<ol><li>Coletar as amostras de sangue periférico em um tubo de coleta de sangue de heparina de lítio por punção venosa com uma seringa de 22 G.</li>
		<li>Camada de 6 mL de sangue sobre 6 mL de polimorfos de uma etapa e centrifugar os tubos a 1.000 x g por 45 min à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Colher a terceira camada de buffy coat contendo neutrófilos e lavá-la três vezes em RPMI-1640 livre de fenol vermelho a 400 x g por 10 min em TR.</li>
		<li>Ressuspender os neutrófilos em RPMI-1640 livre de fenol vermelho contendo 2 mM de L-glutamina suplementada com 6% de soro fetal bovino inativado pelo calor e contar as células no campo do microscópio com um hemocitômetro. NOTA: Este método produz 96% a 98% de pureza com viabilidade superior a 95%, conforme avaliado pela exclusão do corante azul de tripano.</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação de polimorfonucleares neutrófilos e NETosis in vitro
	<ol><li>Diluir os neutrófilos polimorfonucleares recém-isolados a 1 × 105 células/mL em RPMI-1640 livre de fenol vermelho contendo 2 mM de L-glutamina suplementada com 6% de soro fetal bovino inativado pelo calor e semeá-los em placas de cultura de 35 mm.</li>
		<li>Para induzir NETs, estimular polimorfonucleares neutrófilos com PMA 25 nM por 4 h a 37 °C em 5% de CO2/95% de ar.</li>
		<li>Após 4 h de incubação, digerir parcialmente as NETs adicionando 0,6 μg/mL de DNase I diretamente às placas de cultura por 15 min em TR e interromper a atividade da DNase I adicionando 5 mM de EDTA.</li>
		<li>Recolher o meio que contém os TNEs sintetizados e centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C para remover os detritos celulares.</li>
		<li>Obter os sobrenadantes de quatro controles saudáveis, misturar e armazenar a -80 °C até o uso. NOTA: Neutrófilos estimulados por PMA digeridos por DNase, obtidos de quatro controles saudáveis, são usados como padrão NET1,14,15. Gere uma curva de calibração a partir de um padrão NET diluído em série com PBS e atribua os valores de densidade óptica (OD) obtidos de um padrão NET não diluído como 100% NET.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Método de ensaio
NOTA: As etapas para executar o ensaio são descritas em detalhes abaixo.
<ol><li>Dia 1<ol><li>Aplicar um total de 100 μL de anticorpo anti-MPO ou anti-NE diluído contendo 0,05 μg de anticorpo em cada poço da placa, incluindo o poço em branco. NOTA: O tampão de revestimento não deve conter qualquer tipo de detergente porque, caso contrário, os anticorpos podem não se ligar igualmente e suavemente às paredes de cada poço. Para evitar o efeito gancho, a concentração de proteína de revestimento não deve ser superior a 20 μg/mL, pois concentrações acima desse nível saturarão a maioria dos locais disponíveis na placa de microtitulação. A faixa de concentração típica de soluções de revestimento proteico é de 2-10 μg/mL. Para o experimento preliminar, use o anticorpo controle IgG de coelho do tipo iso diluído para revestimento em vez de anticorpos monoclonais específicos contra MPO. Use camundongos IgG1 com anticorpo controle do tipo iso diluído para revestimento em vez de anticorpos monoclonais específicos contra NE.</li>
		<li>Cobrir a placa com uma tampa plástica adesiva para evitar a evaporação da amostra e incubar durante a noite a 4 °C para permitir a ligação dos anticorpos de captura.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Eliminar a solução de anticorpos diluída dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL de solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.</li>
		<li>Retire o excesso de PBS batendo o prato seco em um papel toalha.</li>
		<li>Bloquear cada poço da placa de ELISA com 200 μL do tampão de bloqueio.</li>
		<li>Cubra a placa com uma tampa plástica adesiva e incube-a por 1,5-2 h no TR para obstruir os poços.</li>
		<li>Eliminar completamente a solução de bloqueio dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL de solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.</li>
		<li>Retire o excesso de PBS batendo o prato seco em um papel toalha.</li>
		<li>Aplicar um total de 25 μL de plasma ou meio em cada poço, exceto no poço em branco, e adicionar 75 μL de PBS como diluente para tornar o volume final de 100 μL; adicionar 100 μL de PBS ao poço em branco.</li>
		<li>Em seguida, misture as amostras em RT por 10 s colocando a placa em um agitador a 250 rpm.</li>
