Name: Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a gerar esferoides hepáticos humanos autólogos a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta técnica supera a escassez de hepatócitos primários e aplica-se à toxicologia, descoberta de fármacos e medicina regenerativa.

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Os autores são especialmente gratos pela assistência técnica prestada por Oksana e John Greenacre. Este trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.

Obteve-se aprovação ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para a realização desses experimentos e o termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado por todos os doadores antes da extração do sangue, em conformidade com as diretrizes institucionais.
1. Preparação de células mononucleares (MNCs) a partir do sangue periférico humano (PB)
<ol><li>Extraia 30 mL de sangue de doadores saudáveis com a ajuda de pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.</li>
	<li>Isolar PBMNCs utilizando meios de gradiente de densidade de acordo com o protocolo publicado por Becker-Kojić et al.13. Isolar, por pipetagem, a camada interfásica entre o plasma e os meios de gradiente de densidade e usar solução salina tampão fosfato estéril (PBS) para lavar as células isoladas.</li>
	<li>Use uma câmara de contagem e conte o número de células usando métodos padrão.</li>
</ol>2. Desdiferenciação das multins após a ativação com glicoproteína humana ancorada no GPI
<ol><li>Colocar 6 x 106 células mononucleares em PBS/1% de albumina sérica bovina (BSA) em tubo de poliestireno (15 mL) e incubar com o anticorpo específico por 30 min a 37 °C de acordo com Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Centrifugar as células a 300 x g à temperatura ambiente e substituir PBS/BSA pelo meio Dulbecco modificado de Iscove suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).</li>
	<li>Cultivar as células em tubos de poliestireno de 15 mL em incubadora de CO2 a 5% a 37 °C por 8-10 dias, conforme descrito em Becker-Kojić et al.13. No dia 5 (D5), adicione 1-2 mL de meio de Iscove suplementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.</li>
</ol>3. Classificação de células desdiferenciadas recém-geradas
<ol><li>Centrífuga de suspensão celular cultivada à temperatura ambiente por 10 min a 300 x g e aspirar com pipeta estéril o sobrenadante resultante de acordo com Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Ressuspender o pellet obtido por centrifugação em 90 μL de tampão PBS frio (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA e EDTA 2 mM) e adicionar 10 μL de esferas magnéticas de tamanho nanométrico CD45 positivo e incubar no gelo por 15 min.</li>
	<li>Lavar a suspensão celular com 2 ml de tampão PBS, centrifugar-a a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente e adicionar 500 μL de tampão PBS às células e ressuspender completamente.</li>
	<li>Pipetar 500 μL de tampão PBS pré-resfriado na coluna para lavá-lo e colocá-lo no campo magnético usando um suporte magnético.</li>
	<li>Lavar as células colocadas na coluna, duas vezes com 500 μL de tampão PBS e recolher o fluxo contendo células CD45 negativas no meio de Iscove suplementado com 10% de FBS.</li>
	<li>Use uma câmara de contagem para determinar o número de células reprogramadas.</li>
</ol>4. Preparação de coberturas de vidro para a geração de hepatócitos humanos
<ol><li>Separe as tampas de vidro (14 mm) e incube-as em detergente não iônico por 10 min. Lavar as lâminas de vidro em água deionizada até que não restem bolhas e incubá-las em HCl 1M por 30 min (adaptado de Marchenko et al.14).</li>
	<li>Lave as tampas de vidro com água deionizada pelo menos 3x e seque-as durante a noite à temperatura ambiente. Tampas de vidro secas em autoclave em um recipiente adequado.</li>
</ol>5. Revestimento de placas de cultura celular com biolaminina para diferenciação hepática 2D de BD-PSCs
<ol><li>Coloque as tampas de vidro autoclavadas com um par estéril de pinças em 4 placas de poço e acenda as luzes UV por 30 minutos para garantir condições estéreis.</li>
	<li>Descongele as alíquotas de biolaminina e adicione 120 μL de 5 μg/mL de biolaminina a cada folha de tampa de vidro. Deixar as tampas de vidro revestidas durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Remova o excesso de biolaminina e adicione 200 μL de meio de diferenciação de hepatócitos, conforme descrito abaixo.</li>
</ol>6. Preparação dos meios de diferenciação dos hepatócitos
<ol><li>Fazer 500 mL de meio de reposição sérica knockout de hepatoblasto (KSR)/dimetilsulfóxido (DMSO) consistindo de 76,4% de DMEM KNOCKOUT (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamina, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 0,1% de β-mercaptoetanol, 1% de DMSO e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strepto).</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de maturação de hepatócitos contendo 1% de L-glutamina, 10 μM de sal de sódio de hidrocortisona 21-hemisuccinato (CHC) e 1% de Pen/Strep.</li>
	<li>Aliquotar o meio do estoque e adicionar fator de crescimento de hepatócitos frescos (HGF) e oncostatina M (OSM) em concentrações finais de 10 ng/mL e/ou 20 ng/mL para cada mudança de meio. NOTA: A oncostatina M é uma citocina pertencente ao grupo de citocinas interleucina 6, importante para a hematopoiese, bem como para o desenvolvimento hepático.</li>
</ol>7. Cultivo de células hepáticas diferenciadas de BD-PSCs
<ol><li>Coloque 3 x 105 células BD-PSCS em cada poço de uma placa de 4 poços revestida com biolaminina.</li>
	<li>Colocar as placas de 4 poços na incubadora a 37 °C e a 5% de CO2. Cultive as células por 5 dias em meio hepatoblástico KSR/DMSO que suporta a diferenciação endodérmica e altere o meio a cada dois dias.</li>
	<li>Mudar para o meio de maturação dos hepatócitos no dia 5 e cultivar as células durante mais 7-10 dias na incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Mude o meio a cada 48 h.</li>
</ol>8.3D diferenciação hepática esferoide
<ol><li>Conte células usando uma câmara de contagem.</li>
	<li>Centrífuga de suspensão de células desdiferenciadas BD a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células BD-desdiferenciadas em meio KSR/DMSO a 2 x 106 células/mL.</li>
	<li>Passe as células através de um filtro celular de 40 μm para garantir uma suspensão de célula única e remover quaisquer detritos adicionais.</li>
	<li>Conte as células usando uma câmara de contagem e prepare um volume suficiente para cada densidade de semeadura celular, a fim de dispensar o volume necessário por poço. Prepare um gradiente com semeadura superior de 1 x 106 células para uma baixa densidade de semeadura de 4000 células.</li>
