Name: In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a investigar a migração de células da crista neural em matriz extracelular rica em hialuronano usando ensaios in vitro. Este método permite avaliar adesão, migração e degradação de HA para triagem de fármacos.

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Expresso grande reconhecimento a Fumitoshi Irie e Yu Yamaguchi por seu encorajamento e sugestões gentis no estabelecimento deste método. Este trabalho foi apoiado por bolsas de auxílio para programas de pesquisa científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (#19KK0232 para T.I., #20H03896 para T.I.). O método original para o revestimento de AH em substratos de vidro e ensaios de degradação in situ de AH nos substratos foi descrito em Yamamoto et al (2017)8, enquanto o método para a preparação de substratos mistos HA/Col1 foi descrito em Irie et al (2021)7.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Escola de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Osaka.
1. Cultura de células da crista neural do crânio de camundongos
NOTA: A linhagem celular da crista neural utilizada neste estudo compreende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expressam R26R-GFP isoladas de embriões de camundongo E8.512 (ver discussão). O método aqui descrito para a cultura de células O9-1 segue um protocolo previamenteestabelecido13.
<ol><li>Prepare a placa revestida com matriz de membrana basal.<ol><li>Descongelar a matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) no gelo. Diluir a matriz 1:50 em PBS refrigerado 1x e manter no gelo.</li>
		<li>Revestir uma placa de cultura de 10 cm com 10 mL da solução diluída da matriz basal-membrana. Incubar a placa à temperatura ambiente por 1 h e aspirar a matriz antes do uso.</li>
		<li>Lave a placa 3x com 2 mL de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de células O9-1 na placa revestida com matriz da membrana basal.<ol><li>Aquecer o meio de células estaminais embrionárias (ES) completo (ver Tabela de Materiais) em banho-maria a 37 °C.</li>
		<li>Misture suavemente a suspensão de células O9-1 (consulte Tabela de Materiais) e conte o número de células usando um contador de células automatizado (consulte Tabela de Materiais). Ajustar a concentração celular para 1,1 × 106/mL com meio celular ES completo.</li>
		<li>Adicionar 8 mL de meio de célula ES completo pré-aquecido à placa de cultura de 10 cm revestida com matriz e semear as células O9-1 a 1,1 x 106 células/placa. Incubar a 37 °C numa estufa humidificada a 5% CO2 .</li>
		<li>No dia seguinte, substitua o meio por meio de célula ES completo fresco (pré-aquecido a 37 °C). Substitua por meio fresco a cada 2-3 dias depois. NOTA: Quando as células são aproximadamente 80% confluentes (3-4 dias após o plaqueamento), elas podem ser dissociadas com 0,25% de tripsina-EDTA e passadas posteriormente ou congeladas para uso posterior. Imagens representativas das células O9-1 são mostradas na Figura 1.</li>
		<li>Lavar a placa de cultura com 2 mL de PBS 1x antes da tripsinização. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido e incubar por 5 min a 37 °C. Verifique se há descolamento completo da célula; Toque suavemente na lateral do prato algumas vezes, se necessário.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura e transferir as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Em seguida, adicione 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido ao tubo e ressuspenda completamente as células por pipetagem. Semeando as células em uma nova placa de cultura na densidade celular desejada.</li>
		<li>Alternativamente, prepare um estoque de células congeladas adicionando 1 mL de meio de congelamento celular contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ao tubo no lugar do meio de célula ES completo e ressuspendendo completamente as células. Transfira a suspensão celular para tubos de crio e armazene a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparo do prato revestido com HA/Col1
NOTA: O método original de revestimento de HA/Col1 em placas com fundo de vidro foi proposto por Irie et al.7.
<ol><li>Adicione cuidadosamente 50 μL de trietoxissilano não diluído a um prato com fundo de vidro de 3,5 cm (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (TR) e proteger da luz. NOTA: A incubação com trietoxisilano não deve exceder 5 min. Isso pode afetar a eficiência do revestimento e produzir produtos indesejáveis.</li>
	<li>Lave o prato rapidamente 3x com 2 mL de água destilada. Adicionar 50 μL de glutaraldeído a 0,25%, diluído 100x em PBS, por prato, e incubar em TR por 30 min.</li>
	<li>Lave rapidamente 4x com 2 mL de PBS. Em seguida, revestir as placas com 300 μL de colágeno tipo I em ácido acético 0,2 N em TR por 1 h.</li>
