Name: Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a usar o ensaio verde de malaquita para descobrir inibidores da proteína Hsp90 em pesquisa contra o câncer. Este método simples e sensível permite triagem de alto rendimento de compostos inibidores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pelo programa Korea Research Fellowship (KRF), pós-doutorado da National Research Foundation of Korea (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência e ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Os autores agradecem à subvenção intramuros KIST e à subvenção número 2MRB130 do Ministério dos Oceanos e Pescas por fornecerem assistência financeira para este projeto.

1. Ensaio verde de malaquita em escala de laboratório
<ol><li>Preparação do tampão de ensaio<ol><li>Preparar o tampão de ensaio, de acordo com a composição e preparação apresentadas na Tabela 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de padrões de fosfato<ol><li>Utilizar o padrão de fosfato de 1 mM, fornecido no kit de ensaio de fosfato verde de malaquita (armazenado a 4 °C).</li>
		<li>Pipetar 40 μL de fosfato padrão 1 mM em 960 μL de água ultrapura para obter 40 μM de solução de fosfato (solução de pré-mistura). Adicionar a solução de pré-mistura com água ultrapura, de acordo com as instruções do fabricante, para formar uma diluição em série de fosfato de 0 a 40 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo da levedura Hsp90<ol><li>Use a levedura Hsp90 com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.</li>
		<li>Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 para atividade ATPase mensurável. Verifique se a diferença de densidade óptica após a adição do reagente verde de malaquita entre o branco e o controle positivo é de pelo menos 0,5 e inferior a 1,0. Aqui, a diferença de absorbância entre o branco (sem Hsp90) e o controle positivo (com Hsp90) foi de 0,510.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de ATP<ol><li>Transferir 1 mg de ATP para um frasco para injetáveis contendo 453,39 μL de água ultrapura para obter 4 mM de solução-mãe. Realizar cálculos de peso com base no ATP anidro (peso molecular [m.p.] = 551,14). Prepare o ATP fresco, pois ele pode hidrolisar espontaneamente com o tempo.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de solução-mãe de ATP a cada poço para obter uma concentração final do poço de 0,2 mM (volume total final do poço de ensaio de 80 μL). Adicione ATP como último componente à reação, usando uma pipeta multicanal para que todas as reações comecem simultaneamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de geldanamicina (GA)<ol><li>Preparar um estoque de 10 mM de GA dissolvendo 1 mg em 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando a solução-mãe, preparar soluções de 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM em DMSO por diluição seriada.</li>
		<li>Adicionar 2 μL dessas soluções-estoque a cada poço para obter uma concentração final de 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, respectivamente.</li>
		<li>Preparar os poços conforme descrito na Tabela 2 e Tabela 3, sendo que os poços contêm o controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Os poços contendo GA (Hsp90 em tampão + água + GA) servem como controle positivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de placas de poço e ordem de adição<ol><li>Prepare placas de 96 poços com o layout apresentado na Tabela 2. Para compostos que apresentam absorbância a 620 nm, prepare um poço separado para registrar a absorbância neste comprimento de onda. Não prepare um poço separado para GA, pois o GA não mostra absorbância a 620 nm para a concentração utilizada no ensaio.</li>
		<li>Preparar cada constituinte com o volume total de cada constituinte, conforme apresentado na Tabela 3.</li>
		<li>Configure poços de ensaio adicionando água ultrapura a cada poço. Em seguida, adicione a quantidade necessária de tampão de ensaio e uma solução composta (por exemplo, solução de GA).</li>
		<li>Em seguida, adicione Hsp90 aos poços apropriados e agite as placas por 2 min em um agitador de placas à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de solução de ATP utilizando uma pipeta multicanal. Embrulhe a placa em papel alumínio e agite por 2 min em um agitador de placas (200 rpm) à temperatura ambiente. Incubar a placa a 37 °C durante 3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação e adição de reagente verde de malaquita<ol><li>O reagente verde de malaquita é composto pelos reagentes A (molibdato de amônio em HCl 3M) e B (verde de malaquita e álcool polivinílico). Levar o reagente à temperatura ambiente antes de utilizar. Misturar os reagentes A e B na proporção de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare em até 3 h antes do uso, pois é instável e começa a se decompor após 3 h.</li>