	<li>Dispensar 100 μL de meio KSR/DMSO em 96 placas de fixação bem baixas e adicionar 100 μL de diluição de semeadura celular.</li>
	<li>Coloque a placa de fixação baixa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 e cultive-a por 5 dias.</li>
	<li>Altere 50% do meio dos dias 3-4 após a semeadura, quando os esferoides estiverem suficientemente compactos.</li>
	<li>No dia 5, mude o meio para o meio de maturação dos hepatócitos e cultive as células por mais 7-10 dias para uma maturação adicional. Mude o meio a cada dois dias.</li>
</ol>9. Análise de imunofluorescência de culturas de células hepáticas 2D recém-geradas
<ol><li>Cultive as células de acordo com o método de diferenciação descrito acima por 4, 8, 15 e 24 dias e remova os meios.</li>
	<li>Incubar células com fixador pré-aquecido constituído por paraformaldeído a 4% em PBS por 10 min. Descarte o fixador e lave as células 2x com PBS por 5 min cada. Adicione imediatamente a solução de tritão X-100 a 0,1% e permeabilize as células por 5 min. Lave 2x com PBS.</li>
	<li>Adicione a solução de bloqueio feita de PBS e BSA a 5% e coloque na placa do balancim por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir anticorpos primários em tampão de diluição 1% BSA/PBS da seguinte forma: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteína (AFP) 1:250, citoqueratina 18 (CK18) 1:50, fator nuclear de hepatócitos 4 alfa (HNF4α) 1:1000 e transtirretina (TTR) 1:50. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço.</li>
	<li>Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, descarte a solução de anticorpos, lave as células por 5 minutos e repita a etapa de lavagem 3x.</li>
	<li>Prepare os seguintes anticorpos secundários em tampão de diluição: IgG anti-frango de coelho (vermelho Texas) 1:1000, IgG anti-rato de cabra (488) 1:1000 e anti-coelho de cabra (488) 1:500. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço e incube as células por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células 3x com PBS por 5 min cada e monte as tampas com meios de montagem contendo DAPI para análise microscópica.</li>
</ol>10. Coloração viva de esferoides hepáticos recém-formados
<ol><li>Descarte cuidadosamente os meios de cultura sem tocar nos esferoides, adicione PBS recém-feito com solução de tritão X-100 a 0,1% e incube por 5 minutos para permeabilizar as células.</li>
	<li>Lave os esferoides com o meio pipetando lentamente por 5 min, repita 2x.</li>
	<li>Incubar os esferoides com os anticorpos primários ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) e CYP3A4 (1:200) preparados em PBS com 1% de BSA por 1 h em 5% de CO2 incubadora a 37 °C. Use 50 μL de diluição de anticorpos por poço.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o excesso de solução de anticorpos e lave os esferoides com meio 3x.</li>
	<li>Preparar os anticorpos secundários correspondentes IgG anti-rato de cabra (Cy3), IgG de cabra anti-rato (488) e IgG de coelho anti-frango (Texas red) numa diluição de 1:1000 e 1:500 para cabra anti-coelho (488) em PBS em 1% de BSA. Utilizar 50 μL de diluição de anticorpos por alvéolo e incubar durante 20 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Lave cuidadosamente 3x com meio e deixe a placa por 30 min na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 antes de realizar a microscopia de fluorescência.</li>
</ol>11. Exame de esferoides usando um microscópio de fluorescência
<ol><li>Ligue a fonte de luz de fluorescência 10 minutos antes do uso, ligue o computador e abra o software de imagem.</li>
	<li>Use um objetivo com ampliação de 4x, clique no botão 4x na barra de ferramentas para selecionar a barra de escala correta e, em seguida, coloque a placa de 96 poços na placa central do palco.</li>
	<li>Ligue a fonte de luz LED, use o filtro de campo brilhante e posicione a placa no poço de interesse usando o botão de ajuste de estágio do eixo x-y.</li>
	<li>Mude para o caminho da luz da câmera, clique no botão Viva no software de imagem para visualizar a imagem na tela e verifique se o esferoide está centralizado usando os botões do eixo x-y e o foco usando o botão de foco grosso/fino. NOTA: A forma dos esferoides permanece constante após a aplicação de coloração ao vivo.</li>
	<li>Escolha o método de Observação de campo brilhante na barra de ferramentas, coloque as configurações de exposição como automáticas e clique no botão Instantâneo no painel de controle da câmera para tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como arquivo .vsi usando o nome apropriado na pasta de interesse.</li>
	<li>Coloque a placa de proteção da luz ambiente para desligar a luz LED, mude para filtrar a excitação B, escolha o método de observação 488 na barra de ferramentas, abra o obturador, tire uma foto clicando no botão Instantâneo, feche o obturador e salve o arquivo conforme descrito acima.</li>
	<li>Repita isso com um filtro para excitação G usando o método de observação apropriado (vermelho Texas ou CY3). Em seguida, reitere todo o procedimento para cada poço de interesse.</li>
	<li>Devolver a placa à incubadora de CO2 a 5% a 37 °C e cultivá-la conforme descrito acima.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620(2019).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li>
<li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signalling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhanna%2C+S+%22Animal+Biotechnology+%28Second+Edition%29%22">Animal Biotechnology (Second Edition)</a>. , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+stem+cells+into+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).</li>
<li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-fetoprotein%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li>
<li>Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transthyretin+in+cell+biology%3A+impact+on+human+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+2021%22%5BJournal%5D)">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li>
<li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li>
<li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li>
<li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).</li>
<li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects%3A+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li>
<li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li>
<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+liver+diseases+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li>
<li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).</li>
</ol>

