Cirurgia e Testes Comportamentais no Modelo de Transposição do Neuroma Tibial em Ratos
6 de janeiro de 2023
Este protocolo descreve o modelo de transposição do neuroma tibial, que envolve uma lesão do nervo tibial com subsequente transposição da extremidade proximal do nervo para uma posição subcutânea pré-tibial ou lateral. O teste comportamental da dor do neuroma e da hiperalgesia plantar é quantificado usando monofilamentos de Von Frey.
Este método ajuda a encontrar melhores tratamentos para a dor do neuroma. A vantagem dessa técnica é que você pode medir a dor do neuroma e a dor generalizada independentemente no mesmo modelo de repetição. O modelo TNT é particularmente adequado para o teste da dor do neuroma, pois o próprio neuroma pode ser estimulado mecanicamente com os monofilamentos de Von Frey.
Comece colocando o rato anestesiado de costas com a cabeça para a esquerda ou para a direita. Coloque a perna a ser operada perto do cirurgião. Exorotar o membro posterior inferior de modo que o maléolo medial fique voltado para cima.
Antes de colocar o rato sob um microscópio cirúrgico estéreo com aumento de 6x, desinfete a área raspada com pelo menos três rodadas alternadas de esfoliação à base de iodo e álcool. Localize o joelho e faça suavemente uma incisão longitudinal de dois a três centímetros sobre o lado medial da pata traseira da panturrilha média ao tornozelo usando um bisturi. Se necessário, abra ainda mais a pele e subcutis com microtesoura até que as camadas musculares fiquem visíveis.
Identifique o feixe neurovascular superficial como duas a três linhas brancas, roxas ou vermelhas que podem se mover livremente sobre as camadas musculares. Manter o feixe neurovascular intacto. Disseque a parte posterior deste feixe.
Em seguida, dissecar para abrir a fáscia entre os músculos gastrocnêmios. Entre a fáscia dos músculos, encontra-se o feixe neurovascular mais profundo com o nervo tibial, que tem cerca de três vezes o tamanho do feixe neurovascular superficial. Use o osso tibial como um marco adicional, pois o nervo tibial voa logo posterior ao osso tibial.
Para dissecar o nervo tibial livre dos feixes vasculares circundantes, mova bruscamente o nervo tibial e corte o tecido exposto que mostra algum estiramento durante a movimentação do nervo tibial. Uma vez exposto todo o nervo tibial, recoloque as camadas musculares para evitar a desidratação do nervo até a dissecção da pele pré-tibial do músculo subcutâneo. Para dissecar a pele pré-tibial da camada muscular subcutânea e fazer um túnel subcutâneo, segure a pele para cima e empurre a ponta romba para o tecido paralelo à pele usando uma ferramenta de microcirurgia romba.
Certifique-se de que a extremidade do túnel esteja localizada pré-tibial ou lateralmente para facilitar a acessibilidade da área para teste do neuroma. Após o corte do nervo tibial na extremidade distal próximo ao tornozelo, alterar a magnificação do microscópio para 10x ou 16x e identificar o epineuro do nervo tibial proximal ao corte feito próximo ao tornozelo. Ou, no caso de uma bifurcação mais proximal do nervo tibial, identificar o epineuro de ambos os ramos planter medial e lateral proximal ao corte feito próximo ao tornozelo.
Coloque cuidadosamente um 8-0 sutura de náilon através do epineuro da extremidade nervosa proximal, segurando o epineuro com uma pinça e colocando a agulha entre o nervo e o epineuro com uma mordida de aproximadamente 0,5 milímetros. Dê uma mordida com a agulha por via subcutânea no final do túnel subcutâneo e puxe a sutura para transpor o nervo lateralmente para o túnel subcutâneo. Fixe a sutura fazendo um nó.
Coloque uma sutura mais espessa de 4-0 com uma cor escura ruborizada até a extremidade nervosa fixada sem penetrar na pele. Certifique-se de que a sutura é visível fora da pele. Verifique se o nervo permanece no lugar depois de mover a pata e os músculos.