	<li>Lave rapidamente 3x com 2 mL de PBS. Adicionar 300 μL de 200 μg/mL de hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina-H2 (FAHA-H2) (diluído em PBS) a cada prato e incubar durante a noite em RT. Lave novamente 3x com 2 mL de PBS. Após a aspiração do PBS, seque a placa ao ar por 5 min em uma bancada limpa. NOTA: FAHA-H2 é um hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina com peso molecular médio variando de 1.200-1.600 KDa. AH de peso molecular adequado pode ser utilizado de acordo com o desenho da pesquisa.</li>
</ol>3. Ensaio de migração na placa revestida com HA/Col1
NOTA: Um ensaio baseado no fechamento da ferida usando lacunas livres de células definidas de 500 μm em substratos de Col1/HA foi realizado usando pastilhas de cultura de 2 poços (ver Tabela de Materiais). As células O9-1 expressam Tmem2, necessário para a adesão e degradação do AH no espaçoextracelular9 (Figura 2 e Figura 3).
<ol><li>Depois de secar a placa de fundo de vidro revestida, anexe as pastilhas de cultura de 2 poços às placas e preencha as pastilhas externamente com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Semeando as células O9-1 nos poços a 1 x 104 células em 100 μL de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 2% de soro fetal bovino (SFB) por inserção. Cultivar as células por 2 dias a 37 °C em estufa umidificada com CO2 a 5%.</li>
	<li>Retire cuidadosamente as pastilhas das placas com fundo de vidro revestido com uma pinça. Lave suavemente os pratos com fundo de vidro revestido com 2 mL de 1x PBS para remover as células e os detritos celulares. Adicionar 2 mL de DMEM fresco contendo 2% de FBS nos pratos de cultura.</li>
	<li>Capture imagens de contraste de fase agora como o ponto de partida usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para aquisição de imagens neste estudo (ver Tabela de Materiais). NOTA: Capture as imagens de contraste de fase com as barras de escala correspondentes e salve-as no formato TIFF.</li>
	<li>Cultivar as células por mais 48 h a 37 °C e 5% de CO2. Capturar imagens de contraste de fase em 24 h e 48 h em cultura usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um.</li>
	<li>Fixar as células a 48 h com 1 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave a louça 3x por 5 min cada com 1 mL de PBS fresco.</li>
	<li>Coloque uma lamínula com meio de montagem (ver Tabela de Materiais) para observação morfológica adicional. NOTA: Os pratos podem ser fotografados imediatamente ou armazenados por até 2 meses a 4 °C.</li>
	<li>Opcional: Imunomarcar as células para proteínas de interesse. NOTA: Um protocolo para detectar o complexo de adesão focal (FA) usando um anticorpo anti-vinculina monoclonal derivado de camundongo (consulte a Tabela de Materiais) é descrito aqui como um exemplo.<ol><li>Incubar as placas (a partir do passo 3.6) com 0,5 ml de tampão de bloqueio (5% de soro normal de cabra em PBS) durante 60 minutos. Observação : escolha um buffer de bloqueio apropriado para o anticorpo primário. Um tampão de bloqueio típico seria 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário usado.</li>
		<li>Preparar o anticorpo primário diluído em tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 ml de anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C. NOTA: Escolha o tampão de diluição de anticorpos apropriado. Normalmente, o anticorpo é usado em uma diluição de 1:50-1:200.</li>
		<li>Enxaguar 3x por 5 min cada com 2 mL de PBS. Preparar o anticorpo secundário diluído derivado da cabra anti-rato no tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 mL de anticorpo secundário diluído por 1-3 h à temperatura ambiente. NOTA: Normalmente, o anticorpo secundário é usado em uma diluição de 1:500-1:1.000. DAPI pode ser usado para coloração dos núcleos.</li>
		<li>Enxaguar 3x com 2 mL de PBS por 5 min de cada vez. Coloque a lamínula com 50 μL de meio de montagem. NOTA: As placas podem ser fotografadas usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um com um filtro GFP (excitação: 470/40, emissão: 525/50) e um filtro TexasRed (excitação: 560/40, emissão: 630/75) em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para a realização de exames neste estudo. NOTA: O slide pode ser armazenado por até 2 meses a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Abra o software ImageJ 1.51s. Na janela ImageJ, selecione Arquivo > Abrir na barra de menus para abrir o arquivo de imagem salvo.</li>
	<li>Para definir a escala de medição, desenhe uma linha da mesma distância que a barra de escala. Vá para Analisar > Definir escala e digite a distância conhecida e as unidades da linha nas caixas apropriadas da janela Definir escala .</li>
	<li>Desenhe uma linha reta entre a lacuna da célula e pressione Analisar > Medir para transferir os valores para uma janela de dados. Meça pelo menos cinco posições diferentes em cada amostra e faça a média das distâncias para obter os dados representativos da amostra. Realizar as análises estatísticas utilizando software apropriado (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