		<li>Após 3 h do passo 1.6.5, parar a reação adicionando 20 μL de reagente verde de malaquita, adicionado na mesma ordem do ATP, usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, medir a absorbância da placa a 620 nm em um leitor de placas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Triagem de alto rendimento de inibidores de Hsp90 pelo ensaio verde de malaquita
NOTA: O protocolo para triagem de alto rendimento é semelhante à metodologia em escala de laboratório. O volume final do poço em cada caso é de 80 μL. No entanto, há uma pequena diferença na ordem de adição dos reagentes. No método baseado em escala de laboratório, há cinco estágios de adição da solução (34 μL de água, 32 μL de tampão, 2 μL de composto em DMSO, 8 μL de Hsp90 e, finalmente, 4 μL de solução de ATP). Em contraste, com HTS há três estágios de adição (40 μL de solução tampão contendo levedura Hsp90, 2 μL de DMSO em 18 μL de água contendo os compostos e, finalmente, 20 μL de ATP dissolvido em água). A quantidade mínima de solução que pode ser pipetada com precisão na configuração HTS é de 20 μL. Assim, observa-se uma diferença na pipetagem entre as escalas de laboratório e HTS.
<ol><li>Preparação do tampão de ensaio (pH 7,4)<ol><li>Use o mesmo tampão no HTS que para o ensaio verde de malaquita em escala laboratorial (Tabela 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo da levedura Hsp90<ol><li>Use proteína com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.</li>
		<li>Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 em cada poço, o que fornece atividade ATPase mensurável.</li>
		<li>Diluir a proteína (8 μL) em tampão (32 μL) para cada poço. O volume total de trabalho final para cada poço é de 40 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de 0,8 mM ATP<ol><li>Dissolver 1 mg de ATP em 2.267 μL de água destilada para obter uma solução de 0,8 mM. O volume total de trabalho para cada poço é de 20 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de geldanamicina (GA)/compostos de ensaio<ol><li>Prepare um estoque de 0,8 mM de GA no DMSO, como na etapa 1.5. Diluir 10 μL do estoque de GA com 90 μL de água para obter uma concentração final de 80 μM.</li>
		<li>Utilizar 20 μL da solução de 80 μM de GA em poços de ensaio apropriados (volume total final do poço de ensaio = 80 μL), obtendo-se uma concentração final do poço de 20 μM. Isso serve como um controle positivo.</li>
		<li>Para compostos de teste, preparar soluções em DMSO de acordo com sua concentração desejada para avaliação.</li>
		<li>Preparar 10 μL de DMSO em 90 μL de água para adição em poços de controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Preparar os compostos de ensaio de forma semelhante a uma concentração final de poço de 100 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Projeto de placas de ensaio e ordem de adição<ol><li>Utilizar quatro placas principais, uma placa composta e quatro placas de adição contendo estoques de reagentes para montar o ensaio (Figura 2 e Tabela 4).</li>
		<li>Além disso, placa A, adicionar 90 μL de tampão de ensaio em cada poço; além da placa B, adicionar 90 μL de tampão com Hsp90 em cada poço; além das placas C e D, adicionar 90 μL de ATP e 90 μL de reagente verde de malaquita, respectivamente, em cada poço (Tabela 5 e Tabela 6).</li>
		<li>Da placa de adição A e da placa B, transferir 40 μL de solução de cada poço para as placas principais 1 e 2, e 3 e 4, respectivamente, usando um sistema de dosagem multicanal automatizado. Utilizou-se a estação de trabalho de automação laboratorial Biomek(R) FXP (Figura 2 e Tabela 6).</li>
		<li>De cada poço da placa composta, transferir 20 μL da solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).</li>
		<li>De cada poço da placa de adição C (ATP), transferir 20 μL de solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).</li>
		<li>Incubar as placas durante 3 h a 37 °C.</li>
		<li>Preparar o reagente verde de malaquita de acordo com o passo 1.7. Após 3 h, transferir 20 μL do reagente verde de malaquita da placa de adição D para os poços das placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2).</li>
		<li>Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, meça a absorvância da placa a 620 nm em um leitor de placas.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Não há interesses financeiros concorrentes.