Corte as extremidades da sutura com uma extremidade de sutura um pouco mais longa no 4-0, depois no 8-0 sutura. Alterar a ampliação do microscópio para 6x e fechar a pele com suturas intraepidérmicas usando o 8-0 sutura. Limpe suavemente a pele com cloreto de sódio a 0,9% com um cotonete.
Se a sala estiver fria, coloque uma almofada de aquecimento sob uma parte de uma gaiola limpa e coloque o rato na gaiola sob uma toalha de papel em uma posição confortável. Garanta fácil acesso a alimentos e água. Para estimular o nervo estéril para hipersensibilidade, aplique o monofilamento no lado lateral próximo à borda do cabelo sem tocar nas almofadas dos pés.
Para estimular o nervo tibial para hipossensibilidade, aplique o monofilamento no meio da superfície da plantadora da pata traseira. Para o teste do local do neuroma, segure os ratos com o nariz apontado para a prega do cotovelo. Se o rato for segurado na mão direita, sua pata traseira esquerda deve ficar pendurada livremente entre o polegar direito e o indicador.
Depois de verificar se o rato está calmo e confortável enquanto segura, na linha de base, coloque o monofilamento de 15 gramas suavemente na superfície pré-tibial da pata traseira exposta. Após a cirurgia, colocar o monofilamento de 15 gramas sobre a sutura visível e aplicar força suficiente no monofilamento para dobrar os cabelos e segurar por um segundo. Von Frey, do sítio do neuroma, mostrou que, no início do estudo, os ratos responderam a 10% a 15% das aplicações de um monofilamento de 15 gramas.
Uma semana após a cirurgia de transposição do neuroma tibial, a taxa de resposta aumentou de 45% para 50%No lado contralateral, as respostas após a cirurgia foram semelhantes às basais. Cerca de 20% dos ratos não desenvolveram neuroma doloroso e a taxa de resposta não aumentou em relação aos valores basais. Ao final do coto do nervo tibial transeccionado e transposto, 12 semanas após a cirurgia, todos os ratos desenvolveram neuroma.
A transecção do nervo tibial reduziu a sensibilidade mecânica no meio da face plantadora da pata traseira inervada pelo nervo tibial. A hipossensibilidade presente em uma semana após a cirurgia foi significativamente diferente do lado contralateral e basal a partir de três semanas após a cirurgia e permaneceu até 12 semanas após a cirurgia. Na parte lateral do lado plantador da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, os ratos desenvolveram hipersensibilidade mecânica significativamente diferente do lado contralateral e basal a partir de uma semana após a cirurgia.
Persistiu por 12 semanas após a cirurgia. Na pata contralateral, a sensibilidade mecânica não foi afetada em relação à basal nas áreas inervadas pelo nervo sural ou tibial. Lembre-se de criar um off-length do nervo tibial para amplitude de movimento para transposição lateral.
Lembre-se também de marcar este local do neuroma com uma sutura escura.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o modelo de transposição de neuroma tibial, que envolve a lesão do nervo tibial seguida de sua transposição para testes comportamentais de dor neuropática e hiperalgesia utilizando monofilamentos de Von Frey. O método permite a quantificação independente tanto da dor do neuroma quanto da dor generalizada em um único modelo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise comportamental
- Modelos de lesão nervosa
Contexto
- A dor por neuroma é um desafio clínico significativo.
- Os modelos existentes podem não permitir medições independentes de dor localizada e generalizada.
- O modelo de transposição do nervo tibial fornece uma plataforma para estudar os mecanismos da dor.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo reprodutível para o estudo da dor neuromatosa.
- Testar a eficácia de tratamentos para alívio da dor.
- Quantificar respostas comportamentais associadas à lesão e regeneração nervosa.
Métodos Utilizados
- O modelo envolve dissecação cirúrgica do nervo tibial em ratos.