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</ol>

O autor declara que não existem interesses concorrentes.

Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração deNCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração deNCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural16. Demonstrou-se que a decorina, um pequeno proteoglican...

As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC1.
O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como componente da matriz extracelular (MEC). A importância do AH no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em sistemas modelo através da ablação de genes responsáveis pelo metabolismo do hialuronano. Por exemplo, mutações nos genes hialuronano sintase (Has1 e Has2) em Xenopus levaram a defeitos de migração de NCC e malformação craniofacial2. Além disso, os proteoglicanos ligantes de AH, agrecan e versican, têm sido relatados como exercendo efeitos inibitórios sobre a migração de NCC3. Em camundongos, a ablação de Has2 leva a graves defeitos na formação do coxim endocárdico, resultando em letalidade no meio da gestação (E9,5-10)4,5,6.
A proteína transmembrana 2 (Tmem2), uma hialuronidase de superfície celular, demonstrou recentemente desempenhar um papel crítico na promoção da adesão e migração de células cancerosas mediadas por integrinas, removendo o AH associado à matriz nos sítios de adesão 7,8. Mais recentemente, Inubushi et al.9 demonstraram que a deficiência de Tmem2 leva a graves defeitos craniofaciais devido a anormalidades na emigração/migração e sobrevida das NCC. No estudo anterior9, a expressão de Tmem2 foi analisada durante a formação e migração de NCC. A expressão de Tmem2 foi observada no local de delaminação de NCC e em NCCs Sox9-positivos emigrados (Figura 1). Além disso, utilizando células da crista neural O9-1 de camundongos depletadas de Tmem2, o estudo demonstrou que a expressão in vitro de Tmem2 foi essencial para que as células O9-1 formassem aderências focais e para sua migração para substratos contendo AH (Figura 2 e Figura 3)9.
Esses resultados indicam fortemente que o Tmem2 também é importante para a adesão e migração do NCC através da MEC rica em AH. No entanto, o mecanismo molecular de adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH ainda não está claro. Portanto, é necessário estabelecer um sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente a adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH.
Das inúmeras abordagens empregadas no teste da migração celular, o ensaio baseado no fechamento de feridas celulares é um método simples e frequentemente utilizado nos campos da fisiologia eoncologia10. Essa abordagem é útil devido à sua relevância para o fenótipo in vivo e é eficaz na determinação do papel de drogas e quimioatrativos durante a migração celular11. É possível avaliar a capacidade de migração tanto de massas celulares inteiras quanto de células individuais medindo as distâncias de gap celular ao longo do tempo11. Neste manuscrito, um ensaio modificado in vitro baseado no fechamento de feridas é introduzido para modelar a migração de NCC para tecidos ricos em AH ao redor do tubo neural. Esse procedimento também é aplicável para estudar diferentes componentes da MEC (i.e., colágenos, fibronectina e laminina) para analisar o papel do arcabouço da MEC na migração da NCC.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células de 10 cm</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. Não. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de 2 poços</td><td>ibidi</td><td>Cat. Nº 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 com rótulo de cabra anti-rato IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>Anticorpo secundário anti-rato derivado de cabra</td></tr><tr><td>contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. Não. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Meio de congelamento celular</td></tr><tr><td>colágeno tipo I</td><td>Sigma</td><td>Cat. No. 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Célula ES Completa Média</td><td>Millipore</td><td>Cat. Não. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de fluorescência</td><td>Keyence</td><td>Cat. Não. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent rotulado HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Prato de fundo Glas</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldeído</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nº G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. Não. CB-40234</td><td>O</td></tr><tr><td>anticorpo anti-vinculina monoclonal</td> da matriz da membrana basal <td>Sigma</td><td>Cat. Não. Mídia de montagem V9264</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 células</td><td>Millipore</td><td>Cat. Não. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>trietoxissilano</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nº 390143</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. Não. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro investigação dos efeitos da matriz extracelular rica em hialuronano na migração de células da crista neural

