Name: O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a criar transgênicos em Danio rerio usando o sistema Tol2 modular baseado em Gateway. Este protocolo detalhado facilita a injeção de construtos transgênicos em embriões de peixe-zebra para estudos de desenvolvimento embrionário.

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A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por uma bolsa do National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L.

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC12. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.
NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4st72;smad5b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser. As medidas da endoderme foram realizadas utilizando-se a ferramenta de medida do ImageJ. Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio de software estatístico.
1. Fazendo as soluções e mídias
<ol><li>Meio bacteriano: Dissolver o caldo LB ou ágar conforme as instruções do fabricante, e autoclave. Antes de despejar o meio em placas de Petri de 100 mm, adicione ampicilina (50 μg/mL), canamicina (50 μg/mL) ou uma combinação de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/mL e 30 μg/mL, respectivamente).</li>
	<li>Para fazer 20x estoque de meio embrionário, dissolver o seguinte em 1 L de água: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na 2 HPO 4 e 4,9 g de MgSO4·7H 2O. Filtrar-esterilizar a solução-mãeusando um sistema de filtração a vácuo de 0,22 μm, e armazenar a 4 °C. NOTA: Ignore o precipitado branco que se forma; isso não vai impactar a mídia.</li>
	<li>Em 19 L de água, dissolver 1,2 g de NaHCO3 e adicionar 1 L do stock de 20x de meios embrionários para gerar a solução de meio embrionário de trabalho e manter esta solução a 28 °C.</li>
	<li>Para solução de vermelho de fenol a 2%, dissolver 20 mg de sal de sódio vermelho de fenol em 1 mL de água livre de RNase e armazenar à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Moldes de injeção de embriões
<ol><li>Para fazer a placa de injeção de agarose, dissolver a agarose no meio embrionário até uma concentração final de 3% aquecendo para ferver.</li>
	<li>Despeje 50 mL de agarose em placas de Petri de 100 mm e, enquanto a agarose ainda estiver líquida, coloque suavemente o molde de injeção na agarose para evitar a formação de bolhas sob o molde.</li>
	<li>Deixe as placas de agarose esfriar. Quando a agarose estiver sólida, remova o molde de injeção e guarde a 4 °C até estar pronto para usar.</li>
</ol>3. Pipetas de injeção
<ol><li>Puxe os capilares de 1,0 mm (OD) contendo um filamento em agulhas usando um extrator de pipeta vertical com o solenoide ajustado para 2,5 e o elemento de aquecimento ajustado para 14,6. NOTA: Qualquer extrator aquecido funcionará se puxar os capilares em duas agulhas de forma limpa e uniforme, mas as agulhas de injeção precisam ser puxadas dentro de 1 semana após a injeção dos embriões de peixe-zebra para resultados consistentes da injeção.<ol><li>Coloque o capilar no puxador, aperte a braçadeira em cada extremidade e, em seguida, ative o elemento de aquecimento.</li>
		<li>Puxe os capilares para criar duas agulhas de injeção.</li>
		<li>Retire os capilares do puxador e guarde-os em uma placa de Petri vazia com uma tira de argila modeladora que atua como suporte da agulha.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparação de mRNA de transposase
<ol><li>Linearizar o plasmídeo Tol2Kit contendo transposase com uma endonuclease de restrição NotI, combinando o seguinte em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de plasmídeo transposase (150 ng/μL), 1,5 μL de tampão de reação de endonuclease de restrição, 0,3 μL de endonuclease NotI.</li>
	<li>Encha a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misture e digerir a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Pare a digestão da transposase adicionando 1 μL de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 2 μL de 5 M NH4OAc e 80 μL de 100% de EtOH à reação de digestão e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 14.000x g durante 20 min a 4 °C e, em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender a pastilha de ADN em água isenta de RNase.</li>
