Name: Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprenda a preparar suspensão de célula única do intestino de tilápia do Nilo usando dissociação enzimática com mistura de colagenase-dispase. Este protocolo eficiente facilita estudos de sequenciamento em espécies de aquicultura.

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Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (NO. 320QN211) e do Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Controle de Doenças de Animais Aquáticos e Cultura Saudável da China (NO. PBEA2021ZD01).

Todos os protocolos em animais durante este estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hainan (número do protocolo: HNUAUCC-2022-00063; Data de aprovação: 03/03/2022). Uma lista dos equipamentos e insumos utilizados neste experimento pode ser encontrada na Tabela de Materiais. Um resumo do protocolo atual é ilustrado na Figura 1.
1. Preparo do peixe
<ol><li>Obter tilápia do Nilo com 6 meses de idade com peso corporal médio de 100 g de fonte confiável. Selecione peixes que estejam livres de quaisquer sinais de doença.</li>
	<li>Pare de alimentar os peixes 24 h antes de prosseguir para a próxima etapa. OBS: O jejum de peixes reduz o volume do conteúdo intestinal e facilita o preparo dos segmentos intestinais.</li>
	<li>Enxágue o peixe em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas na superfície corporal.</li>
	<li>Eutanasiar os peixes com 300 mg/L de metanossulfonato de tricaína (MS-222) por cerca de 10 min até que todo o movimento pare.</li>
</ol>2. Preparação dos reagentes
<ol><li>Preparar solução salina tamponada com fosfato BSA-Dulbecco a 0,08% (BSA-DPBS, para lavagem e resussão celular). Dissolver 0,08 g de BSA (0,8% p/v) em 100 mL de 1x DPBS. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado. NOTA: A adição de BSA é benéfica para minimizar a aglomeração celular. A razão BSA pode ser aumentada de 0,04% para 1% de acordo com as condições de aglomeração celular.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação enzimática celular.<ol><li>Diluir a colagenase/dispase com 1x PBS até uma concentração final de 1 mg/mL (0,1 U/mL colagenase e 0,8 U/mL dispase). Certifique-se de que o PBS e não o DPBS sejam usados. NOTA: PBS fornece os íons de cálcio necessários para que a enzima funcione corretamente. DPBS não deve ser usado nesta etapa porque é Ca 2+/Mg2+ livre. Além disso, a colagenase tipo I é utilizada no protocolo atual.</li>
		<li>Filtrar a diluição através de um filtro de membrana estéril de 0,22 μm.</li>
		<li>Preparar um reagente de dissociação celular composto por um volume de 95% de solução de colagenase/dispase e um volume de 5% de soro fetal bovino (SFB). NOTA: O reagente de dissociação deve ser renovado sempre que for utilizado. Usando 5% FBS ajuda a manter a viabilidade celular durante a digestão.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a solução de azul de tripano.<ol><li>Tome a solução de azul de tripano do frigorífico a 4 °C e mantenha-a a 15-20 °C durante alguns minutos antes de utilizar para evitar precipitação.</li>
		<li>Filtrar a solução através de uma membrana estéril de 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação do equipamento
<ol><li>Pré-resfriar a centrífuga refrigerada a 4 °C antes de usar.</li>
	<li>Obter tubos de centrífuga estéreis de 1,5 mL sem RNase, tubos cônicos de 50 mL, pipetas e pontas de vidro de furo largo, filtros de membrana, filtros de células e todos os tubos e pontas de baixa retenção.</li>
	<li>Pipetas de vidro de autoclave e ferramentas de dissecção, incluindo pinças, tesouras e bisturis, e pré-tratá-las com a solução de remoção de RNase para prevenir os efeitos adversos da RNase para RNA-seq de célula única.</li>
</ol>4. Dissecção tecidual e dissociação celular