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.

Um ensaio de migração foi realizado em substratos mistos compostos por Col1 e AH de alto peso molecular (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) utilizando o protocolo aqui descrito. Células O9-1 no limite da falha migraram prontamente para a lacuna rica em AH (Figura 4). A imunomarcação para um marcador de AG, a vinculina14, confirmou que as células O9-1 formaram aderências focais (AGs) nos locais de degradação do AH (Figura 5).
<p cl...

Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.

In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

O ácido hialurônico é uma das matrizes extracelulares mais abundantes em modelo animal. A importância do ácido hialurônico no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada. Este modelo in vitro é útil para explorar como as células da crista neural aderem e migram dentro da matriz extracelular rica em ácido hialurônico.Com nossa técnica, podemos avaliar a migração e a capacidade de degradação do AH tanto da população atacadista quanto de células individuais ao longo do tempo. Além disso, essa técnica pode ser usada para triagem de drogas para encontrar compostos que acelerem ou impeçam a degradação do AH. Para começar, dilua a matriz da membrana basal com PBS resfriado na proporção de 1:50 e mantenha-a no gelo.Cubra uma placa de cultura de 10 centímetros com 10 mililitros da solução de matriz diluída e incube a placa à temperatura ambiente por uma hora. Lave o prato três vezes com dois mililitros de PBS. Para cultivar as células O9-1 na placa revestida com matriz, aquecer o tronco embrionário completo ou meio de células ES em banho-maria a 37 graus Celsius.Misture suavemente a suspensão de células O9-1 e conte o número de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, ajuste a concentração celular para 1,1 milhão de células por mililitro com o meio celular ES completo. Adicione oito mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura de 10 centímetros revestida com matriz e semeie as células O9-1 a 1,1 milhão de células por placa.Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de célula ES completo fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius. Substitua por meio fresco a cada dois ou três dias a partir de então.Lave a placa de cultura com dois mililitros de PBS e, em seguida, adicione dois mililitros de 0,25%Tripsina-EDTA pré-aquecido. Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Adicione dois mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura e transfira as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar o tubo a 300g por cinco minutos e descartar o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Adicione dois mililitros de meio celular ES completo pré-aquecido ao tubo e ressuspenda completamente as células por pipetagem. Em seguida, semeie as células em uma nova placa de cultura na densidade celular desejada.Adicione cuidadosamente 50 microlitros de trietoxissilano não diluído a uma placa de fundo de vidro de 3,5 centímetros e incube por cinco minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Lave a placa três vezes com dois mililitros de água destilada e adicione 50 microlitros de glutaraldeído 0,25% diluído 100 vezes em PBS por prato. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois lavar quatro vezes com dois mililitros de PBS e revestir os pratos com 300 microlitros de colagénio tipo um em 0,2 ácido acético normal à temperatura ambiente durante uma hora.Novamente, lave três vezes com dois mililitros de PBS. Adicionar 300 microlitros de 200 microgramas por mililitro de fluoresceinamina, marcado hialuronato de sódio H2 a cada prato e incubar durante a noite à temperatura ambiente. Lave novamente com dois mililitros de PBS três vezes.Depois de secar o prato de fundo de vidro revestido, prenda as duas pastilhas de cultura bem às louças e preencha as pastilhas externamente com um mililitro de PBS. Semeando as células O9-1 nos poços a 10.000 células em 100 microlitros de DMEM contendo 2% de soro fetal bovino ou FBS por inserção. Cultivar as