A autora correspondente declara que ela é uma detentora de patente relacionada à nova proteína humana ligada ao GPI. Ela co-fundou e trabalha com a ACA CELL Biotech GmbH. Os demais autores declaram não haver conflitos de interesse.

O fígado é um órgão importante no corpo humano com muitas funções biológicas essenciais, como a desintoxicação de metabólitos. Devido a falhas hepáticas graves, como cirrose e / ou hepatite viral, há quase 2 milhões de mortes por ano em todo o mundo. Os transplantes hepáticos ocupam o segundo lugar em transplantes de órgãos sólidos em todo o mundo, mas apenas cerca de 10% da necessidade atual é atendida22.
Hepatócitos humanos primários (PHH) são frequentemente utilizado...

Nos últimos anos, os sistemas de cultura esferoides tridimensionais (3D) tornaram-se uma ferramenta importante para estudar várias áreas de pesquisa sobre o câncer, descoberta de medicamentos e toxicologia. Tais culturas despertam grande interesse porque preenchem a lacuna entre as monocamadas de cultura celular bidimensional (2D) e os órgãos complexos1.
Na ausência de uma superfície adesiva, em comparação com a cultura de células 2D, a formação de esferoides é baseada na afinidade natural dessas células para se agruparem na forma 3D. Essas células se organizam em grupos que consistem em um ou mais tipos de células maduras. Livres de materiais estranhos, essas células interagem umas com as outras como em seu microambiente original. As células em cultura 3D são muito mais próximas e têm uma orientação adequada entre si, com maior produção de matriz extracelular do que as culturas 2D, e constituem um ambiente próximo ao natural 2.
Modelos animais têm sido utilizados há muito tempo para estudar a biologia humana e doenças3. A este respeito, existem diferenças intrínsecas entre humanos e animais, o que torna esses modelos não inteiramente adequados para estudos extrapolativos. Os esferoides e organoides de cultura 3D representam uma ferramenta promissora para estudar a arquitetura, a interação e o crosstalk semelhantes a tecidos entre diferentes tipos de células que ocorrem in vivo e podem contribuir para reduzir ou mesmo substituir modelos animais. Eles são de particular interesse para o estudo da patogênese das doenças hepáticas, bem como das plataformas de triagem de medicamentos4.
A cultura esferoide 3D é de particular importância para a pesquisa do câncer, pois pode eliminar a descontinuidade entre as células e seu ambiente, reduzindo a necessidade de tripsinização ou tratamento com colagenase necessário para preparar as monocamadas de células tumorais para culturas 2D. Os esferoides tumorais permitem o estudo de como as células normais versus malignas recebem e respondem aos sinais de seus arredores5 e são uma parte importante dos estudos de biologia tumoral.
Em comparação com a monocamada, as culturas 3D que consistem em vários tipos de células se assemelham a tecidos tumorais em suas propriedades estruturais e funcionais e, portanto, são adequadas para estudar metástases e invasão de células tumorais. É por isso que tais modelos esferoides estão contribuindo para acelerar a pesquisa sobre o câncer6.
Os esferoides também estão ajudando a desenvolver a tecnologia para criar organoides humanos, porque a biologia de tecidos e órgãos é muito difícil de estudar, particularmente em humanos. O progresso na cultura de células-tronco possibilita o desenvolvimento de culturas 3D como organoides constituídos por células-tronco e progenitores teciduais, bem como diferentes tipos de células maduras (teciduais) de um órgão com algumas características funcionais, como um órgão real, que pode ser usado para modelar o desenvolvimento de órgãos, doenças, mas também podem ser considerados úteis na medicina regenerativa7.
Os hepatócitos humanos primários são geralmente usados para estudar a biologia in vitro dos hepatócitos humanos, a função hepática e a toxicidade induzida por drogas. As culturas de hepatócitos humanos têm duas desvantagens principais, em primeiro lugar, a disponibilidade limitada de tecido primário, como os hepatócitos humanos, e, em segundo lugar, a tendência dos hepatócitos a se desdiferenciarem rapidamente em cultura 2D, perdendo assim sua função específica de hepatócitos8. As culturas hepáticas 3D são superiores a esse respeito e foram recentemente realizadas a partir de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs)9. Os esferoides 3D hepáticos de bioengenharia são de particular interesse para estudar o desenvolvimento, a toxicidade, as doenças genéticas e infecciosas do fígado, bem como na descoberta de medicamentos para o tratamento de doenças hepáticas10. Por fim, também têm potencial para serem utilizados clinicamente, sabendo que as doenças hepáticas agudas têm uma taxa de mortalidade de quase 80%, os esferoides hepáticos e/ou hepáticos bioartificiais poderiam potencialmente resgatar esses pacientes, fornecendo função hepática parcial até que um doador adequado possa ser encontrado11.
Estabelecemos um protocolo para a geração de esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) para preparar esferoides de tamanhos diferentes contendo 4000 a 1 x 106 células e analisá-los por meio de microscopia de luz e imunofluorescência. Também testamos a capacidade da função específica dos hepatócitos, avaliando a expressão das enzimas do citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) pertencentes à família do citocromo P450 que têm papéis importantes no metabolismo celular e de drogas através do processo de desintoxicação12.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>produzido em frango</td></tr><tr><td>Albumina Fração V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-1 Fetoproteína</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>coelho policlonal IgG</td></tr><tr><td>Biolaminina 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td> microesferas <td>humanas recombinantes</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>contas magnéticas de tamanho nanométrico</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Software de imagem</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 poços</td><td>OLS OMNI Ciências da Vida</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Detergente Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disponível comercialmente</td><td>Procter & Detergente</td><td>não iônico</td>Gamble <td></td></tr><tr><td>anticorpo específico para CYP2E1</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>anticorpo policlonal de coelho IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>anticorpo monoclonal de camundongo IgG1</td></tr><tr><td>Citoqueratina 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>anticorpo monoclonal de camundongo IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Merck Millipore</td><td>S0115 / 1030B</td><td>Descontinuado. Disponível em: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutamina</td></tr><tr><td>Glutaraldeído 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG Cy3</td><td>Anticorpos on-line</td><td>ABIN1673767</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG DyLight 488</td><td>Anticorpos on-line</td><td>ABIN1889284</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>meio de maturação de hepatócitos</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>anticorpo humano recombinante</td></tr><tr><td>HNF4&alpha;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>clone 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato (sal de sódio)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out Substituição de Soro - Multi Espécies Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>Descontinuado. Disponível sob o número de catálogo 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>suporte magnético</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>MiniMACS colunas</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multiplates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>Placas de 4 poços</td></tr><tr><td>Oncostatina M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td> Paraformaldeído <td>recombinante humano</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U / ml</td></tr><tr><td>PS 15ml tubos estéreis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-frango IgG Texas red</td><td>Anticorpos on-line</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Set 1077 humano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo transtirretina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>produzido em frango</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

