Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

A cristalização por diálise é um método subutilizado. Este protocolo apresenta uma nova abordagem para isso, o que aumentará a gama de estratégias de cristalização atualmente disponíveis para determinação estruturada. As principais vantagens desta técnica são que é de alto rendimento, simples de configurar sem a necessidade de equipamento especializado, e permite fácil monitoramento do crescimento de cristais.

O indivíduo que executa esta técnica deve estar confortável com pipetagem de baixo volume e usando pipetas multicanal. As gotas devem ser pipetadas o mais suficientemente possível para evitar a desidratação parcial. Para configurar o experimento de microdiálise, coloque uma placa de microdiálise de 96 poços disponível comercialmente na orientação do lado da proteína para cima e remova a fita adesiva da tampa descascando o espaçador adesivo de pressão de 200 mícrons.

Após descascar a fita adesiva, observe a posição do poço A1. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, carregue um máximo de 3,2 microlitros de amostra de proteína adequadamente preparada em cada poço. Posicione corretamente a película de cobertura UV de 200 mícrons sobre a placa de 96 poços com a película virada para cima. Em seguida, para ativar e selar o adesivo de pressão, pressione a película da tampa UV usando uma pá de vedação e verifique sua integridade.

Agora, inverta a placa para trazê-la para a orientação do lado do buffer para cima e tome nota da posição espelhada do poço marcado A1. Usando uma pipeta multicanal, carregue um máximo de 350 microlitros da solução de diálise em cada poço da placa e sele cuidadosamente os poços com a película de cobertura do reservatório. Em seguida, coloque a placa na orientação do lado do tampão para cima dentro de uma incubadora adequada com temperatura controlada a 20 graus Celsius para permitir o crescimento de cristais. Para examinar a formação de cristais ao microscópio, remova a película protetora da película de cobertura UV de 200 mícrons e coloque a placa abaixo da ocular com o lado da proteína voltado para cima.

Para montar um experimento de cristalização em larga escala, adotar as condições em que ocorreu o crescimento de microcristais na placa de microdiálise e replicar as mesmas condições em grandes recipientes. Selecione o tamanho do recipiente dependendo do volume da solução de diálise. Pipetar um volume máximo de 500 microlitros de amostra de proteína para o tubo do dialisador antes de selar o tubo usando a tampa plástica vermelha.

Coloque o tubo dialisador selado de 500 microlitros no rack flutuante dentro do recipiente cheio de solução de diálise. Em seguida, coloque o recipiente sem ser perturbado dentro de uma incubadora adequada com temperatura controlada a 20 graus Celsius para obter o crescimento de cristais. Para verificar a formação de cristais, pipete de um a dois microlitros da solução do dialisador para uma tampa de vidro.

Cubra a solução na lâmina com outra lâmina de vidro e visualize-a ao microscópio. Imagens capturadas usando um microscópio estéreo de alta magnificação mostraram a formação bem-sucedida de microcristais de quatro proteínas usando as placas de microdiálise com membranas de corte de peso molecular de 10 quilodaltons. A lisozima formou cristais quando dialisada contra acetato de sódio 0,1 molar em pH 4 contendo aditivos apropriados.

A domatina formou cristais quando dialisada contra propano bis-tris 0,1 molar em pH 6,6 contendo aditivos apropriados. Condições otimizadas de diálise levaram à formação de microcristais pelas proteínas de membrana, nomeadamente a proteína de bomba de efluxo multidroga AcrB de E.coli e o transportador de lactose de E.coli LacY. A cristalização em larga escala nos tubos do dialisador empregando as condições otimizadas de diálise obtidas a partir dos experimentos de microdiálise levou à formação de milhares de microcristais para cada uma das proteínas.

Para cristalização da fomitina, 250 microlitros de proteína foram dialisados contra 50 mililitros da solução de diálise. Para AcrB, 250 microlitros da proteína foram dialisados contra 25 microlitros de solução de diálise. A cristalização de LacY também foi estabelecida na mesma proporção, com 100 microlitros de proteína para 10 mililitros de solução de diálise.

Ao inverter a placa para o lado tampão para cima, é importante observar a posição de A1, para que as soluções da tela de cristalização possam ser dispensadas de acordo. Os cristais obtidos a partir deste método podem ser utilizados para aplicações downstream, tais como cristalografia serial e micro ED.