Name: Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a cultivar C. elegans isolados em meio sólido com barreira de ácido palmítico para rastreamento longitudinal de vida útil e biomarcadores fluorescentes. Este protocolo permite intervenções aversivas e análise de dinâmica gênica relacionada ao envelhecimento.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH R35GM133588 para G.L.S., uma bolsa de treinamento NIHT32GM008659 para L.E., um Prêmio Catalisador da Academia Nacional de Medicina dos Estados Unidos para G.L.S. e o Fundo de Iniciativa de Tecnologia e Pesquisa do Estado do Arizona administrado pelo Conselho de Regentes do Arizona.

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</ol>

Os autores afirmam não ter conflitos de interesse a divulgar.

Aqui, descrevemos um novo sistema de cultura que adapta microbandejas, originalmente desenvolvido para ensaios de tipagem de tecido de antígenos leucocitários humanos, para permitir o isolamento e caracterização de C. elegans únicos ao longo do tempo em um ambiente de meio sólido que é contextualmente semelhante ao NGM à base de ágar que é o padrão na pesquisa de C. elegans. Esse sistema é compatível com uma variedade de intervenções, incluindo restrição alimentar, tratamento medicamentoso exógeno, des...

C. elegans é um poderoso organismo modelo para pesquisas em genética, biologia celular e biologia molecular, pois são facilmente cultivadas em laboratório, têm curto tempo de geração e vida útil, compartilham alto grau de homologia proteica com mamíferos e possuem estrutura corporal transparente que permite a visualização in vivo de proteínas fluorescentes e corantes1. Como resultado do uso de longa data de C. elegans como um sistema modelo principal em uma variedade de campos, incluindo biologia do desenvolvimento e envelhecimento, seu crescimento e desenvolvimento são bem compreendidos, seu genoma foi totalmente sequenciado e uma série de ferramentas genéticas poderosas foram criadas, incluindo bibliotecas de alimentação de RNAi em todo o genoma e milhares de cepas mutantes e transgênicas. Historicamente, C. elegans são cultivadas como populações em meios de crescimento de nematoides sólidos em ágar (NGM), e os fenótipos são avaliados manualmente por observação direta ou por imagem e análise a jusante. A microscopia fluorescente é usada para capturar uma variedade de fenótipos moleculares usando corantes ou etiquetas fluorescentes transgenicamente expressas em C. elegans individuais. A imagem fluorescente geralmente envolve a fixação ou paralisação de um animal em lâminas contendo almofadas finas de agarose, o que é invasivo e muitas vezes letal. Envolve também o uso de substâncias químicas, como levamisol ou azida sódica, que potencialmente podem interferir no processo molecular de interesse 2,3. Juntas, essas abordagens permitem que dados transversais em nível populacional sejam coletados em uma ampla gama de fenótipos, mas não permitem o rastreamento de animais individuais ao longo do tempo.
Nos últimos anos, várias abordagens têm surgido para cultivar C. elegans isolados, permitindo aos pesquisadores capturar mudanças dinâmicas nos fenótipos fisiológicos e moleculares de animais ao longo do tempo utilizando novas tecnologias de imagem. Uma categoria de abordagem de cultura de C. elegans são os dispositivos microfluídicos, incluindo o WormFarm4, o chip Nemalife5 e o chip 'comportamento' de Chronis et al.6, entre vários outros 7,8,9. Relacionados a estes estão os métodos de cultura em base líquida, que utilizam placas de poços múltiplos para caracterizar vermes individuais ou pequenas populações ao longo do tempo10,11. Sistemas microfluídicos e de microplacas fornecem excelentes medidas quantitativas de respostas fenotípicas em C. elegans até um único animal, mas o ambiente de cultura apresenta uma limitação fundamental. A grande maioria das pesquisas anteriores em C. elegans, particularmente no campo do envelhecimento, foi concluída em meios sólidos baseados em ágar. A cultura líquida faz com que C. elegans nade continuamente e representa um contexto ambiental distinto que pode alterar a biologia subjacente. Por exemplo, animais cultivados em meio líquido alteraram drasticamente o conteúdo de gordura e a expressão gênica — particularmente para genes envolvidos na resposta ao estresse — em relação a animais cultivados em NGM sólida à base de ágar12,13. Uma categoria alternativa de métodos de imagem de um único animal envolve dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que isolam animais individuais em meios sólidos, em um esforço para mimetizar mais de perto o ambiente padrão experimentado por vermes cultivados em NGM sólido em cultura de grupo em placas de Petri. O WorMotel é um dispositivo PDMS de 240 poços projetado para cultivar animais individuais em mídia sólida. Cada poço é preenchido com um NGM modificado usando agarose de baixo derretimento no lugar do ágar e semeado com alimento bacteriano, criando um ambiente de meio sólido semelhante ao sistema de cultura mais comum usando placas de Petri. As paredes do poço são redondas, permitindo que cada animal seja fotografado independentemente da localização no poço (evitando o obscurecimento visual causado por um animal perto de uma parede em uma placa de vários poços). O sulfato de cobre em um fosso estreito ao redor de cada poço é usado como dissuasor para manter os animais em seus poços14,15. Uma limitação dessa abordagem é que o sulfato de cobre é ineficaz para impedir a fuga de vermes quando condições ambientais aversivas estão presentes, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas ou produtos químicos que induzem estresse celular (por exemplo, paraquat).
