Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens
10 de fevereiro de 2023
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.
A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Este protocolo simples para imagens de lapso de tempo 3D pode estudar diretamente a dinâmica da parede celular durante um longo período. Este protocolo utiliza corante calcofluor para marcar a dinâmica da espessura da parede celular e, portanto, não requer uma transformação de uma proteína fluorescente.
Os sinais de calcofluor são estáveis e podem durar mais de uma semana. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas com estruturas simples contendo paredes celulares e pode ser corado por calcofluor, como em plantas com flores. Neste protocolo, os sinais de calcofluor são estáveis quando este corante é misturado dentro do meio durante todo o processo de imagem de lapso de tempo.
Para começar, disperse o tecido de musgo de sete dias de idade em um microtubo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros de água esterilizada. Para o tipo selvagem use fórceps para separar os prótonos. Para o mutante ggb, separe os protonatos usando a pipeta AP-1000.
Adicione 10 microlitros do calcofluor-branco esterilizado no microtubo e deixe o tubo ereto no exaustor por dois minutos para colorir. Imediatamente após a coloração, misture as plantas com 200 microlitros de BCDATG resfriado contendo meio BCDAT pipetando cinco vezes com uma pipeta P1000 e transfira a mistura para um prato de base de vidro de 27 milímetros. Certifique-se de que os 200 microlitros de BCDATG com amostras sejam distribuídos uniformemente na superfície do prato de fundo de vidro de 27 milímetros para produzir uma fina camada de filme para que as amostras estejam dentro da distância de trabalho objetiva durante a imagem.
Depois de solidificar por dois minutos à temperatura ambiente, cubra a camada fina com três mililitros de BCDATG resfriado e deixe ajustar por 10 minutos para solidificar novamente. Na parte inferior do prato, desenhe nove linhas cada em direções paralelas e perpendiculares e marque as linhas com caracteres de A a H e as colunas com números de um a oito. Use superior, inferior, direita, meio e esquerda para marcar as posições dentro de cada quadrado.
Por exemplo, se uma planta está em um quadrado na segunda linha, na sexta coluna e está posicionada na parte superior esquerda do quadrado, então essa planta recebe o nome de b6 no canto superior esquerdo. Coloque o prato com fundo de vidro sob luz branca por um a dois dias antes de ser submetido a imagens de lapso de tempo todos os dias, por até três dias. Para reconstruir as imagens 3D, abra o arquivo ND2 e clique em volume.
Reconstrua a parede celular no dia zero, no primeiro dia, no terceiro dia e no quarto dia. Depois de tirar cada imagem, coloque o prato à base de vidro de volta na câmara de cultivo. Mudanças dinâmicas nas paredes transversais foram demonstradas pela coloração branco-calcofluor no tipo selvagem e mutantes ggb.
Para os mutantes ggb, as linhas tracejadas brancas abaixo de cada imagem indicam a parede celular da superfície quebrada nas células em expansão e as linhas laranjas indicam as células abaixo da superfície da parede celular em ggb. As diferenças no sinal calcofluor-branco podem ser detectadas nas posições superficiais das células e regiões menos densamente coradas indicaram expansão celular em mutantes ggb ou locais recém-ramificados no tipo selvagem. Para a pré-cultura do tipo selvagem, as plantas em luz vermelha fraca do acima por cinco dias são necessárias para induzir as respostas fototrópicas dos protonatos, de modo que as plantas possam ser anexadas ao fundo dos pratos e as plantas possam emergir dentro da distância objetiva de trabalho durante a imagem, porque o calcofluor-branco pode ser usado com outro corante, como a microesfera.
Informações adicionais sobre a expansão celular também podem ser estudadas. A dinâmica da parede celular da planta é fundamental para o crescimento e desenvolvimento eficiente, bem como para a resposta ao sinal ambiental. Este protocolo permite a divisão direta de alterações nos sinais da parede celular e na integração.
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Visão Geral
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para imagem em time-lapse 3D da dinâmica da parede celular em tecido de musgo vivo. O método permite a visualização do descolamento da parede celular em mutantes ggb e padrões de espessamento em musgo do tipo selvagem durante o desenvolvimento ao longo de um período prolongado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Desenvolvimento de Plantas
- Técnicas de Microscopia
Fundamentos
- A imagem em time-lapse é crucial para observar a dinâmica celular.
- A microscopia de fluorescência permite a visualização detalhada dos processos de crescimento.
- O corante calcofluor é usado para colorir as paredes celulares sem necessitar de transformação de proteína fluorescente.
- A estabilidade dos sinais de calcofluor aumenta a confiabilidade da imagem ao longo do tempo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para observar a dinâmica da parede celular em musgo.
- Investigar diferenças no comportamento da parede celular entre mutantes ggb e musgo do tipo selvagem.
- Fornecer um método aplicável a outros sistemas vegetais com paredes celulares.
Métodos Utilizados
- Imagem em time-lapse 3D com microscopia de fluorescência.
- Uso do corante calcofluor para marcar a dinâmica da parede celular.
- Sinais estáveis de calcofluor mantidos durante todo o processo de imagem.
- Aplicação do protocolo a vários sistemas vegetais.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida do descolamento da parede celular em mutantes ggb.
- Observação de padrões de espessamento em musgo do tipo selvagem.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo a outras estruturas vegetais.
- Sinais estáveis de calcofluor confirmados para períodos prolongados de imagem.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar a dinâmica da parede celular.
- Os insights obtidos podem melhorar a compreensão do desenvolvimento das plantas.
- Este método pode ser adaptado para uso em várias espécies vegetais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
