Análise e imagem de osteócitos

Postula-se que a tensão de cisalhamento do fluxo de fluido seja um estimulador mecânico dos osteócitos. Como a medição direta não é uma opção, os modelos derivados de imagens confocais de osteócitos são uma ferramenta valiosa para a realização de análises computacionais de dinâmica de fluidos para avaliar as tensões absolutas do fluxo de fluido nas membranas dendríticas dos osteócitos. Alguns dos trabalhos realizados em nosso laboratório correspondem aos desenvolvimentos recentes no campo onde a morfologia real das lacunas dos osteócitos, incluindo a tortuosidade e a densidade dos dendritos, são usadas junto com a rede óssea e lacunar-canalicular para determinar numericamente a tensão de cisalhamento do fluxo de fluido e os locais na estrutura dendrítica dos osteócitos onde a tensão é alta.

As tecnologias atuais incluem várias modelagens computacionais, como análise de elementos finais, dinâmica de fluidos computacional, interação de estrutura de fluidos, modelagem baseada em imagem, incluindo raios-X ou microscópio confocal para modelos 3D precisos e por sistemas de teste mecânico para validar os modelos medindo respostas ósseas, como deformações sob condições de carga controlada. Nossos achados indicam que a perda de dendritos devido ao envelhecimento ou doença óssea é um fator para que os ossos se tornem menos responsivos à atividade física. Previmos que os osteócitos detectam cargas mecânicas por meio de regiões de tensão de cisalhamento de alto fluxo de fluido, que são dendritos.

E a tensão de cisalhamento do fluxo de fluido está correlacionada à morfologia lacunar, especialmente a área de superfície. Com o estabelecimento deste protocolo, estamos agora trabalhando em um projeto do NIH para estudar a tensão de cisalhamento do fluxo de fluido nos dendritos de osteócitos de ossos de camundongos de duas idades e sexos diferentes. Este estudo ajudará a determinar como o envelhecimento e as diferenças sexuais afetam a transdução de mecano no osso devido à carga.

Para começar, fixe o fêmur coletado do camundongo em paraformaldeído frio a 4% em solução salina tamponada com fosfato por 24 horas a quatro graus Celsius com um balanço suave. No dia seguinte, enxágue o osso e a solução salina tamponada com fosfato e incorpore-a rapidamente em um acrílico de polimerização rápida. Corte fatias transversais grossas de 300 micrômetros acima do terceiro trocanter.

Usando uma lixa, polir as seções ósseas até uma espessura final de 90 a 100 micrômetros. Em seguida, enxágue as seções polidas em etanol 70% 95% e 100% por cinco minutos cada. Manchar as seções em 1% de ajuste C em etanol 100% por quatro horas no escuro com agitação moderada.

Em seguida, lave bem as seções em etanol 100%. E seque-os ao ar durante a noite antes de colocá-los em uma gota de mídia de montagem em uma lâmina de vidro. Monte uma lamínula na amostra.

Em um microscópio confocal, defina um laser de 488 nanômetros para excitação e uma janela de coleta de emissão de 496 a 596 nanômetros. Primeiro, capture uma imagem de baixa potência de toda a seção óssea usando a objetiva 5x. Em seguida, capture imagens das três regiões de interesse usando a objetiva 20x.

Use uma objetiva de óleo de abertura numérica de 100x 1,44 com um zoom digital de 1,7 e um tamanho de passo de 0,126 micrômetros para coletar pilhas Z detalhadas de 400 planos Z com resolução de 1024 por 1024 pixels e 0,089 micrômetros de pixel. Para modelagem computacional de osteócitos de camundongos, abra o software ImageJ após importar as imagens coletadas da pilha Z do fêmur do camundongo no formato TIFF, ajuste o limite no menu da seção para alterar os limites de intensidade de pixel para inclusão em uma máscara. Usando a operação de máscara de corte, corte uma lacuna com seus canalículos como a região de interesse.

Encerre a lacuna em um cubo imaginário maior com comprimentos laterais de 21, 14 e 19 micrômetros. Execute uma operação de crescimento de região para selecionar as regiões de pixel conectadas para gerar uma rede lacunar-canalicular uniforme ou LCN. Em seguida, usando a operação de peça calculada, converta a máscara lacunar-canalicular em um objeto.

Reduza o volume do LCN usando a operação de alisamento para construir as membranas osteócitas e dendríticas. Em seguida, exporte os objetos. Combine duas superfícies do LCN e das membranas dendríticas dos osteócitos em uma superfície.

Agora, use a operação de remalha para criar um modelo volumétrico do espaço canalicular lacunar. Exporte o modelo como um arquivo STL e ajuste a escala do objeto para micrômetros. Em um software de processamento tridimensional baseado em imagem, escolha o modelo volumétrico do espaço lacunar-canalicular do camundongo como modelo base para construir modelos distintos de osteócitos.

Selecione um limite inferior para reduzir a intensidade da luz da imagem e obter uma lacuna com menos canalículos. Em seguida, desenvolva modelos de osteócitos com diferentes espessuras de espaço lacunar-canalicular ou diâmetros canaliculares dendríticos. Construa modelos de osteócitos maiores ou menores usando operações de envolvimento ou suavização, respectivamente.

Para criar um fluxo de fluido no software de simulação, importe as geometrias baseadas em imagens confocais desenvolvidas para o software CFX. Defina as dimensões da unidade para nanômetros. Em seguida, clique em subtrair para obter um único corpo de espaço canicular lacunar.

Clique com o botão direito do mouse na faceta gerada e converta-a de facetas em um domínio sólido sem mesclar faces. Clique na malha e selecione elementos tetraédricos lineares com um tamanho de elemento de 0,06 micrômetros. Refine a malha com um estudo de convergência de malha.

Agora, selecione a superfície e escolha os canalículos na parte superior do cubo imaginário como entradas de fluido. Usando a caixa, escolha os canalículos nas outras cinco faces como saídas de fluido. Em seguida, exporte a malha.

Depois de criar outro fluxo de fluido, importe a malha fluente para a seção de configuração do CFX. Usando a opção de limite de inserção, defina duas condições de limite de entradas e saídas para as faces. Exerça uma pressão de entrada de fluido de 300 e zero pascals nas entradas e saídas, respectivamente.

Trate as superfícies restantes como paredes com uma condição antiderrapante. Na biblioteca de materiais, trate o fluido laminar intersticial como água. Defina as seções de transferência de calor, combustão e radiação térmica como nenhuma.

Selecione a turbulência como a característica do fluido no LCN. Em seguida, execute o software usando precisão dupla e início direto como o tipo de envio. Insira um novo contorno na seção de resultados do software CFD.

Crie uma tensão de cisalhamento de fluxo de fluido ou contorno FFSS escolhendo o cisalhamento da parede nas membranas dendríticas dos osteócitos como a variável no domínio. Em seguida, insira um contorno de velocidade aerodinâmica dentro do domínio lacunar-canalicular a partir das entradas. O FFSS médio em osteócitos e membranas dendríticas no modelo de osteócitos jovens foi de 0,42 Pascal, que foi significativamente maior do que 0,13 Pascal no modelo de osteócitos envelhecidos.

O FFSS aumentou em osteócitos com maior espaço canalicular lacunar, como visto no modelo sete e no modelo oito, onde o modelo oito exibiu o maior FFSS. Os menores valores de FFSS de 0,19 Pascal e 0,13 Pascal foram observados no modelo dois e no modelo quatro, respectivamente, com a menor densidade canalicular. Nenhuma mudança significativa no FFSS foi observada com o aumento do diâmetro do dendrito, como visto nos modelos cinco e seis.