<ol><li>Coloque o peixe eutanasiado no gelo para dissecção. Assepticamente, colete 3-4 cm da seção média do intestino e excise o máximo de gordura e mesentério possível. Remova cuidadosamente a gordura aderida à superfície intestinal e a camada de mucosa clara elástica e maleável com pinças. NOTA: A gordura e o mesentério estão ligados à superfície externa do intestino.</li>
	<li>Remova o máximo de gordura possível para evitar seus efeitos adversos no protocolo de dissociação. Usando uma seringa, lave suavemente os fragmentos com PBS gelado estéril várias vezes para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Evite manuseio áspero.</li>
	<li>Disseque o segmento do intestino em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mL preenchido com 1 mL de PBS gelado.</li>
	<li>Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante delicadamente e substitua por 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado. Ressuspender os fragmentos de tecido por aspiração suave usando uma pipeta de vidro. Repita esta etapa duas vezes.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e digerir os fragmentos de tecido usando 1 mL do reagente de dissociação enzimática (950 μL de solução de colagenase/dispase e 50 μL de SFB) em banho-maria a 37 °C por 30-60 min.<ol><li>Além disso, adicionar 5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL na solução reserva) ao reagente de dissociação se as amostras estiverem preparadas para o sequenciamento de RNA de célula única. NOTA: A concentração final da mistura colagenase/dispase é de 1 mg/mL, incluindo colagenase a 0,1 U/mL e dispase a 0,8 U/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Inverta manualmente o tubo em intervalos de 5 min durante o banho de água de 30-60 min. NOTA: O tempo exato de incubação varia de acordo com os tecidos utilizados. Verifique o progresso da dissociação sob um microscópio até que nenhum tecido volumoso seja visto. Coloque 10 μL da suspensão celular em uma lâmina de vidro com uma pipeta e examine-a ao microscópio. Aumente o tempo de digestão se as células não estiverem completamente dissociadas.</li>
	<li>Gire os tubos a 300 × g por 5 min a 4 °C e remova suavemente o reagente de dissociação enzimática celular usando pontas largas. Adicione 1 mL de BSA-DPBS 0,08% gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo usando uma pipeta de vidro de furo largo por 1 min.<ol><li>Repita esta etapa duas vezes. NOTA: A pipetagem para cima e para baixo deve ser realizada com cuidado usando pontas de furo largo e baixa retenção para evitar a ruptura celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-umedeça um filtro celular de 40 μm com BSA-DPBS a 0,08% e coloque-o em um tubo cônico de 50 mL. Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata e enxágue com um DPBS adicional de 200 μL e recolha a suspensão no fundo do tubo.</li>
	<li>Transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de DNase I (1 U/μL) e incubar durante 15 min a 15-20 °C. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet de células em 400 μL de DPBS gelado (Ca 2+/Mg2+ livre). Pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células. Repita esta etapa duas vezes.</li>
</ol>5. Coloração e exame microscópico
<ol><li>Para a coloração, misturar a suspensão celular com solução de azul de tripano a 0,4% na proporção de 1:1. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 5-10 μL da mistura em um hemocitômetro e examine ao microscópio. NOTA: As células viáveis terão citoplasma não corado, enquanto as células mortas terão um citoplasma azul (Figura 2).</li>
	<li>Conte as células viáveis e mortas em três campos diferentes sob o microscópio. Calcule a porcentagem de viabilidade celular dividindo o número de células viáveis pelo número total de células em um campo. NOTA: A viabilidade celular deve ser superior a 85% e a concentração celular não deve ser inferior a 1 x 105-1 x 107/mL. O fundo da suspensão celular deve estar limpo, sem aglomerações, fragmentos ou impurezas.</li>
</ol>