As células hepáticas humanas podem formar uma estrutura tridimensional (3D) capaz de crescer em cultura por algumas semanas, preservando sua capacidade funcional. Devido à sua natureza de se agrupar nos pratos de cultura com características adesivas baixas ou nenhumas, eles formam agregados de múltiplas células hepáticas que são chamadas de esferoides hepáticos humanos. A formação de esferoides hepáticos 3D depende da tendência natural das células hepáticas de se agregarem na ausência de um substrato adesivo. Essas estruturas 3D possuem melhores respostas fisiológicas do que as células, que estão mais próximas de um ambiente in vivo. O uso de culturas de hepatócitos 3D tem inúmeras vantagens quando comparado com culturas bidimensionais clássicas (2D), incluindo um microambiente mais biologicamente relevante, morfologia arquitetônica que remonta órgãos naturais, bem como uma melhor predição sobre o estado da doença e respostas in vivo a drogas. Várias fontes podem ser usadas para gerar esferoides, como tecido hepático primário ou linhas celulares imortalizadas. O tecido hepático 3D também pode ser modificado usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) para derivar hepatócitos. Obtivemos esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) geradas a partir de sangue periférico não manipulado pela ativação de proteínas ligadas à GPI ligadas à membrana humana e diferenciadas aos hepatócitos humanos. As células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs e os esferoides hepáticos humanos foram analisados por microscopia de luz e imunofenotipagem usando marcadores de hepatócitos humanos.

Diferenciamos com sucesso as BD-PSCs humanas em células progenitoras endodérmicas/hepáticas e hepatócitos aplicando um protocolo de duas etapas. As alterações morfológicas durante o processo de diferenciação hepática são mostradas na Figura 1. Os BD-PSCs se diferenciam em hepatócitos que passam por três estágios diferentes. O primeiro estágio representa a diferenciação em células endodérmicas L4, o segundo, a diferenciação em células progenitoras hepáticas (hepatoblastos) L8, exibindo uma mo...