Um segundo sistema que utiliza meios sólidos é o Worm Corral, que emprega um hidrogel para criar um pequeno ambiente selado para cada verme em uma lâmina, permitindo o monitoramento a longo prazo de animais isolados individualmente16. Uma limitação fundamental é que os animais devem ser selados no ambiente como ovos, exigindo o uso de animais estéreis para evitar a reprodução e limitando os tratamentos medicamentosos a uma única aplicação. Ensaios de drogas multidose podem ser realizados no WorMotel realizando várias rodadas de exposição antes de transferir vermes para o dispositivo ou adicionando topicamente drogas adicionais aos poços durante o experimento; No entanto, neste último caso, a dose de exposição real após a adição de um medicamento adicional a um poço existente é difícil de quantificar com precisão e depende da rapidez com que o medicamento se degrada. Tanto o WorMotel quanto o Worm Corral são excelentes para imagens de campo claro ou campo escuro para capturar informações relacionadas à atividade e fisiologia animal (por exemplo, crescimento e desenvolvimento). Embora esses sistemas possam ser usados para monitorar a fluorescência, em nossa experiência, o PDMS usado para criar as outras tecnologias de imagem de worm único é propenso a formar microbolhas, capturar partículas e outras pequenas anormalidades que geram artefatos fluorescentes irregulares que interferem na visualização e quantificação consistentes de fluorescência, especialmente na faixa de emissão de GFP, o fluoróforo mais comum usado na pesquisa de C. elegans. Até o momento, imagens de fluorescência viva de animais individuais de C. elegans de forma longitudinal dependem principalmente de dispositivos microfluídicos17.
Aqui, descrevemos um novo método para cultivo de C. elegans individuais em meios sólidos que é compatível com intervenções aversivas e imagens fluorescentes diretas. Essa abordagem é semelhante em conceito a outras tecnologias de imagem de worm único, exceto que o chip PDMS moldado sob medida é substituído por microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente originalmente desenvolvidas para ensaios de microcitotoxicidade (também comumente chamadas de bandejas Terasaki)18. Essas microbandejas apresentam poços que podem ser preenchidos com meio sólido e semeados com alimento bacteriano, imitando de perto o ambiente experimentado pelos animais sob a metodologia padrão de cultura sólida NGM. Cada poço é cercado por uma barreira aversiva de ácido palmítico em vez de sulfato de cobre. O ácido palmítico é comumente usado para evitar que vermes fujam de meios sólidos, usando cultura de grupo padrão em placas de Petri em experimentos onde os vermes são desafiados com um ambiente aversivo, como restrição alimentar ou exposição a um estressor químico. As microbandejas também produzem fundo fluorescente mínimo e consistente, permitindo imagens fluorescentes de animais diretamente em seu ambiente de cultura. Este novo sistema de cultura baseado em ágar sólido de animal único não só permite rastrear animais individuais ao longo da vida e monitorar o crescimento, desenvolvimento, atividade e tempo de vida, mas também é compatível com microscopia fluorescente direta. Como os vermes podem ser fotografados sem paralisia ou fixação, biomarcadores de fluorescência in vivo podem ser quantificados longitudinalmente em animais individuais remanescentes em seus meios de cultura, permitindo a observação de mudanças dinâmicas ao longo da vida de cada animal. Esse sistema de cultura também é compatível com sistemas automatizados de geração atual para rastreamento da vida útil e outras métricas de saúde14,19. Nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de C. elegans individuais neste sistema baseado em microbandeja, discutimos possíveis armadilhas e solução de problemas, e discutimos as vantagens e limitações em relação a outros sistemas e, em particular, um protocolo WorMotel atualizado e otimizado15.
Cada ambiente de cultura de worm único consiste em uma microbandeja montada dentro de uma bandeja padrão de poço único usando um adaptador personalizado impresso em 3D (Figura 1A). Os poços são preenchidos com meios de crescimento de nematoides de agarose de baixo derretimento (lmNGM), semeados com bactérias concentradas como fonte de alimento e cercados por um revestimento de ácido palmítico para evitar a fuga de vermes (Figura 1B). O espaço entre a microbandeja e as paredes da placa de poço único é preenchido com cristais de água saturados para manter a umidade (Figura 1B). Um revestimento de detergente é aplicado na tampa da bandeja para evitar a condensação. Um único verme é adicionado a cada poço, e a bandeja de poço único é selada com Parafilm para manter a umidade e permitir a troca de oxigênio. Até seis microbandejas podem ser razoavelmente preparadas em paralelo por um único pesquisador praticante.