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<li>Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+dissociation+protocol+for+generation+of+single+cell+suspension+from+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae.</a> MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).</li>
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<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo. Antes da dissociação, a remoção de gordura e mesentério do intestino é necessária, particularmente para intestinos de peixes carnívoros com muita gordura. Usar uma seringa em vez de raspagem dura para lavar o conteúdo intestinal reduz os danos mecânicos às células. Para garantir a viabilidade celular, também é essencial manter a temperatura em 20 °C ou abaixo para as etapas de dissecção e enxágue do tecido....

As células são as unidades fundamentais dos organismos. Comparados a estudos de tecidos volumosos, estudos em nível de célula única podem refletir a heterogeneidade celular e fornecer informações de maior resolução1. Nos últimos anos, pesquisadores têm aplicado tecnologias de sequenciamento unicelular para estudos genômicos, transcriptomas, epigenomas ou multi-ômicos em nível unicelular em mamíferos, peixes-zebra e outros organismos modelo e relatado grandes avanços 2,3,4,5,6,7 . Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em organismos-modelo, há poucos protocolos de referência ou kits comerciais de dissociação para sequenciamento unicelular em espécies econômicas de peixes, o que limita a aplicação do sequenciamento unicelular em pesquisas aquícolas. Portanto, o desenvolvimento de protocolos de dissociação tecidual que produzam suspensões unicelulares de alta qualidade com alta viabilidade celular e integridade de ácidos nucleicos é crucial.
A otimização do protocolo de dissociação tecidual com a combinação enzimática ou enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. A enzima mais eficaz para a dissociação tecidual varia de acordo com o tipo de tecido. Em mamíferos, várias enzimas têm sido utilizadas para preparar suspensões unicelulares para tecidos sólidos de mamíferos, incluindo colagenase, dispase, tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, liberase, accutase e tripLE 8,9. A digestão de tripsina combinada com ruptura mecânica tem sido comumente utilizada para dissociar tecidos para cultura celular em peixes 10,11,12,13,14. A tripsina também tem sido usada ou adicionada ao coquetel de digestão para dissociação tecidual no intestino de ratos15 e tecido branquial de peixe-zebra16. No entanto, por várias razões, a tripsina não é a melhor opção para o sequenciamento unicelular. A tripsina isolada é geralmente ineficaz para a dissociação tecidual. Adicionalmente, a tripsina induz quebras de fitas de DNA 17,18 e degradação de RNA19.
A papaína degrada as proteínas que compõem as tight junctions entre as células. Em células nervosas e musculares lisas de mamíferos, a papaína é mais eficiente e menos destrutiva que outras proteases20,21. Entretanto, assim como a tripsina, a papaína resulta na agregação celular induzida pelo DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática9. A elastase decompõe a elastina, que é tipicamente encontrada na pele, pulmões, ligamentos, tendões e tecidos vasculares22. É frequentemente usado em combinação com colagenase, dispase ou tripsina para dissociar o tecido pulmonar8. A hialuronidase cliva as ligações glicosídicas do hialuronano, contribuindo para a digestão da matriz extracelular em vários tecidos conjuntivos e pele 9,23.
Em geral, colagenase e dispase são boas opções para a quebra da matriz extracelular. Eles têm sido utilizados na dissociação dos intestinos de humanos, camundongos e peixes-zebra24,25,26,27. A colagenase destrói a ligação peptídica no colágeno, promove a digestão da matriz extracelular e libera as células em suspensão, e, assim, a colagenase é frequentemente utilizada para dissociação de tecidos sólidos humanos e de camundongos, inclusive para o fígado 28,29, baço30, pâncreas31 e intestino 25. Dispase é uma protease que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos apolares e é mais suave que a colagenase. Cliva os componentes da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo IV e, em menor grau, colágeno tipo I, sem afetar as junções célula-célula. Dispase é usado separadamente ou com outras enzimas para dissociação tecidual, como intestino25,32, cérebro33, fígado34, etc. Além disso, coquetéis de digestão comercialmente disponíveis, incluindo liberase, accutase e triple, também são boas alternativas para a dissociação de tecidos sólidos, especialmente para pele, fígado e rins 8,9.
A tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pertence à família Cichlidae da ordem Perciformes. É uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em áreas tropicais e subtropicais, com uma produção anual de 4,5 milhões de toneladas em 202235. É uma das espécies de peixes de aquicultura mais bem estudadas com um genoma bem anotado. A tilápia-do-nilo é um modelo de pesquisa ideal para espécies de peixes aquícolas devido ao seu curto tempo de geração, facilidade de criação e adaptabilidade a uma ampla gama de ambientes de criação. O intestino é de grande interesse de pesquisa, pois é o órgão da digestão e absorção da nutrição, metabolismo e imunidade das mucosas. O intestino é o habitat das populações microbianas e é um tecido imune essencial36. É imunologicamente ativo devido à presença de numerosos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, células B, granulócitos e células T.
No presente estudo, desenvolvemos um protocolo para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível unicelular em espécies de peixes de aquicultura. De acordo com as características dessas enzimas tecido-específicas e trabalhos preliminares, a colagenase/dispase é apropriada para dissociar o tecido intestinal da tilápia. O último tipo enzimático a ser considerado no preparo de suspensões unicelulares é a DNase-I, que impede a agregação celular degradando o DNA livre liberado pela lise de células mortas durante a digestão enzimática sem iniciar vias apoptóticas9 e aumenta o rendimento de células vivas36. Além disso, a albumina de soro bovino (BSA) é adicionada ao tampão de lavagem para reduzir a aglomeração celular e melhorar a viabilidade celular. Várias empresas de reagentes descrevem a BSA como um estabilizador enzimático. A adição de BSA 0,04%-1% ao PBS (phosphate-buffered saline) tem sido utilizada para desenvolver uma solução de lavagem para o preparo de suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. A adição de uma baixa proporção de BSA poderia ajudar a manter a viabilidade celular e evitar a agregação livre induzida por DNA de células devido à lise celular. Este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular do intestino de outras espécies de peixes de aquicultura.