	<li>Determinar a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro executando primeiro 2 μL de um branco de água livre de RNase e, em seguida, executando 2 μL do plasmídeo linearizado. NOTA: As concentrações plasmidiais normalmente variam entre 100-200 ng/μL</li>
	<li>Configure a produção de mRNA do SP6 combinando os seguintes componentes em ordem em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampão de reação 10x, 0,1-1 μg de molde de DNA linear e 2 μL de mistura enzimática SP6.</li>
	<li>Encher a reação até 20 μL com água sem RNase e, em seguida, misturar e incubar a 37 °C por 2 h.</li>
	<li>Após incubar por 2 h, adicionar 1 μL de DNase, misturar bem e incubar por mais 15 min a 37 °C.</li>
	<li>Para interromper a reação SP6, adicione 30 μL de solução de precipitação de LiCl ao tubo de reação e, em seguida, misture e resfrie a -20 °C durante a noite.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 14.000 x g por 20 min a 4 °C para pellet do mRNA, aspirar o sobrenadante e lavar o pellet de mRNA com 1 mL de EtOH 80% (diluído com água livre de RNase).</li>
	<li>Centrifugar a solução a 14.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para pelar o mRNA e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Deixe o pellet secar ao ar.</li>
	<li>Ressuspender a pastilha de mRNA em 20 μL de água livre de RNase, determinar a concentração de mRNA em nanogramas por microlitro (ng/μL) usando um fluorômetro conforme descrito na etapa 4.5 (deve ser de pelo menos 100 ng/μL), alíquota de 100 ng de mRNA por tubo para uso único e armazenar a −80 °C. NOTA: Para garantir que o mRNA não seja degradado, 2 μL de mRNA podem ser executados rapidamente em um gel de eletroforese de DNA para confirmar uma única banda a 1.950 bps.</li>
</ol>5. Clonagem de Multisite Gateway para criar vetores de entrada para transgênese
NOTA: Este protocolo é modificado de Kwan et al.10, com a reação LR escrita como uma reação de meio LR e com um volume total de 5 μL. Para gerar novos elementos de entrada, é necessário utilizar reações de PB utilizando vetores doadores de 5', meio e 3'10,13.
<ol><li>Para realizar a reação, reúna 10 fmol cada de p5E, pME e p3E e 20 fmol do vetor de destino (pDest). NOTA: A recombinação de LR multissítio usa quatro vetores plasmidiais diferentes: um vetor de entrada de 5' (p5E), um vetor de entrada do meio (pME), um vetor de entrada de 3' (p3E) e um vetor de destino (pDest), para gerar uma construção transgênica única flanqueada por repetições de Tol2 prontas para serem injetadas em embriões de peixe-zebra.<ol><li>Identifique o tamanho de todos os quatro vetores em pares de bases da fonte de plasmídeo (Tabela 1, Tol2Kit Wiki página14 ou Addgene11; veja a Tabela de Materiais). NOTA: Para novos vetores, o sequenciamento completo de plasmídeos por meio de empresas de sequenciamento comercial pode fornecer o tamanho exato do plasmídeo em bps.</li>
		<li>Determinar a concentração dos quatro vectores em nanogramas por microlitro (ng/μL) utilizando um fluorómetro, conforme descrito no passo 4.5.</li>
		<li>Usando o peso do DNA como 660 g/mol e o tamanho do plasmídeo (em bps), calcule o total de nanogramas (ng) de plasmídeo necessários para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: O laboratório Mosimann da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus, gerou uma planilha disponível gratuitamente para calcular a quantidade de plasmídeo necessária (em ng) e o volume (em μL) dos vetores necessários na reação LR15.</li>
	</ol></li>
	<li>Para gerar a construção descrita abaixo, sox17: EGFPCAAX, use os seguintes vetores: um vetor p5E contendo o promotor zebrafish sox17 , que é 6.918 pb no tamanho16; um vetor pME contendo o EGFP prenilado, que é de 3.345 pb no tamanho10; um vetor p3E contendo a sequência de sinal SV40 late poly A, que é de 2.838 pb no tamanho10; e o pDest, que tem 5.883 pb no tamanho10.</li>
	<li>Usando a concentração de plasmídios determinada na etapa 5.1.2 e a quantidade em nanogramas (ng) para cada vetor (etapa 5.1.3), calcule o total de microlitros (μL) de cada plasmídeo necessário para atingir 10 fmol (vetores de entrada) ou 20 fmol (vetor de destino) e, em seguida, divida isso por dois para uso nas reações de 5 μL de meio LR (todos os valores listados abaixo estão listados na Tabela 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>Para gerar 10 fmol de p5E-sox17, use 45,66 ng (na concentração de 140,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 4 para obter 0,65 μL.</li>