Hsp90 é um alvo significativo para a descoberta de novas moléculas de drogas anticancerígenas. Desde que sua farmacogabilidade foi estabelecida em 199410, 18 moléculas chegaram a ser experimentadas clinicamente. Atualmente, sete moléculas estão em várias fases de ensaios clínicos, isoladamente ou em combinação22. Todas essas pequenas moléculas são inibidores de ligação do ATP N-terminal. Os outros meios de inibir a chaperona (inibidores C-terminais, inibidores do domínio mé...

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp901. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estado livre e nãocomplexado 2,3. Nos últimos anos, vários inibidores de Hsp90 demonstraram possuir efeitos senolíticos em estudos in vitro e in vivo, onde melhoraram significativamente o tempo de vida de camundongos 4,5,6. Todos os achados acima corroboram o fato de que os inibidores de Hsp90 poderiam ser efetivos em múltiplos tipos de câncer, com menos efeitos adversos e menores chances de desenvolver resistência. A função de chaperoning da Hsp90 é realizada ligando-se ao ATP no domínio N-terminal da Hsp90 e hidrolisando-o em ADP e fosfato livre7. Pequenas moléculas que se ligam competitivamente à bolsa de ligação de ATP de Hsp90 foram encontradas para suprimir com sucesso o efeito de chaperoning da proteína. Até o momento, essa continua sendo a melhor estratégia para a inibição da Hsp90, o que é apoiado pelo fato de tais inibidores terem chegado a ensaios clínicos8. Um deles, o Pimitespib, foi aprovado no Japão para o tratamento do tumor estromal gastrointestinal (GIST) em junho de 20229. Este é o primeiro inibidor de Hsp90 aprovado desde que a farmacogabilidade da chaperona foi estabelecida em 199410.
O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico, adequado para automação e triagem de alto rendimento (HTS) de compostos contra seu alvo desejado11. O ensaio foi empregado com sucesso para a triagem de inibidores de Hsp90 em pequenos montamentos em escala laboratorial, bem como em uma HTS 12,13,14,15,16,17. O ensaio utiliza um método colorimétrico que determina o fosfato inorgânico livre formado devido à atividade ATPase da Hsp90. A base dessa quantificação é a formação de um complexo fosfomolibdato entre fosfato livre e molibdênio, que posteriormente reage com o verde malaquita para gerar uma cor verde (Figura 1). Essa rápida formação de cor é medida em espectrofotômetro, ou em leitor de placas, entre 600-660 nm18,19.
No presente protocolo, descreve-se o procedimento para a realização do ensaio verde de malaquita com a levedura Hsp90 e posterior identificação de inibidores contra a chaperona. A molécula do produto natural, geldanamicina (GA), com a qual a farmacogabilidade da Hsp90 foi estabelecida pela primeira vez, foi tomada como um inibidor autêntico10. A HTS tornou-se parte integrante do atual programa de descoberta de fármacos, devido à disponibilidade de um grande número de moléculas para testes. Essa técnica ganhou mais importância nos últimos 2 anos devido à necessidade urgente de reaproveitamento de medicamentos para o tratamento da infecção por Covid-1920,21. Portanto, um esboço detalhado para a HTS de moléculas contra a proteína Hsp90 da levedura adotando o método de ensaio verde de malaquita é apresentado.

<table><tbody><tr><td>Solução de cloreto de magnésio 1M em água</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de potássio 1M em água</td> Placa de 96 poços <td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPL Life Sciences</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sal dissódico hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX laboratório estação de trabalho de automação</td><td>Beckman Coulter</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Compostos 3-96</td><td>Não aplicável</td><td>Não aplicável</td> A <td>levedura Hsp90 marcada com histidina foi obtida do Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Reino Unido, e a proteína foi expressa no KIST Gangneung Institute of Natural Products. Os detalhes não podem ser divulgados devido a problemas de violação de patente.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamicina, 99% (HPLC), pó</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Água Destilada</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita Green Phosphate Assay&nbsp; Kit de ensaio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multidetecção Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Leitor multiplacas Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr> Solução <tr><td>tampão de cloridrato de Trizma, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Hsp90</td><td>Não aplicável</td><td>Não aplicável Escola</td><td>de Ciências da Vida, Universidade de Sussex, Reino Unido e a proteína foi expressa no KIST Gangneung Institute of Natural Products. Número de acesso primário: P02829</td></tr></tbody></table>

ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é um alvo anticâncer promissor devido ao seu efeito de chaperoning sobre múltiplas proteínas oncogênicas. A atividade da Hsp90 é dependente de sua capacidade de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato livre. A atividade ATPase da Hsp90 está ligada à sua função de chaperoning; ATP liga-se ao domínio N-terminal do Hsp90, e interromper sua ligação foi encontrado para ser a estratégia mais bem sucedida na supressão da função Hsp90. A atividade da ATPase pode ser medida por um ensaio colorimétrico verde de malaquita, que determina a quantidade de fosfato livre formado pela hidrólise de ATP. Aqui, um procedimento para determinar a atividade ATPase da levedura Hsp90 usando o kit de ensaio de fosfato verde de malaquita é descrito. Além disso, instruções detalhadas para a descoberta de inibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como um inibidor autêntico é fornecida. Finalmente, a aplicação deste protocolo de ensaio através da triagem de alto rendimento (HTS) de moléculas inibidoras contra a levedura Hsp90 é discutida.