		<li>Aplicar 2 μL de DNase I 100 vezes diluída (0,03 mg/mL) em cada poço, incluindo o poço em branco (concentração final de DNase I na mistura de reação: 0,6 μg/mL).</li>
		<li>Sele a placa com uma tampa plástica adesiva e misture bem as amostras em RT por 10 s, colocando a placa em um agitador a 250 rpm. NOTA: Para avaliar as condições ideais para a digestão do DNA, ao desenvolver o ensaio, incubamos amostras contendo DNA associado à MPO de pacientes com COVID-19 com 0-0,9 μg/mL DNase I por 15 minutos no RT e usamos placas revestidas com anticorpo de captura específico para MPO ou um anticorpo de controle de isotipo combinado com espécie.</li>
		<li>Incubar as amostras por 15 min em TR.</li>
		<li>Retire a tampa plástica adesiva e aplique 1 μL de EDTA 0,5 M em cada poço para interromper a reação de DNase.</li>
		<li>Volte a selar a placa com uma tampa plástica adesiva e agite-a em RT por 15 s, colocando-a em um agitador a 250 rpm.</li>
		<li>Em seguida, incubar a placa durante a noite a 4 °C para permitir que os componentes proteicos das NETs se liguem aos anticorpos de captura.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 3<ol><li>Retire a tampa plástica adesiva e descarte a solução dos poços.</li>
		<li>Eliminar completamente a solução dos poços e, em seguida, pipetar 300 μL da solução de lavagem por poço e repetir este procedimento de lavagem três a quatro vezes.</li>
		<li>Aplicar um total de 100 μL do anticorpo anti-detecção de ADN conjugado com peroxidase diluído em cada poço.</li>
		<li>Sele a placa com uma tampa plástica adesiva e incube-a por 1,5 h no RT.</li>
		<li>Descarte completamente a solução dos poços e, em seguida, pipete 300 μL de solução de lavagem por poço e repita esse procedimento de lavagem de três a quatro vezes.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução residual.</li>
		<li>Aplicar um total de 100 μL de solução de substrato ABTS em cada poço e cobrir a placa com uma tampa plástica adesiva.</li>
		<li>Incubar a placa no escuro em RT por 20-30 min em um agitador a 250 rpm. NOTA: Monitorar a placa em intervalos de 5 min até que as leituras OD desejadas sejam obtidas.</li>
		<li>Adicionar um total de 50 μL de ácido sulfúrico 2 M para interromper a reação.</li>
		<li>Misture o conteúdo líquido dos poços batendo cuidadosamente na lateral da placa.</li>
		<li>Ligue o leitor de microplacas e conecte-o ao computador.</li>
		<li>Abra o aplicativo de software no computador.</li>
		<li>Na barra de status, crie um novo experimento e nomeie-o.</li>
		<li>Defina todos os seguintes parâmetros para leitura da placa: Tipo de leitura, Absorbância; Modo de leitura, Endpoint; comprimentos de onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Auto mix & Blanking antes, Off; Placa de pré-leitura, Off; Auto calibração, On; Tiras, Ler chapa inteira; Prioridade de comprimento de onda da coluna, prioridade da coluna; Velocidade do carro Normal; e Leitura automática, Off.</li>
		<li>Em seguida, coloque a placa de 96 poços contendo as amostras na gaveta e feche-a.</li>
		<li>Por último, selecione o botão Ler para que a placa seja lida imediatamente.</li>
		<li>Leia a absorbância de cada poço em um comprimento de onda de 405 nm usando um leitor de microplacas (neste estágio, use um comprimento de onda de 490 nm como referência).</li>
		<li>Execute a subtração automática do valor de absorbância do meio de ensaio sozinho de todas as amostras desconhecidas e salve os dados. NOTA: Utilizar uma curva padrão obtida a partir do padrão NET diluído em série para calcular a concentração relativa de NET na amostra 1,14,15. Aqui, os resultados finais são apresentados como "complexos de MPO ou NE-DNA (% do padrão NET)". O limite de detecção (LOD) foi calculado a partir do desvio padrão (DP) e a inclinação da curva de calibração (S) da seguinte forma: LOD = 3,3(DP/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Estatísticas
<ol><li>Realizar todas as análises estatísticas utilizando um software de análise estatística apropriado. Aqui foi utilizado o SigmaPlot v14.5. As porcentagens e variáveis contínuas são apresentadas como mediana com o intervalo interquartil devido à distribuição assimétrica da maioria dos parâmetros.</li>
	<li>Compare os níveis plasmáticos de MPO-DNA e NE-DNA entre pacientes COVID-19 e controles saudáveis usando o teste da soma de classificação de Wilcoxon. Use a análise de correlação para explorar a relação entre a densidade óptica e a porcentagem do padrão NET.</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
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</ol>