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

A geração de esferoides hepáticos humanos usando fontes autólogas pode contribuir para várias áreas de pesquisa, como toxicologia, câncer e descoberta de medicamentos. A principal vantagem desta técnica é usar hepatócitos humanos derivados de BDPC para projetar esferoides hepáticos humanos, contornando a escassez de hepatócitos humanos primários ou PHH. Os esferoides humanos autólogos podem ser estendidos à medicina regenerativa e terapia, especialmente em pacientes com insuficiência hepática aguda.Demonstrando o procedimento estará a Dra. Anne-Katherin Schott, líder do projeto no meu laboratório. Comece por preparar 500 mililitros de hexablasto KnockOut sérum substituição dimetil sulfóxido ou KSR DMSO meio e meio de maturação de hepatócitos. Aliquotar o meio da unidade populacional e adicionar o fator de crescimento de hepatócitos frescos ou HGF e oncostatina M ou OCM em concentrações finais de 10 ou 20 nanogramas por mililitro para cada mudança de meio.Transfira três vezes 10 para a quinta células-tronco pluripotentes derivadas do sangue ou células BD-PSCs para uma placa de quatro poços revestida de biolaminina e incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Para apoiar a diferenciação endodérmica, cultura das células por cinco dias em meio hepatoblástico KSR DMSO e troca do meio a cada 48 horas. No quinto dia, adicionar o meio de maturação dos hepatócitos e cultivar as células por mais sete a 10 dias na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, garantindo a troca do meio a cada 48 horas.Contagem de células utilizando uma câmara de contagem e centrífuga de suspensão de células desdiferenciadas BD a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender as células BD desdiferenciadas em meio KSR DMSO a duas vezes 10 das seis células por mililitro de concentração. Depois de garantir a suspensão de célula única, remova quaisquer detritos adicionais passando as células através de um filtro de células de 40 micrômetros.Novamente, conte as células usando uma câmara de contagem e prepare um volume suficiente de cada densidade de semeadura celular para dispensar o volume necessário por poço. Prepare um gradiente com semeadura superior de um milhão de células para uma baixa densidade de semeadura de 4.000 células. Em seguida, dispense 100 microlitros de meio KSR DMSO em placas de fixação baixa de 96 poços e adicione 100 microlitros de diluição de semeadura celular.Incube a placa de fixação baixa por cinco dias. Alterar 50% do meio no terceiro ou quarto dia após a semeadura, quando os esferoides estiverem suficientemente compactos. No quinto dia, mude o meio para o meio de maturação dos hepatócitos e faça a cultura das células nele por mais sete a 10 dias, alterando o meio a cada 48 horas.Depois de cultivar as células por 4, 8, 15 e 24 dias usando o método de diferenciação descrito anteriormente, remova o meio. Incubar as células com fixadores pré-aquecidos contendo 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos. Em seguida, descarte o fixador e lave as células com PBS duas vezes por cinco minutos cada.Adicionar imediatamente a solução de Triton X-100 a 0,1% e permeabilizar as células durante cinco minutos antes de duas lavagens de PBS. Adicionar uma solução de bloqueio feita de PBS e albumina sérica bovina a 5% ou BSA antes de colocar as células numa placa balancim durante uma hora à temperatura ambiente. Diluir os anticorpos primários em tampão de diluição 1%BSA PBS e adicionar 50 microlitros da diluição do anticorpo por poço.Rejeitar a solução de anticorpos após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente e administrar três lavagens de cinco minutos cada utilizando PBS. Adicionar 50 microlitros de anticorpos secundários diluídos em tampão de diluição em cada poço e incubar as células durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar as células três vezes com PBS por cinco minutos cada, monte as tampas com meios de montagem contendo DAPI para análise microscópica.Descarte cuidadosamente os meios de cultura sem tocar nos esferoides e adicione PBS recém-preparado com solução de 0,1% de Triton X-100 e incube por cinco minutos para