<table><tbody><tr><td>0.22-&mu; m Filtro estéril</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SLGV033RB</td><td>É usado para filtrar e esterilizar a solução enzimática.</td></tr><tr><td>40-&mu; m Filtro de Células</td> O Filtro de Células <td>F8200</td> da <td>Solarbio Life Sciences</td><td>é aplicado para eliminar pedaços de tecido não digeridos.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0098</td><td>Powder; diluir 0,04 g BSA com 100 mL 1 &vezes; DPBS para preparar 0,04% BSA-DPBS lavagem bffer. Armazene a 2 - 8 °C.</td></tr><tr><td>Colagenase II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>Colagenase/dispase</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td><td>Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>Dilua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>com PBS até uma concentração final de 1 mg / mL.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNase I ajuda a reduzir a aglomeração celular.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco, Ca2+/Mg2+-free</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td><td>Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600438</td><td>Diluir com PBS até uma concentração final de 0,5 mg/mL.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Serum, utilizado em volume de 5% em solução de desinfecção.</td></tr><tr><td>Invertido&nbsp; Microscópio</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>É usado para examinar a viabilidade celular.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Diluir com PBS até uma concentração final de 0,25 mg / mL.</td></tr><tr><td>Tilpia do Nilo (Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td><td>NA</td><td>Peixes saudáveis sem sinais de doença (Peso corporal médio: 100 g).&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Centrífuga Refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>É usada para girar o tecido e o peteto celular.</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>Inibir a atividade da RNase</td></tr><tr><td>Reagente RNase-Be-Gone de fase sólida</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>É usado para remover a RNase de ferramentas como tesouras de dissecação e pipetas de vidro. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Para eutanásia de peixes.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>É usado para colorir células mortas.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607001</td><td>Diluir com PBS até uma concentração final de 1 mg / mL.</td></tr></tbody></table>

preparação de suspensão de célula Única do intestino de tilápia do nilo para sequenciamento de célula Única

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

A tilápia-do-nilo é uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em todo o mundo e é um modelo de pesquisa amplamente utilizado para estudos de peixes de aquicultura. A preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade é essencial para estudos em nível de célula única, como RNA de célula única ou sequenciamento genômico. No entanto, não existe um protocolo pronto para uso para espécies de peixes de aquicultura, particularmente para o intestino da tilápia. As enzimas de dissociação efetivas variam dependendo do tipo de tecido. Portanto, otimizar o protocolo de dissociação tecidual selecionando a enzima ou combinação enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. Este estudo ilustra um protocolo otimizado para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo com uma combinação enzimática de colagenase/dispase. Esta combinação é altamente eficaz para dissociação com a utilização de albumina de soro bovino e DNase para reduzir a agregação celular após a digestão. A produção celular satisfaz os requisitos para sequenciamento unicelular, com 90% de viabilidade celular e alta concentração celular. Este protocolo também pode ser modificado para preparar uma suspensão unicelular do intestino de outras espécies de peixes. Esta pesquisa fornece um protocolo de referência eficiente e reduz a necessidade de ensaios adicionais na preparação de suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia-do-nilo para sequenciamento unicelular (Figura 1). Esta pesquisa mostra que a mistura colagenase/dispase tem um bom efeito de dissociação e é leve para o tecido intestinal. A seleção da enzima de digestão ideal é essencial para preparar uma suspensão de célula única de alta qualidade. No trabalho preliminar, as eficiências de dissociação de várias enzimas comumente usadas foram comparad...