Todos os dados gerados e/ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado. Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Descrevemos um método de ELISA sanduíche no qual MPO ou NE se liga a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Após a lavagem, o "sanduíche" é completado incubando as amostras com um anticorpo monoclonal anti-DNA associado à peroxidase. Após a remoção do anticorpo secundário não ligado, o conjugado peroxidase ligado é detectado pela adição de um substrato cromogênico ABTS peroxidase, que produz um produto final solúvel que pode ser lido espectrofotometr...

Este artigo descreve um método para quantificar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET) em fluidos biológicos usando ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA) para detectar complexos de mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE) com DNA 1,2. As NETs são compostas por uma espinha dorsal de DNA decorada com proteases antimicrobianas originárias de grânulos de neutrófilos 3,4. Tanto o MPO-DNA quanto o NE-DNA complexos são componentes importantes e específicos das NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação das NETs 3,4.
Além de seu importante papel fisiológico na defesa antimicrobiana3, os TNEs também apresentam vários efeitos patológicos4,5, incluindo a promoção da trombogênese6 e o agravamento da sepse7. Nesse sentido, as NETs vêm ganhando atenção recentemente. No entanto, a quantificação in vivo de NETs tem se mostrado desafiadora devido à falta de um método de ensaio quantitativo sensível e confiável.
Alguns métodos estão disponíveis, incluindo a medida direta de NETs por microscopia de fluorescência8,9 e citometria de fluxo10 e a medida indireta de DNA livre de células circulantes, nucleossomos e histona citrulinada H3, mas cada método tem suas próprias vantagens elimitações11. Embora o método microscópico de imunofluorescência seja específico para NETs e mostre claramente a localização e o grau de formação de NETs, as amostras são limitadas a tecido de biópsia e materiais secretados. Além disso, esse método precisa ser realizado por pesquisadores capacitados e requer muito tempo para que os resultados sejam obtidos. A medição dos níveis circulantes de componentes relacionados à NET por citometria de fluxo é fácil e fornece resultados rapidamente; no entanto, o método não é específico para NETs12.
Nós13 e outros1,2 desenvolvemos um ensaio altamente sensível e confiável para medir os componentes NET circulantes, DNA conjugado com MPO ou NE, em plasma humano com uma técnica de ELISA modificada que usa anticorpos específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção específico para DNA. Este ensaio também pode ser usado ex vivo para identificar componentes NET em sobrenadantes de cultura celular liberados por neutrófilos ativados em resposta à estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

<table><tbody><tr><td>Corporação química e científica precisa</td> <td>de polimorfos de 1 etapa</td><td>AN221725</td><td>isolamento de PMNs do sangue humano.</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td> solução tampão <td>ABTS de fundo plano</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Contém perborato de sódio, ácido cítrico e hidrogenofosfato dissódico.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tablets ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Cada comprimido contém 5 mg de substrato ABTS e 60 mg de substâncias veiculares.</td></tr><tr><td>Capa plástica adesiva, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I</td><td>Loja em 2-8 &deg;C. estável por 1 ano. A espécie hospedeira é o coelho.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NE, clone AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck MABS461</td><td></td><td>Store a 2-8 ° C. estável por 1 ano. A espécie hospedeira é o rato.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>Albumina de fração bovina V. Armazene em 2&ndash; 8 &deg;C. estável por 2 anos.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Loja a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>IgG, coelho, controle de isotipo</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Armazene como solução concentrada em 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>IgG1, controle de isotipo de camundongo, clone Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>Armazene como solução concentrada em 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue de heparina de lítio</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de microplacas</td><td>Como uma corporação</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Qualquer leitor de placas microplate capaz de ler comprimentos de onda de 405&ndash; 490 nm pode usar.</td></tr><tr><td>Aplicação de leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-DNA conjugado com peroxidase, Detecção de morte celular ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; garrafa 2. Loja em 2&ndash; 8 &deg;C. estável por 1 ano.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Ativação de PMNs do sangue humano.</td></tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Armazenar em temperatura ambiente. Estável por 6 meses.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San Jose, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>t-octilfenoxipolietoxietanol, éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