permeabilizar as células. Lave os esferoides duas vezes com o meio, pipetando lentamente o meio. Em seguida, incube os esferoides com 50 microlitros dos anticorpos primários por uma hora.Uma vez feito, remova cuidadosamente o excesso de solução de anticorpos e dê três lavagens de meio. Prepare os anticorpos secundários correspondentes como IgG Cy3 anti-camundongo de cabra, IgG 488 anti-camundongo de cabra e IgG Texas Red anti-frango de coelho em PBS com 1% de BSA e adicione 50 microlitros de diluição de anticorpos por bem antes de 20 minutos de incubação na incubadora de dióxido de carbono. Novamente, lave três vezes com o meio antes de 30 minutos de incubação na incubadora.Ligue a fonte de luz de fluorescência 10 minutos antes do uso. Ligue o computador e abra o software de geração de imagens. Use o objetivo de ampliação 4X clicando no botão 4X na barra de ferramentas para selecionar a barra de escala correta.Em seguida, coloque a placa de 96 poços na placa central do palco. Ligue a fonte de luz LED, use o filtro de campo brilhante e posicione a placa no poço de interesse usando o botão de ajuste de estágio do eixo XY. Mude para o caminho da luz da câmera e clique no botão ao vivo no software de imagem para visualizar a imagem na tela.Certifique-se de que o esferoide está centralizado usando os botões do eixo XY e foque usando o botão de foco grosso ou fino. Em seguida, escolha o método de observação de campo brilhante na barra de ferramentas, coloque as configurações de exposição como automáticas e clique no botão de instantâneo no painel de controle da câmera para tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como arquivo vsi usando o nome apropriado na pasta de interesse.Coloque a placa de proteção da luz ambiente para desligar a luz LED e trocar o filtro para excitação B. Em seguida, escolha o método de observação 488. Abra o obturador, tire uma foto clicando no botão de instantâneo e feche o obturador e salve o arquivo como um vsi.Repita o processo com um filtro para excitação G para reiterar o processo para cada poço de interesse. Alterações morfológicas durante o processo de diferenciação hepática mostraram que as BD-PSCs se diferenciaram em hepatócitos através de três estágios. O primeiro estágio representou a diferenciação em células endodérmicas.A segunda diferenciação em células progenitoras hepáticas exibindo uma morfologia poligonal típica. E a terceira, a maturação para hepatócitos. A análise de imunofluorescência mostrou a forte expressão de marcadores progenitores hepáticos humanos endoderme como a alfa-fetoproteína ou APF e transtirretina ou TTR nas células no primeiro estágio do processo de diferenciação hepática no dia L4 a L8.No entanto, sua expressão diminuiu no dia L15. A expressão de albumina ou ALB e do fator nuclear de hepatócitos quatro alfa ou HNF4 alfa apareceu primeiramente em L4, aumentou ao longo do tempo de diferenciação de L4 a L15 e atingiu uma expressão forte e estável durante o tempo de maturação de L15 a L24. A agregação espontânea de células foi observada em placas de baixa fixação contendo indução de hepatócitos ou formação esferoide iniciada por meio de maturação.Uma correlação consistente foi observada entre o esferoide esteroide e a variável número de células. Os esferoides formados e diferenciados em L14 e vivos corados com anticorpos revelaram a potencial atividade funcional hepática dos esferoides derivados de BD-PSCs. A preparação de células mononucleares para reprogramação é o passo mais importante neste procedimento.A geração de esferoides hepáticos humanos é o primeiro passo para a criação de organoides in vitro versão simplificada do órgão em 3D com microanatomia semelhante à in vivo. Organoides criados em laboratório são usados para estudar organogênese, desenvolvimento de doenças e nutrientes.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo humanizado duplo com um sistema imunológico humano e células hepáticas. Envolve o transplante de células hepáticas humanas e células-tronco hematopoiéticas e progenitoras em um camundongo imunodeficiente transgênico por meio de injeção intraesplênica, levando ao enxerto de células hepáticas e ao desenvolvimento de células imunes humanas.