		<li>Para gerar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22,08 ng (a uma concentração de 213,5 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 10 para obter 0,52 μL.</li>
		<li>Para gerar 10 fmol de p3E-poly A, use 15,73 ng (na concentração de 276,1 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 20 para obter 0,57 μL.</li>
		<li>Para 20 fmol do vetor de destino, use 77,66 ng de pDest (a uma concentração de 307,3 ng/μL) e dilua com água estéril por um fator de 5 para obter 1,63 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Para estabelecer uma reação de 5 μL de meio-LR, combine os volumes de p5E, pME, p3E e pDest determinados na etapa 5.3 em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e, em seguida, adicione água estéril para atingir um volume total de reação de 4 μL.</li>
	<li>Vórtice vigorosamente a mistura enzimática LR 2x por 1 min cada para garantir a mistura adequada e, em seguida, adicione 1 μL à reação e misture completamente.</li>
	<li>Incubar a 25 °C durante a noite (16+ h).</li>
	<li>Parar a reação LR adicionando 0,5 μL de proteinase K (2 μg/μL), incubar a 37 °C por 10 min e arrefecer até à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transformar 3-4 μL de plasmídeo em células descongeladas e quimicamente competentes, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25-30 min.</li>
	<li>Enquanto as células ficam no gelo, aqueça duas placas de ágar LB-ampicilina à temperatura ambiente.</li>
	<li>Choque térmico das células em banho-maria a 42°C por precisamente 30 s.</li>
	<li>Após o choque térmico, adicionar 250 μL de meio líquido rico e livre de antibióticos às células e incubar com agitação a 37 °C por 1,5 h.</li>
	<li>Espalhe 300 μL de bactérias em uma placa de ampicilina e incube a 37°C durante a noite.</li>
	<li>Na manhã seguinte, rastrear as colônias quanto à presença de dois fenótipos, claro e opaco, escolher as colônias claras (como descrito em Kwan et al.10), uma de cada vez, inocular a cultura líquida e, em seguida, agitar a 37 °C durante a noite. NOTA: Colônias claras quase sempre contêm a colônia LR correta (&gt;85% das vezes).</li>
	<li>Usando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante, execute uma preparação de plasmídio em cada cultura líquida e digere diagnóstica cada plasmídeo para confirmar o tamanho apropriado da construção transgênica, o que indica que a reação de gateway LR funcionou corretamente.</li>
	<li>Re-transformar as construções transgênicas corretas usando o protocolo padrão de transformação bacteriana como descrito nas etapas 5.4-5.12 usando 0,5-1 μL do plasmídeo, e incubar apenas a 37 °C por 1 h.</li>
	<li>Re-estriar as colônias e confirmar que cada uma tem a construção transgênica LR como na etapa 5.14.</li>
	<li>Determinar a concentração plasmidial conforme descrito na etapa 4.5 (pelo menos 150 ng/μL são necessários para a injeção do embrião).</li>
</ol>6. Injeção do transgene nos embriões
<ol><li>Descongelar uma amostra de mRNA transposase de uso único e a construção transgênica de Tol2 no gelo e pré-avisar uma placa de injeção de agarose à temperatura ambiente.</li>
	<li>Combinar o seguinte no gelo: 150 ng de plasmídeo, 100 ng de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol (0,3 μL). Em seguida, adicione água livre de RNA para completar o volume de 3 μL.</li>
	<li>Transfira embriões em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção (descrita na etapa 2) preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50-75 embriões por slot da placa de injeção.</li>
	<li>Adicione a mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar, coloque a agulha capilar na armadura do equipamento de injeção e ligue o equipamento de injeção. NOTA:A plataforma de injeção usa gás comprimido, como ar, para pulsar o volume desejado (descrito na etapa 6.5) da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no embrião quando ativado.</li>
	<li>Abaixe a agulha capilar para o EM da placa de injeção e quebre a ponta usando pinça para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção.</li>
	<li>Injetar os embriões com um pequeno bolus de 3 nL da mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no corpo celular do embrião. NOTA: Um bolus de 3 nL é um volume de mistura de mRNA/plasmídeo/vermelho de fenol no qual sete bolus podem teoricamente se encaixar igualmente na linha média do embrião.</li>