Os resultados do ensaio são interpretados em termos de absorbância devido à concentração livre do íon fosfato. A absorbância por fosfato livre devido à hidrólise de ATP pela levedura Hsp90 a 620 nm é considerada como 100% de atividade da ATPase, ou zero porcentagem de inibição proteica. A inibição da proteína leva à cessação da hidrólise de ATP (menos fosfato livre). o que se reflete em termos de diminuição da absorbância a 620 nm.
Resultados do ensaio verde de malaquita em escala labo...

O protocolo de ensaio verde de malaquita é um método simples e econômico para descobrir supressores de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), bem como outros compostos inibidores contra enzimas dependentes de ATP.

Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Este protocolo auxiliará na determinação da atividade das proteínas ATPase através da mensuração do fosfato livre resultante da hidrólise do ATP pelas proteínas. O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico. É adequado para automação e triagem de alto rendimento de compostos contra seu alvo.Esta técnica desempenhará um papel importante na rápida descoberta de inibidores contra a proteína Hsp90, que é um importante alvo anticâncer. Para começar, pipetar 40 microlitros de fosfato padrão de um milimolar em 960 microlitros de água ultrapura para obter solução de fosfato de 40 micromolares. Adicione esta solução de acordo com as instruções do fabricante para formar uma diluição em série de fosfato de 0 a 40 micromolares.Em seguida, use oito microlitros de levedura Hsp90 para atividade ATPase mensurável. Adicionar o reagente verde de malaquita ao branco e ao controlo positivo e verificar se a diferença de densidade óptica entre o branco e o controlo positivo após a adição for pelo menos 0,5 e inferior a 1. Para preparar ATP, transfira um miligrama de ATP para um frasco contendo 453,39 microlitros de água ultrapura para obter a solução-estoque de quatro milimolares.Prepare o ATP fresco, pois ele pode hidrolisar espontaneamente com o tempo. Adicione quatro microlitros de solução estoque de ATP a cada poço para obter uma concentração final do poço de 0,2 milimolar. Adicione ATP como o último componente à reação usando uma pipeta multicanal para que todas as reações comecem simultaneamente.Em seguida, prepare um estoque de 10 milimolares de geldanamicina dissolvendo um miligrama em 178,37 microlitros de DMSO. Usando a solução reserva, prepare soluções de 4 milimolares, 0,8 milimolares, 0,16 milimolares, 0,032 milimolares, 0,0064 milimolares e 0,00128 milimolares em DMSO por diluição seriada. Adicione dois microlitros dessas soluções-estoque a cada poço para obter uma concentração final de 0,1-milimolar, 0,02-milimolar, 0,04-milimolar, 0,0008-milimolar, 0,00016-milimolar e 0,000032-milimolar.Em seguida, prepare os poços juntamente com os poços contendo o controle branco e negativo. Os poços contendo geldanamicina servem como controle positivo. Prepare as placas de 96 poços e prepare um poço separado para os compostos que mostram absorbância em 620 nanômetros para registrar a absorbância neste comprimento de onda.Não mostre um poço separado para geldanamicina, pois a geldanamicina não mostra absorbância a 620 nanômetros para a concentração usada neste ensaio. Configure poços de ensaio adicionando água ultrapura a cada poço. Em seguida, adicione a quantidade necessária de tampão de ensaio e uma solução composta, como solução de geldanamicina.Adicione Hsp90 aos poços apropriados e agite as placas por dois minutos em um agitador de placas à temperatura ambiente. Adicione quatro microlitros de solução ATP usando uma pipeta multicanal. Embrulhe a placa em papel alumínio e agite por dois minutos em um agitador de placas à temperatura ambiente a 200 rpm.Incubar a placa a 37 graus Celsius por três horas. Pare a reação adicionando 20 microlitros de reagente verde de malaquita na mesma ordem do ATP usando uma pipeta multicanal e incube por 15 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, meça a absorbância da placa a 620 nanômetros em um leitor de placas.Além da placa A, adicione 90 microlitros de tampão de ensaio em cada poço. Além da placa B, adicione 90 microlitros de tampão com Hsp90 em cada poço. Além da placa C, adicione 90 microlitros de ATP, e além disso a placa D adicione 90 microlitros de reagente verde de malaquita em cada poço.Use um sistema de dosagem multicanal automatizado para transferir 40 microlitros de solução de cada poço da placa de adição A para as placas principais um e dois, e da placa B para a placa principal três e quatro. Transfira 20 microlitros da solução de cada poço da placa composta para as placas principais um, placas principais dois, placas principais três e placas principais quatro. Agite as placas por um minuto em um agitador a 200 rpm.Transfira 20 microlitros da solução de cada poço das placas de adição C para as placas principais um, dois, três e quatro. Agite as placas por um minuto em um agitador a 200 rpm. Incubar as placas a 37 graus Celsius por três horas e, em seguida, transferir 20 microlitros de reagente verde de malaquita da placa de adição D para os poços das placas principais um, dois, três e quatro.Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, meça a absorbância da placa a 620 nanômetros em um leitor de placas. A estrutura do verde de malaquita e as reações do reagente A do verde de malaquita com fosfato livre e a reação subsequente com o reagente B são mostradas aqui. Um gráfico padrão para a concentração padrão de fosfato está representado nesta figura.Aqui, o eixo x representa a concentração livre de fosfato ou pi em micromolares, e a absorbância em 620 nanômetros é representada no eixo y. As barras de erro representam o desvio entre os dois números de amostra. A porcentagem de atividade da ATPase é usada para medir a inibição dose-dependente da proteína pela geldanamicina.Observou-se que a geldanamicina inibiu a proteína de forma dose-dependente com um valor de IC50 de 0,85 micromolar. Aqui, cada ponto é uma média de duas determinações. O desenvolvimento da cor na placa principal um após a adição do agente verde malaquita é mostrado nesta imagem.A cor rosa no poço A11 é devido à cor composta. Da mesma forma, o desenvolvimento da cor na placa principal dois é mostrado aqui. A cor rosa no poço A11 é devido à natureza colorida do composto.O desenvolvimento da cor após a adição do reagente verde malaquita na placa principal três e na placa principal quatro é mostrado aqui. A adição de ATP e reagente verde de malaquita no mesmo intervalo de tempo a cada poço é uma coisa importante a lembrar ao tentar este procedimento.