<table><tbody><tr><td>Inserções terasaki impressas em 3D</td><td>Empresa de impressão personalizada</td><td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL</td><td>Impressão FDM, tamanho do bico 0,6 mm usando PLA padrão mais filamento</td></tr><tr><td>AirClean sistemas AC624LF capela de fluxo laminar vertical</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-100-4376</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>Thermo Scientific</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 </td><td>Acros organics</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>N2</td><td>Cepa selvagem</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Goldbio</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>101380</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>Alimento padrão de laboratório para C. elegans</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Millipore</td><td>ex0276-4</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>FUdR&nbsp;</td><td>Research Products</td><td>International F10705-1.0</td><td></td></tr><tr><td>Cristais de água hidratantes&nbsp;</td><td>M2 Polymer Technologies</td><td>Tipo</td><td>S Polímero super absorvente Tipo S</td></tr><tr><td>Isopropil &szlig;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>GoldBio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>Toalhetes de tarefa</td></tr><tr><td>LB Caldo, Lennox</td><td>BD Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Câmera monocromática Leica K5 sCMOS</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA Microscópio Estéreo Fluorescente</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td> Research <td>Products International</td><td>A20070-250.0</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M-8900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray Placa de Poço Único</td><td>Thermo Scientific</td><td>264728</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma</td><td>N1538</td><td></td></tr><tr><td>Ácido palmítico</td><td>Acros orgânicos</td><td>129700010</td><td></td></tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td>Coastwide Professional</td><td>365374</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>UV crosslinker</td></tr><tr><td>Bandejas Terasaki (Lambda)</td><td>Uma Lambda</td><td>151431</td><td></td></tr><tr><td>Thermolyne Dri-bath</td><td>Thermolyne</td><td>DB28125</td><td></td></tr><tr><td>Tween&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de longo prazo de caenorhabditis elegans individuais em meio sólido para monitoramento longitudinal de fluorescência e intervenções aversivas