células por dois dias a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5%, capturar imagens de contraste de fase como ponto de partida de tempo, usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um.Remova as pastilhas cuidadosamente das placas de fundo de vidro revestidas com pinças e lave suavemente as placas de fundo de vidro revestidas com dois mililitros de PBS para remover as células e os detritos celulares. Adicione dois mililitros de DMEM fresco contendo 2% FBS nos pratos cultivados. Cultivar as células por mais 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e capturar imagens de contraste de fase após 24 horas e 48 horas em cultura.Lave a louça com PBS e fixe as células após 48 horas com um mililitro de paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave a louça três vezes por cinco minutos cada com um mililitro de PBS fresco. Finalmente, coloque uma tampa com o meio de montagem para observação morfológica adicional.Cortes transversais do tubo neural de embriões bandeira Tmem2 em E9.0 são mostrados nesta figura. Os cortes ao nível cranial e tronco do tubo neural foram duplamente marcados para a proteína bandeira Tmem2 e hialuronano. A expressão de Tmem2 foi observada na placa neural e na região da borda do tubo neural, sendo que esses locais estavam desprovidos de coloração hialuronana.A dupla marcação das células da crista neural para o sinalizador Tmem2 e Sox9 é mostrada aqui. Cortes transversais do tubo neural E9.0 foram corados para Tmem2 flag e Sox9. As imagens representativas de células Tmem2 esgotadas e controle de O9-1 cultivadas em uma placa de cultura regular são mostradas nesta figura.A expressão de Tmem2 nessas células foi avaliada por qPCR com GAPDH como controle interno para normalização. Células Tmem2 depletadas e controle de O9-1 foram cultivadas por 48 horas em lamínulas de vidro revestidas com hialuronano fluoresceinado. A atividade degradante do hialuronano é revelada como áreas escuras no fundo fluorescente.O nível de degradação do hialuronano também foi comparado quantitativamente entre células Tmem2 depletadas e células O9-1 controle. A degradação do hialuronano ligado ao substrato nas aderências focais em células O9-1 é mostrada nesta figura. Células O9-1 cultivadas em substratos mistos constituídos por Col1/HA foram imunomarcadas com um anticorpo anti-vinculina.As manchas ou estrias escuras representam atividade de degradação do hialuronano no substrato FAHA H2. Os sítios de degradação do hialuronano e as aderências focais foram co-localizados nos substratos mistos. O revestimento coval das placas de fundo de vidro com AH é uma etapa crítica do protocolo, pois o revestimento inadequado pode resultar na remoção do AH facilmente pela força mecânica durante a adesão e migração.Para garantir o revestimento adequado, utilizamos glutaraldeído, colágeno tipo um quimicamente imobilizado ao vidro através de acoplamento armado ao aldeído. É possível usar substrato de matriz extracelular ao lado do colágeno tipo um, mas eles devem ter grupos armadores e pode haver limitações no revestimento coval em placas de fundo de vidro devido às suas propriedades químicas. Portanto, tentativa e erro podem ser necessários para determinar a melhor abordagem.Este experimento de laboratório pode ser útil no estudo de como certas moléculas funcionam durante o movimento das células da crista neural para o ambiente HA ou HA ao redor do tubo neural. Também pode ser uma maneira útil de testar drogas que podem acelerar ou impedir esse processo de migração. É interessante saber por que o Tmem2 tem as funções de adesão sobre o AH e a degradação do AH e por que o AH precisa ser degradado no local de coesão total.Como o AH é a substância mais comum na matriz extracelular, descobrir a resposta para essa pergunta é realmente importante na biologia e na medicina. Este protocolo experimental é valioso porque pode ser aplicado a vários tipos celulares, incluindo fibroblastos da pele, células epiteliais e células cancerosas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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