	<li>Quando terminar de injetar os embriões, remova-os da placa de injeção, retirando-os suavemente da ranhura e transferindo-os para uma placa de Petri de 100 mm com EM fresco (aproximadamente 40 mL) e, em seguida, incube a 28,5 °C para permitir que os embriões se desenvolvam.</li>
</ol>7. Triagem de embriões para inserção transgênica
<ol><li>Para a expressão de proteínas fluorescentes, escolher o estágio de desenvolvimento apropriado em que o transgene fluorescente deve ser expresso e rastrear a presença de fluorescência em um microscópio dissecante fluorescente. OBS: Estes embriões serão mosaicos em sua expressão e apresentarão uma inserção genômica da construção transgênica.</li>
	<li>Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de um marcador transgênico fluorescente (conforme descrito na etapa 7.1), como GFP conduzido pelo promotor cardíaco-específico para o gene cmlc2 ou mCherry impulsionado pelo promotor específico da lente de αcyrstallin, que estão contidos em vetores de destino distintos.</li>
	<li>Permitir que os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolvam completamente até os estágios de peixe-zebra adulto.</li>
	<li>Uma vez que os peixes transgênicos potenciais atinjam a idade de reprodução, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens.</li>
	<li>Os adultos cujos embriões se desenvolvem normalmente e dão a expressão transgênica mais forte e apropriada são mantidos como linhagens únicas de peixes-zebra transgênicos para futuros trabalhos e análises. NOTA: Como uma abordagem alternativa para a triagem para a inserção genômica de construções transgênicas, projete primers de PCR que apenas amplificam a construção transgênica e não o DNA selvagem.</li>
</ol>

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<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença 7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais19,20. Esses pontos...

A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da teratogenicidade do etanol, e os resultados desses sistemas modelo têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em estudos com etanol humano 5,6. Dentre estes, o zebrafish tem emergido como um poderoso modelo para o estudo da teratogênese do etanol7,8, em parte devido à sua fecundação externa, alta fecundidade, tratabilidade genética e embriões translúcidos. Esses pontos fortes se combinam para tornar o peixe-zebra ideal para estudos de imagem ao vivo em tempo real do FASD usando linhas transgênicas de peixe-zebra.
O peixe-zebra transgênico tem sido extensivamente utilizado para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento embrionário9. No entanto, criar construções transgênicas e linhas transgênicas subsequentes pode ser extremamente difícil. Um transgene padrão requer um elemento promotor ativo para conduzir o transgene e um sinal poli A ou "cauda", tudo em um vetor bacteriano estável para manutenção geral do vetor. A geração tradicional de uma construção transgênica multicomponente requer várias etapas demoradas de subclonagem10. Abordagens baseadas em PCR, como a montagem Gibson, podem contornar alguns dos problemas associados à subclonagem. No entanto, primers únicos devem ser projetados e testados para a geração de cada construção transgênica única10. Além da construção de transgenes, a integração genômica, a transmissão germinativa e a triagem para a integração adequada de transgenes também têm sido difíceis. Descrevemos aqui um protocolo para utilização do sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon (Tol2Kit)10,11. Este sistema modular usa clonagem de Gateway multissite para gerar rapidamente várias construções transgênicas a partir de uma biblioteca em constante expansão de vetores de "entrada" e "destino". Os elementos transponíveis integrados Tol2 aumentam consideravelmente a taxa de transgênese, permitindo a rápida construção e integração genômica de múltiplos transgenes. Usando este sistema, mostramos como a geração de uma linhagem de zebrafish transgênico endoderme pode ser usada para estudar os defeitos estruturais tecido-específicos subjacentes ao TEAF. Em última análise, neste protocolo, mostramos que a configuração modular e a construção de construções transgênicas ajudarão muito a pesquisa de FASD baseada em peixe-zebra.