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.

Ensaio redobrando intracelular

Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é...

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Neste vídeo, demonstramos o ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado - um ensaio de proximidade baseado em esferas. Ele utiliza grânulos aceptores e doadores de tamanho homogêneo, imobilizados com duas proteínas que tendem a interagir para rastrear pequenas moléculas potenciais que inibem as interações proteicas.

Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificada: um ensaio de proximidade baseado em esferas para rastrear pequenas moléculas que inibem as interações proteína-proteína

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

A capacidade de avaliar o engajamento de alvos por inibidores candidatos em células intactas é crucial para a descoberta de drogas. Este protocolo descreve um ensaio de mudança térmica celular de formato 384 que detecta de forma confiável o engajamento de alvos celulares de inibidores visando shp2 tipo selvagem ou suas variantes oncogênicas.

Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

SAMHD1 é um desoxinucleosídeo trifosfato trifosfohidrolase com papéis críticos na saúde humana e na doença. Aqui apresentamos um versátil ensaio de atividade SAMHD1 acoplado à enzima, implantado em um formato de microplaca de 384 poços, que permite a avaliação de pequenas moléculas e análogos de nucleotídeos como substratos, ativadores e inibidores de SAMHD1.

Um ensaio de atividade enzimática acoplada de alto rendimento para sondar a interação de pequenas moléculas com a dNTPase SAMHD1

Este protocolo apresenta uma técnica para sondar interações proteína-proteína usando contas doadoras ligadas à glutationa com co-acompanhantes e contas aceitadoras de TPR fundidas gst-fused e contas aceitadoras juntamente com um peptídeo derivado de Hsp90. Usamos essa técnica para rastrear pequenas moléculas para interromper as interações de interação Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos de interação Hsp90-FKBP51.

Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

Esse protocolo introduz uma metodologia de triagem fluorométrica otimizada para identificar inibidores naturais de produtos e pequenas moléculas na síntese de proteínas. Sua praticidade o torna adequado tanto para o ensino de graduação em técnicas de descoberta de fármacos quanto para a implementação em campanhas de química medicinal.

Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aprenda a usar o ensaio verde de malaquita para descobrir inibidores da proteína Hsp90 em pesquisa contra o câncer. Este método simples e sensível permite triagem de alto rendimento de compostos inibidores.

Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

Explorar mais vídeos