Desenvolvendo um modelo de camundongo humanizado com células hepáticas humanas e células imunológicas

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

O objetivo do presente protocolo é fornecer um guia passo a passo para realizar experiências em 3-d "fígado-on-a-chip" infecção com o vírus da hepatite B.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Modelos in vitro abrangentes que recapitulem fielmente a doença humana relevante estão em falta. O presente estudo apresenta a criação e cultura de spheróides tumorais tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro confiável para estudar a interação tumor-estrommal no carcinoma hepatocelular humano.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

A lesão hepática induzida por drogas (DILI) é uma das principais causas de insuficiência de drogas. Um protocolo foi desenvolvido para prever com precisão a responsabilidade DILI de um composto usando um sistema microfisiológico hepático (MPS). O modelo hepático utiliza a cocultura de células hepáticas primárias e desfechos translacionalmente relevantes para avaliar as respostas celulares ao tratamento.

Sistema Microfisiológico do Fígado Humano para Avaliação da Toxicidade Hepática Induzida por Drogas In Vitro

Os organoides revolucionam a modelagem personalizada de tecidos para desenvolvimento de órgãos, descoberta de medicamentos e pesquisa de doenças. A engenharia organoide avança na criação de tecidos sintéticos intrincados. O objetivo é integrar morfogênese, tecnologia de assembloides e biomatrizes para avançar na engenharia de tecidos. Este protocolo auxilia na modelagem da organogênese hepática e no estabelecimento de diretrizes para a construção de tecidos sintéticos.

Técnicas de cultivo in vitro para modelar a organogênese hepática, construir assembleides,

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Aprenda a gerar esferoides hepáticos humanos autólogos a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta técnica supera a escassez de hepatócitos primários e aplica-se à toxicologia, descoberta de fármacos e medicina regenerativa.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

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