quantificação de complexos mieloperoxidase-dna e elastase-dna neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um elisa sanduíche modificado

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certos estímulos, como microrganismos, fazem com que os neutrófilos liberem armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são basicamente estruturas semelhantes a teias compostas por DNA com proteínas de grânulos, como mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE), e proteínas citoplasmáticas e citoesqueléticas. Embora o interesse em NETs tenha aumentado recentemente, nenhum método de ensaio sensível e confiável está disponível para medir NETs em ambientes clínicos. Este artigo descreve um ensaio imunoenzimático modificado em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de NETs circulantes, complexos MPO-DNA e NE-DNA, que são componentes específicos de NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação de NETs. O ensaio utiliza anticorpos monoclonais específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção DNA-específico. MPO ou NE liga-se a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Este ensaio apresenta boa linearidade e alta precisão interensaio e intraensaio. Nós o usamos em 16 pacientes com COVID-19 com a síndrome do desconforto respiratório agudo associada e descobrimos que as concentrações plasmáticas de MPO-DNA e NE-DNA eram significativamente mais altas do que no plasma obtido de controles saudáveis. Este ensaio de detecção é um método confiável, altamente sensível e útil para investigar as características das NETs em sobrenadantes de plasma e cultura humanos.

Esse método utilizou um ELISA sanduíche com anticorpos monoclonais anti-MPO, anti-NE, e anti-DNA para medir o DNA associado à MPO e ao NE-associado (Figura 1). Neste método, os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com um anticorpo monoclonal específico para MPO ou NE-específico para capturar MPO associado ao DNA e NE, bem como MPO e NEs não associados ao DNA. Para calcular o coeficiente de variabilidade intra-ensaio (CV), medidas duplicadas foram realizadas dentro da mesma p...