Aqui, demonstramos a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia para sequenciamento unicelular.

Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Este protocolo fornece uma referência confiável para a preparação de uma suspensão de célula única de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura. A tecnologia é altamente eficiente e pode ser implementada na maioria das condições de laboratório. Reduz a necessidade de ensaios adicionais para preparar suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.Comece enxaguando peixes de tilápia do Nilo de seis meses de idade em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas da superfície. Para preparar o reagente de dissociação enzimática celular, diluir a colagenase dispase em PBS até uma concentração final de um miligrama por mililitro. Misturar 95% do volume da solução enzimática preparada e 5% do volume de FBS.Em seguida, pré-resfriou a centrífuga a quatro graus Celsius antes de usar. Para a dissecção do tecido, colocar os peixes eutanasiados no gelo e coletar de três a quatro centímetros da seção média dos intestinos. Excique a gordura e o mesentério usando fórceps.Remova a gordura aderida à superfície intestinal e a mucosa clara elástica e maleável. Lave suavemente o fragmento do intestino com PBS gelado estéril usando uma seringa para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Após várias lavagens, disseque o fragmento em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS gelado.Centrifugar a mistura a 300 x g em quatro graus Celsius durante cinco minutos. E substitua o sobrenadante por um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado. Usando uma pipeta de vidro aspirar suavemente para ressuspender os fragmentos de tecido.Depois de lavar as peças mais uma vez, retire o sobrenadante e adicione um mililitro do reagente de dissociação enzimática preparado. Misturar também cinco microlitros de inibidor de RNAs com o reagente de dissociação para sequenciamento de RNA de célula única. Coloque o tubo em banho-maria temperado a 37 graus Celsius e inverta manualmente o tubo a cada cinco minutos durante o tempo de incubação de 30 a 60 minutos.Uma vez que os tubos são girados, remova o reagente de dissociação enzimática da célula usando pontas largas. Adicione um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo para evitar a ruptura celular. Após a centrifusão e ressuspensão das células mais uma vez, coloque o filtro de células de 40 micrômetros pré-molhado com 0,08% de BSA-DPBS em um tubo cônico de 50 mililitros.Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata no coador, depois enxágue-o com 200 microlitros DPBS e recolha a suspensão no fundo do tubo. Depois de transferir a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro, adicione cinco microlitros de DNA e incube a suspensão por 15 minutos a 15 a 20 graus Celsius.Uma vez centrifugado, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de DPBS gelada sem íons cálcio e magnésio. Em seguida, pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células e repetir esse processo mais uma vez. Para a coloração, misturar a suspensão celular em solução de azul de tripano a 0,4% em igual proporção e incubar por três minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura na lâmina de vidro. Contar as células viáveis e mortas ao microscópio em três campos e calcular a porcentagem de viabilidade celular. As eficiências de dissociação de várias enzimas comumente utilizadas foram comparadas.Verificou-se que a mistura de colagenase dispase tem um melhor efeito de dissociação do que a colagenase dispase ou tripsina isoladamente e várias outras misturas enzimáticas. O exame microscópico mostrou que as células intestinais tinham alta viabilidade e dispersas como células únicas. A maioria das células era viável, enquanto algumas foram coradas mortas devido à permeablização da membrana celular.Preste atenção ao tipo de PBS usado. A solução de digestão enzimática não pode ser usada com PBS livre de cálcio/magnésio, pois a enzima requer íons cálcio/magnésio para funcionar de forma eficaz. O procedimento facilita estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura, fornecendo uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular de espécies de peixes de aquicultura.

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Research

JoVE Journal

Biology

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