<table><tbody><tr><td>Caixa de ferramentas Addgene Tol2</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ar</td><td></td><td></td><td>Fornecido diretamente pela universidade</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capilar</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Doador Plasmídeo Preparação</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB</td><td>Agar Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Baixo-EEO/Multiuso/Biologia Molecular Grau Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Enzima Clonase II Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td> Sulfato de <td></td></tr><tr><td>Magnésio (Heptahidratado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pipeta porta-Pipeta</td><td>Instrumentação</td><td>Científica Aplicada MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga 0.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 1.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentação Científica Aplicada</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Micropipeta 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Micropipeta 200 &mu; L&nbsp;</td>Kit de Transcrição <td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6</td><td>Planilha de Cálculo Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio vermelho de fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman L p1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman L p200L Gilson</td><td></td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman L p2L</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio (dibásico)</td> <td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Injetor de pressão</td><td>Instrumentação científica aplicada</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio (Dibásico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 &micro; M Sistema de Filtração a Vácuo&nbsp;</td><td>Página Wiki da Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Quimicamente Competentes E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Pipetter Vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinjeção de peixe-zebra</td><td>Ferramentas de Ciência Adaptativa</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

o sistema zebrafish tol2: uma abordagem de transgênese modular e flexível baseada em gateway

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.

Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção transgênica em emb...

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Os peixes-zebra transgênicos têm se mostrado fundamentais para nossa compreensão do desenvolvimento embrionário. O sistema Tol2 é uma ferramenta versátil que permite aos pesquisadores gerar de forma rápida e sistemática múltiplos peixes-zebra transgênicos para estudos de FASD. O design modular e a facilidade de gerar novos componentes do kit tornam o sistema Tol2 uma ferramenta versátil para gerar novos transgênicos sem ter que redesenhar nenhum componente do kit.Meu conselho aos pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez é fazer vários testes para treinar a precisão de gerar e injetar construções transgênicas. Para começar, linearize o plasmídeo do kit Tol2 contendo transposase com uma endonuclease de restrição nought one combinando 10 microlitros de plasmídeo transposase, 1,5 microlitros de tampão de reação de endonuclease de restrição e 0,3 microlitros de endonuclease nought one endonuclease em um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse.Misture e digerir a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, interrompa a digestão adicionando um microlitro de EDTA 0,5 molar, dois microlitros de acetato de amônio cinco molares e 80 microlitros de etanol 100% à mistura de reação. Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, centrifugar e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender a pelota de DNA em água livre de RNAse. Em seguida, determine a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro em um fluorômetro executando dois microlitros da amostra. Configure a produção de mRNA SP6 combinando 10 microlitros de 2X NTP/CAP, dois microlitros de tampão de reação 10X, 0,1 a um micrograma de molde de DNA linear em dois microlitros de mistura enzimática SP6 em um tubo de 500 microlitros.Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse e misture antes de incubar a 37 graus Celsius. Após duas horas, adicione um microlitro de DNAse, misture bem e incube por mais 15 minutos. Pare a reação adicionando 30 microlitros de solução de precipitação de cloreto de lítio.Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugar a solução para pellet do mRNA e aspirar o sobrenadante antes de lavar o pellet com um mililitro de etanol 80%. Seque o pellet ao ar e ressuspenda-o em 20 microlitros de água livre de RNAse.Determine a concentração de mRNA usando um fluorômetro e, em seguida, alíquota 100 nanogramas de mRNA por tubo para uso único e armazene a menos 80 graus Celsius. Para realizar a reação, reunir 10 femtomole cada de P5E, PME e P3E e 20 femtomole do vetor de destino PDEST. Identificar o tamanho de todos os quatro vetores e pares de bases da fonte de plasmídeo.Depois de determinar a concentração de todos os quatro vetores, usando o peso do DNA como 660 gramas por mol e tamanho do plasmídeo e pares de bases, calcule o total de nanogramas de plasmídeo necessários para atingir 10 femtomole para vetores de entrada ou 20 femtomole para vetor de destino. Em seguida, gere o construto sox17:EGFP-CAAX usando os componentes descritos no manuscrito. Usando a concentração plasmidial, calcule o total de microlitros de cada plasmídeo necessário para atingir 10 femtomole ou 20 femtomole e, em seguida, divida isso por dois para o uso nas reações de cinco microlitros de meio LR.Gerar 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) e 20 femtomole do vetor de destino. Configure cinco microlitros de reação meio LR combinando os volumes do P5E, PME, P3E e PDEST em um tubo de 500 microlitros. Em seguida, adicione água estéril para fazer o volume de quatro microlitros.Vórtice a enzima LR misturar duas vezes por um minuto cada antes de adicionar um microlitro à reação e misturar completamente antes de incubar a 25 graus Celsius. No dia seguinte, pare a reação LR adicionando 0,5 microlitros de proteinase K.Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois resfrie até a temperatura ambiente. Em seguida, transforme três a quatro microlitros do plasmídeo em células quimicamente competentes descongeladas, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25 a 30 minutos.Em seguida, choque térmico as células em banho-maria de 42 graus Celsius por 30 segundos. Após o choque térmico, adicione 250 microlitros de meio líquido rico sem antibióticos às células e incube com agitação a 37 graus Celsius por 1,5 horas. Espalhe 300 microlitros de suspensão bacteriana em uma placa de ampicilina Luria-Bertani e incube durante a noite.No dia seguinte, rastreie as colônias para a presença de dois fenótipos: claro e opaco. Escolha as colônias claras, uma de cada vez, inocular a cultura líquida e agite a 37 graus Celsius durante a noite. Combine 150 nanogramas de plasmídeo, 100 nanogramas de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol no gelo.Em seguida, adicione água sem RNA para fazer o volume de três microlitros. Transfira um embrião em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50 a 75 embriões por slot da placa de injeção. Adicione a mistura de vermelho de fenol plasmidial de mRNA à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar.Coloque a agulha capilar na armadura da plataforma de injeção e ligue a plataforma de injeção. Abaixe a agulha para dentro da placa de injeção e quebre a ponta usando pinças para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção. Injetar os embriões com um bolus de três nanolitros da mistura vermelha de fenol plasmidial de mRNA no corpo celular do embrião.Quando terminar, remova os embriões da placa de injeção retirando-os suavemente da ranhura e transfira-os para uma placa de Petri de 100 milímetros com EM fresco. Incubar a 28,5 graus Celsius. Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado para a expressão de transgenes fluorescentes e faça a triagem em um microscópio dissecante fluorescente. Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de marcadores transgênicos fluorescentes, como GFP, impulsionada pelo promotor cardíaco-específico para o gene Cmlc2.Quando os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolverem em adultos e atingirem a idade reprodutiva, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens. Exemplos de colônias bacterianas obtidas a partir da transformação da recombinação LR são mostrados. As colônias claras continham um produto de recombinação LR correto mais de 85% do tempo, enquanto as colônias opacas nunca continham um produto de recombinação correto.A digestão diagnóstica das três colônias a partir da transformação dos produtos da recombinação LR mostrou que a única colônia opaca não continha nenhum plasmídeo, enquanto as duas colônias claras continham uma única banda em 9.544 pares de bases. O mRNA transposase em 1, 950 pares de bases é mostrado aqui. A expressão do EGFP-CAAX no endoderme em mosaico foi observada em 75% dos embriões injetados.A expressão transgênica do EGFP Cmlc2 no coração em desenvolvimento foi observada 24 horas após a fecundação. Zebrafish adultos tiveram transmissão germinativa de embriões fluorescentes gerados por sox17:EGFP-CAAX com a endoderme totalmente marcada com EGFP-CAAX. Tanto o comprimento anteroposterior da endoderme quanto o comprimento dorso-ventral de cada bolsa das bolsas um a cinco foram medidos em embriões mutantes de BMP selvagens do tipo controle e tratados com etanol.O comprimento total da endoderme não foi afetado pelo genótipo ou tratamento. No entanto, as bolsas um e três mostraram aumentos significativos no comprimento da bolsa entre embriões selvagens não tratados e tratados com etanol, mas diminuições significativas no comprimento entre mutantes BMP não tratados e tratados com etanol. A bolsa dois mostrou aumentos significativos no tamanho da bolsa entre os grupos selvagem não tratado e tratado com etanol e mutante BMP, respectivamente.Ao tentar este procedimento, é fundamental ser preciso na pipetagem e diluição do sistema Tol2, bem como atingir o corpo celular durante a injeção do embrião.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

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