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs têm atraído atenção recente, mas quantificar NETs in vivo tem se mostrado desafiador. Esse protocolo fornece um método desejável, altamente sensível e valioso para investigar as características dos TNEs em ambientes clínicos. Essa técnica deve se estender para avaliar a gravidade da sepse ou SDRA séptica, síndrome do desconforto respiratório agudo.É amplamente aceito que a regulação de dumps ou padrões moleculares associados a danos é a chave para melhorar a condição clínica da sepse. A maior vantagem deste método inclui a quantificação precisa de remanescentes de NET circulantes como mieloperoxidase-DNA e DNA elastase-neutrófilo em um curto espaço de tempo. É aconselhável girar as amostras antes do ensaio e evitar descongelamentos repetidos.É importante seguir os tempos de incubação conforme indicado no protocolo. Comece diluindo neutrófilos polimorfonucleares recém-isolados para 10.000 células por mililitro em RPMI 1640 livre de fenol vermelho. Peneire-os em pratos de cultura de 35 milímetros.Para induzir armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs, primeiro estimular os polimorfonucleares neutrófilos com PMA 25 nanomolares. Em seguida, digerir parcialmente as armadilhas extracelulares adicionando 0,6 microgramas por mililitro de DNase I e incubar a mistura por 50 minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione EDTA de cinco milimolares para interromper a atividade da DNase e colete o meio que contém as NETs sintetizadas.Centrífuga para remover os detritos celulares. Colete os sobrenadantes de quatro controles saudáveis. Misture-os a menos 80 graus Celsius para uso posterior.Pipetar 100 microlitros de antimieloperoxidase diluída contendo 0,05 microgramas do anticorpo para uma placa de ELISA. Agora, cubra a placa com uma tampa plástica adesiva para evitar a evaporação da amostra e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ligação dos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução de anticorpos diluída dos poços e pipete 300 microlitros de solução de lavagem em cada poço.Toque o prato seco em um papel toalha para remover o excesso de PBS. Bloqueie cada poço da placa com 200 microlitros do tampão de bloqueio. Cubra-o com uma tampa plástica adesiva e obstrua os poços incubando-o.Depois de descartar a solução de bloqueio dos poços e lavar o prato de três a quatro vezes, seque-o em um papel toalha. Em seguida, pipetar 25 microlitros de plasma em todos os poços, exceto o branco. E diluir com 75 microlitros de PBS, fazendo com que o volume final do poço seja de 100 microlitros.Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS ao poço em branco. Misturar as amostras colocando a placa num agitador durante 10 segundos a 250 rpm à temperatura ambiente. Adicione dois microlitros de 100 DNase I totalmente diluída em todos os poços e coloque a placa selada no agitador por 10 segundos para misturar bem as amostras.Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicione um microlitro de EDTA 0,5 molar a cada poço para interromper a reação da DNase. Em seguida, coloque a placa selada no agitador por 15 segundos para misturar bem as amostras.Finalmente, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que os componentes proteicos das NETs se liguem aos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução dos poços. Após várias lavagens de poços, pipetar 100 microlitros do anticorpo anti-detecção de DNA conjugado com peroxidase diluído em cada poço.Incubar a placa por 1 hora e meia e, em seguida, descartar a solução nos poços. Depois de lavar os poços três vezes, pipetar 100 microlitros de solução de substrato ABTS em cada poço e incubar a placa selada em um agitador no escuro. Pare a reação adicionando 50 microlitros de ácido sulfúrico de dois molares.Misture o conteúdo do poço batendo cuidadosamente nas laterais da placa. Em seguida, conecte o leitor de microplacas ao computador e inicie o aplicativo de software. Na barra de status, crie um novo experimento e nomeie-o.Em seguida, defina os parâmetros de leitura da placa selecionando Absorbância como o tipo de leitura, Ponto de extremidade como o modo de leitura e dois como os comprimentos de onda. Em seguida, defina lambda um como 405 nanômetros, lambda dois como 490 nanômetros. Agora, selecione o status Desativado para Automix e Blanking, mantendo a AutoCalibração como On.Em seguida, selecione Ler chapa inteira em Tiras.Finalmente, defina a Prioridade do Comprimento de Onda da Coluna com Normal como a Velocidade do Carro e selecione Desativado em Leitura Automática. Coloque bem a placa na gaveta do instrumento e feche-a. Clique em Ler para que a placa seja lida imediatamente.Leia a absorbância de cada poço a 405 nanômetros e realize a subtração automática da absorbância do meio de ensaio de todas as amostras desconhecidas. Curvas padrão confiáveis de calibração foram obtidas para MPO-DNA e NE-DNA quando os valores de absorbância não excederam 0,93 e 0,9, respectivamente. A maior DO foi obtida quando se aplicou 0,6 microgramas por mililitro de DNase I.Os coeficientes de variabilidade interensaio para os complexos em controles saudáveis foram 1,871 e 0,987, respectivamente, enquanto os pacientes COVID-19 mostraram coeficientes de variabilidade de 2,532 e 2,010, respectivamente. Os coeficientes médios de variabilidade interensaio para MPO-DNA e NE-DNA foram 6,524 e 4,389, respectivamente. A especificidade dos anticorpos de captura para os complexos MPO-DNA e NE-DNA mostrou que os anticorpos de controle do isotipo reagiram pouco aos complexos.A porcentagem de ambos os complexos foi maior no plasma de pacientes com COVID-19 em relação aos controles saudáveis. O tempo de digestão da DNase deve ser otimizado, caso contrário, a digestão excessiva reduzirá a absorbância.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

São apresentados ensaios de alto rendimento que, em combinação, fornecem excelentes ferramentas para quantificar a liberação de NET de neutrófilos humanos.

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aprenda a quantificar complexos MPO-DNA e NE-DNA de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando ELISA sanduíche modificado. Este método sensível avalia a gravidade da sepse em configurações clínicas.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado (Vídeo) | JoVE Journal

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

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