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans são amplamente utilizados para estudar a biologia do envelhecimento. A prática padrão em estudos de envelhecimento de C. elegans é cultivar grupos de vermes em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM), permitindo a coleta eficiente de dados em nível populacional para sobrevivência e outros fenótipos fisiológicos, e amostragem periódica de subpopulações para quantificação de biomarcadores fluorescentes. As limitações dessa abordagem são a incapacidade de (1) acompanhar vermes individuais ao longo do tempo para desenvolver trajetórias etárias para fenótipos de interesse e (2) monitorar biomarcadores fluorescentes diretamente no contexto do ambiente de cultura. Abordagens de cultura alternativa usam cultura líquida ou microfluídica para monitorar animais individuais ao longo do tempo, em alguns casos incluindo quantificação de fluorescência, com a compensação de que o ambiente de cultura é contextualmente distinto do NGM sólido. O WorMotel é um dispositivo multipoço microfabricado previamente descrito para o cultivo de vermes isolados em NGM sólido. Cada verme é mantido em um poço contendo NGM sólido cercado por um fosso preenchido com sulfato de cobre, um repelente de contato para C. elegans, permitindo o monitoramento longitudinal de animais individuais. Achamos o sulfato de cobre insuficiente para evitar que vermes fujam quando submetidos a intervenções aversivas comuns em pesquisas sobre envelhecimento, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas e agentes químicos que induzem estresse celular. Os dispositivos multipoços também são moldados a partir de polidimetilsiloxano, que produz artefatos de alto fundo em imagens de fluorescência. Este protocolo descreve uma nova abordagem para o cultivo de lombrigas isoladas em NGM sólido usando microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente, originalmente projetadas para tipagem de antígenos leucocitários humanos (HLA), permitindo a medição da sobrevivência, fenótipos fisiológicos e fluorescência ao longo da vida. Uma barreira de ácido palmítico impede que os vermes fujam, mesmo na presença de condições aversivas. Cada placa pode cultivar até 96 animais e se adapta facilmente a uma variedade de condições, incluindo restrição alimentar, RNAi e aditivos químicos, e é compatível com sistemas automatizados para coletar dados de vida útil e atividade.

O ambiente de cultura de worm único baseado em microbandeja descrito aqui pode ser usado para monitorar uma variedade de fenótipos, incluindo expectativa de vida e tempo de saúde, atividade e movimento, forma do corpo e geometria de rastejamento, e a expressão de biomarcadores fluorescentes transgenicamente expressos em animais individuais ao longo do tempo. O sistema de cultura de microbandejas é compatível com a análise da vida útil por meio de pontuação manual ou coleta de imagens e análise de imagens a jusante. Tal c...

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura de isolados de nematoides individuais em meio sólido para rastreamento de parâmetros fisiológicos ao longo da vida e quantificação de fluorescência. Este sistema de cultura inclui uma barreira de ácido palmítico ao redor de poços de verme único para evitar a fuga de animais, permitindo o uso de intervenções aversivas, incluindo bactérias patogênicas e estressores químicos.

Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Embora existam outros métodos de cultura sólida, este é o primeiro sistema de cultura sólida que permite o rastreamento longitudinal automatizado da vida e saúde animal individual e imagens longitudinais de biomarcadores fluorescentes em um sistema. Este protocolo fornece resultados comparáveis aos experimentos padrão de C.elegans em NGM sólido é compatível com intervenções aversivas e imagens diretas de fluorescência ao vivo. Este sistema será inestimável para a pesquisa do envelhecimento, especialmente no que diz respeito à exposição a longo prazo a estressores ambientais e à observação da dinâmica de genes e proteínas por longos períodos.Evitar a contaminação e obter secagem consistente nos poços são ambos um desafio. Destacamos pontos-chave no protocolo escrito para minimizar essas questões. Para começar, triture 500 miligramas de ácido palmítico sólido em uma argamassa e pilão.Combine-o com 15 mililitros de TWEEN 20 num frasco cónico de 50 mililitros e misture por vórtice para dissolver os cristais. Adicione 17,5 mililitros de etanol a 100% e agite a solução para dissolver o máximo possível de ácido palmítico. Em seguida, adicione 17,5 mililitros de água ultrapura e vórtice vigorosamente.Aqueça suavemente a solução num banho de contas a 80 graus Celsius até que o ácido palmítico se dissolva completamente. Reaqueça o banho de contas a 80 graus Celsius. Imediatamente antes de usar, aliquote um mililitro da solução de trabalho de ácido palmítico por Microbandeja em um recipiente estéril separado e adicione quatro microlitros de nistatina por um mililitro de solução de ácido palmítico antes de aquecer.Agora borrife dentro e fora da Microbandeja com etanol até a saturação e sacuda o excesso de etanol. Para esterilizar a Microbandeja, coloque a placa e a tampa separadamente no reticulante UV. Após 20 minutos, vire o prato e a tampa.Em seguida, coloque o frasco cônico de 15 mililitros com a solução de trabalho de ácido palmítico no banho de contas e deixe que os cristais visíveis se dissolvam completamente antes de usar. Aqueça a Microbandeja colocando-a na borda ao redor do banho de contas com as tampas ligadas por dois minutos. Remova a tampa da Microbandeja e adicione lentamente 200 microlitros de solução de trabalho de ácido palmítico na parede traseira da Microbandeja.Substitua as tampas e deixe a Microbandeja descansar no banho de contas por dois a três minutos para permitir que a solução de ácido palmítico se acomode no fundo da Microbandeja. Gire a microbandeja 180 graus e adicione a solução de trabalho de ácido palmítico conforme demonstrado anteriormente. Prepare o lmNGM adicionando os componentes descritos no manuscrito.Em seguida, pipetar 20 microlitros de lmNGM em cada Microbandeja colocada na bancada. Certifique-se de cobrir a Microbandeja ao reabastecer a pipeta para minimizar a contaminação. Para semear os poços Microtray com alimentos bacterianos, centrifugar uma cultura cultivada durante a noite a 3.500 G por 20 minutos.Remover o sobrenadante e ressuspender a cultura bacteriana em uma concentração dez vezes maior com solução de cloreto de sódio 85 milimolar. Em seguida, pipete cuidadosamente cinco microlitros de cultura bacteriana concentrada dez vezes na superfície do lmNGM em cada poço. Evite permitir que a cultura de bactérias passe pelo lado do poço e entre no ácido palmítico, pois isso atrairá vermes para deixar o poço.Coloque a pastilha estéril impressa em 3D em uma placa estéril de poço único. Coloque a Microbandeja no adaptador impresso em 3D na placa de poço único. Distribua generosamente cristais de água sobre a pastilha impressa em 3D entre o poço externo da Microbandeja e a parede interna da placa de poço único.Se os worms não estiverem sendo adicionados imediatamente, sele a Microbandeja para usar no dia seguinte. Feche a tampa da bandeja e use um único pedaço de Parafilm para envolver todos os quatro lados para selar a Microbandeja. Repita a etapa de vedação com Parafilm mais duas vezes para três camadas.Adicione um verme por poço assim que eles atingirem o estágio de vida desejado. Adicione 40 microlitros de solução de detergente à tampa de um único prato de poço único e use um lenço de limpeza para revestir a tampa uniformemente. Use lenços de limpeza de tarefa adicionais para espalhar a solução de detergente até que a visão através da tampa não seja distorcida.Estique levemente o primeiro pedaço de Parafilm para cobrir dois lados da bandeja. Limpe a parte superior da bandeja com um limpador de tarefas e umedeça-a com etanol 70% para remover as impressões digitais. Meça o tempo de vida batendo suavemente na lateral ou na parte superior da placa, ou brilhando uma luz azul brilhante na placa e observando cada animal.Marcar um animal morto se ele não se mover dentro de alguns segundos. Repita esta tarefa a cada um ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Realizar imagens fluorescentes em poços individuais.A exposição ao sulfato de cobre e ao ditiotreitol reduziu significativamente a vida útil e o tempo de saúde do verme. Em contraste, o sulfato de cobre diminuiu a proporção de vida gasta em boa saúde, enquanto o ditiotreitol não. O sulfato de cobre reduziu a atividade média entre os indivíduos dentro da população em maior extensão do que o ditiotreitol em todas as idades.A média populacional da área animal individual sob a curva de atividade ao longo da vida é substancialmente prejudicada pelo sulfato de cobre ou ditiotreitol. A atividade cumulativa para animais individuais até o dia 10 correlaciona-se com sua expectativa de vida para animais desafiados com ditiotreitol, mas não para controles não tratados ou animais desafiados com sulfato de cobre. Um aumento drástico na expressão de KYNU-1 é observado entre os dias três e oito da idade adulta, e há um declínio progressivo com a idade após isso.A expressão cumulativa de KYNU-1 mScarlet até o 14º dia da idade adulta correlaciona-se com a expectativa de vida dos animais. Como a expressão de KYNU-1 é dinâmica ao longo de toda a vida, comparamos a expressão de KYNU-1 em diferentes idades com a sobrevivência global em animais individuais. Em nenhum momento a expressão de KYNU-1 se correlacionou significativamente com a sobrevida.Ao tentar este procedimento, os passos mais importantes são a adição do ácido palmítico, pipetagem do ágar e introdução dos vermes. Esta técnica permite o rastreamento longitudinal da expectativa de vida e da saúde, bem como biomarcadores fluorescentes em vermes individuais de uma forma que é diretamente comparável aos ensaios de NGM.

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Biologia

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