- As avaliações comportamentais utilizam monofilamentos de Von Frey para medir hiperalgesia.
- As cirurgias são realizadas sob microscópio cirúrgico estereoscópico com técnicas de dissecação meticulosas.
- As avaliações pós-operatórias são realizadas no momento basal, após uma semana e até 12 semanas após a cirurgia.
Resultados Principais
- O estudo constatou que ratos exibiram sensibilidade aumentada no local do neuroma 12 semanas após a cirurgia.
- Quarenta e cinco a cinquenta por cento dos ratos mostraram respostas acentuadas à estimulação mecânica após a cirurgia.
- A hipossensibilidade também foi observada, indicando alterações nas taxas de resposta ao longo do tempo em comparação com as medições basais.
Conclusões
- Este estudo demonstra um novo método para avaliar a dor neuromática e a eficácia de tratamentos.
- O modelo permite obter informações sobre os mecanismos da dor e da resposta a lesões na lesão do nervo periférico.
- Oferece uma base para pesquisas futuras sobre estratégias de manejo da dor.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de rato com transposição de neuroma tibial (TNT) permite a quantificação independente da dor específica do neuroma e da dor generalizada, apoiando a desmistificação mecanicista na pesquisa da dor neuropática. Este modelo fornece uma plataforma robusta para avaliar intervenções cirúrgicas e farmacológicas direcionadas a distintas modalidades de dor. Sua reprodutibilidade e capacidade de avaliação em dois locais aumentam a confiança preditiva para o desenvolvimento de terapias translacionais para dor.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos da dor ao isolar a alodinia mediada por neuroma e nervo sural.
- Apoia a validação funcional de alvos para analgésicos candidatos e intervenções cirúrgicas.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir respostas de dor localizadas versus generalizadas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece um sistema in vivo validado para ensaios comportamentais quantitativos de dor utilizando monofilamentos de Von Frey.
- Permite a medição reprodutível de hipersensibilidade mecânica em sítios anatômicos distintos.
- Apóia a padronização de ensaios para comparação entre estudos e equipes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com os pontos finais de dor neuropática relevantes para doenças observados em casos clínicos de neuroma.
- Permite a continuidade da validação de alvos em estágio de descoberta até os testes pré-clínicos de eficácia de terapêuticas para dor.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo fenótipos de dor persistentes e quantificáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo TNT insere-se na continuidade entre a descoberta inicial e a validação pré-clínica na pesquisa da dor neuropática, servindo como elo entre estudos mecanicistas e a avaliação de candidatos translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o envolvimento de vias da dor e mecanismos específicos de neuroma.
- Triagem: Fornece respostas comportamentais quantitativas e específicas do local para avaliação de compostos ou intervenções.
- Análises: Permite comparação estatística das respostas à dor entre diferentes momentos e grupos de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Oferece fenótipos de dor persistentes relevantes para a dor clínica de neuroma, permitindo validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Oferece um modelo padronizado e reprodutível, adaptável a diversos programas de pesquisa em dor.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos da dor e em estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização de ensaios comportamentais de dor.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção para candidatos a terapias analgésicas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas de analgésicos e intervenções cirúrgicas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia e familiaridade com a neuroanatomia de ratos.
- Requer acesso a infraestrutura de microscopia estereoscópica e testes comportamentais.
- Exige padronização rigorosa entre equipes nos protocolos cirúrgicos e comportamentais.
- O modelo está limitado a ratos; a avaliação do local do neuroma não é viável em camundongos.
- Aproximadamente 20% dos ratos podem não desenvolver um neuroma doloroso, exigindo seleção cuidadosa do grupo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Anesthesia and Preparation
1:12
Surgery and Post‐Surgical Treatment
4:30
Von Frey Testing of the Plantar Side of the Hind Paws and Neuroma Site
5:25
Results: Behavioral Testing of Neuroma Pain and Plantar Hyperalgesia
6:57
Conclusion
