Name: Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a mielinização in vitro de axônios periféricos usando cocultura de gânglios dorsais de rato e células de Schwann. Este método permite quantificar a mielina e avaliar compostos terapêuticos para doenças neurodegenerativas.

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Agradecemos ao Prof. Dr. Ralf Gold e à Dra. Gisa Ellrichmann pela assessoria e apoio.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Cultura de células de Schwann
<ol><li>Revestimento para cultura de células de Schwann<ol><li>Revestir as placas de cultura celular em condições estéreis. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (CT) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Retire o PLL, lave as placas de TC 2x com água destilada e incube com 2 mL de laminina 1 μg/cm2 durante a noite a 4 °C. Lave as placas TC 2x com aqua dest, e deixe as placas secarem ao ar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo do meio para cultura de células de Schwann<ol><li>Preparar 50 mL de meio celular de Schwann adicionando 10% de soro fetal inativado por calor (FCS), 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina e 50 μg/mL de gentamicina ao meio de Dulbecco Modified Eagle (DMEM)/F-12 (alta glicose) em condições estéreis.</li>
		<li>Preparar 70 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina em condições estéreis.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo do nervo ciático NOTA: Todas as etapas de preparação do nervo ciático são realizadas sob uma bancada limpa.<ol><li>Preparar uma placa TC de 100 mm com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco gelada (DPBS) sem Ca 2+ e Mg2+, uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e 50 μg/mL de gentamicina.</li>
		<li>Limpe todos os instrumentos por autoclavagem. Borrife os instrumentos e a área de trabalho com etanol 70%.</li>
		<li>Eutanásia de cinco ratos machos Sprague Dawley com 3 semanas de idade usando inalação e decapitação de CO2 . Borrifar o tronco do rato com etanol 70%.</li>
		<li>Abra o dorso inferior esquerdo com tesoura e remova o músculo bíceps femoral cuidadosamente. Solte o nervo ciático por elevação suave com pinça curva, garantindo não machucar o nervo.</li>
		<li>Segure a parte mais proximal do nervo com a pinça curva para endireitar o nervo e prenda o nervo o mais alto possível usando uma tesoura. Em seguida, clipe o nervo próximo ao plexo sacral e à pata com tesoura. Repita as etapas 1.3.4-1.3.5 para o lado direito. NOTA: Ao abrir o membro, tome cuidado para não machucar nenhum vaso sanguíneo.</li>
		<li>Usando pinças, colocar os nervos ciáticos esquerdo e direito em uma placa de TC de 100 mm com DPBS gelada.</li>
	</ol></li>
	<li>Remodelação do nervo ciático<ol><li>Use pinça para transferir todos os nervos para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina de 50 μg/mL. Continue usando um estereomicroscópio e remova gordura, músculo e vasos sanguíneos dos nervos com dois pares de pinças finas. Pegue os nervos com pinça e transfira-os para um prato TC de 100 mm com o meio L-15 de Leibovitz gelado.</li>
		<li>Identificar as extremidades proximal e distal do nervo ciático. Remova o epineuro com um par de pinças finas no sentido proximal a distal, mantendo a extremidade proximal do nervo com o segundo par de pinças finas.</li>
		<li>Transferir os nervos purificados para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina 50 μg/mL. Provocar os fascículos nervosos isolados para separar e isolar fibras nervosas únicas usando dois pares de pinças finas.</li>
		<li>Transfira as fibras nervosas para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL e use o mínimo de meio possível. Adicionar 50 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina às fibras nervosas e rodar algumas vezes no tubo de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestão enzimática do nervo ciático Observação : as próximas etapas (etapas 1.5-1.8, 2.1 e 2.2) são executadas em condições estéreis.<ol><li>Preparar a solução de digestão enzimática contendo 0,25% dispase II, 0,05% colagenase tipo I e 50 μg/mL de gentamicina em 10 mL de DMEM (glicose alta).</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 188 x g durante 5 minutos a 4 °C, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica de 25 ml e transferir o pellet com o restante meio L-15 de Leibovitz para uma placa TC de 60 mm utilizando uma pipeta de 1.000 ml.</li>
		<li>Enxaguar o tubo de 50 mL com 10 mL da solução de digestão enzimática e adicioná-lo à placa que contém as fibras nervosas. Distribua o tecido no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta para maximizar a superfície acessível para a digestão.</li>
		<li>Incubar a 37 °C e 5% CO 2 por 18 h e interromper a digestão adicionando 10 mL de SFB a 40% em solução salina balanceada de Hanks, sem Ca2 e Mg2+ (HBSS).</li>
	</ol></li>
	<li>Separação celular<ol><li>Transfira os nervos digeridos para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica e centrífuga a 188 x g por 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL. Ressuspender o pellet 20 vezes posteriormente, usando uma ponteira de pipeta de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL e 200 μL.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 100 μm e centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 4 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.</li>
		<li>Adicionar 2 ml da suspensão celular a cada uma das duas placas de TC de 60 mm revestidas com PLL e laminina e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Deixe as placas intactas por 2 dias na incubadora para proteger as células do estresse mecânico e suportar a aderência.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação celular de Schwann<ol><li>Após 2 dias, retirar o meio e enxaguar cuidadosamente as placas 2x com DMEM (glicose alta), SFB a 10% e gentamicina 50g/mL. Em seguida, adicionar 2 mL de meio celular de Schwann. Substitua o meio celular de Schwann a cada 2dias e observe a aparência e confluência das células usando um microscópio. NOTA: As células de Schwann e os explantes DRG precisam ser preparados de forma oportuna e coordenada para o cocultivo. Certifique-se de que um rato com embriões em E 13.5 está disponível para preparação de DRG quando as células de Schwann estiverem próximas de uma confluência de 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Tripsinização celular e separação magnética NOTA: Para obter imagens exemplares de diferentes estágios de cultura de células de Schwann, consulte a Figura Suplementar 1.<ol><li>Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 80% (6-12 dias de cultura), lavar cuidadosamente as placas 2x com 3 mL de DPBS e incubar com 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% (pré-aquecido a 37 °C) por 3 min. Quando as células se desprendem do fundo da placa, inativam a digestão pela adição de 2 mL de DMEM com SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL. NOTA: Mantenha um tempo de tripsinização de estritamente 3 min, e prossiga rapidamente depois.</li>
		<li>Ressuspender o pellet celular em 2 mL de tampão de separação magnética contendo DPBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 nM. Combinar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e contar as células usando uma câmara de coloração.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C e ressuspender a pastilha celular em 90 μL de tampão de separação de células magnéticas por 1 x 107 células. Adicionar 10 μL de microesferas Thy-1 por 1 x 107 células. Ressuspender a solução algumas vezes e incubar durante 15 minutos no escuro a 8 °C.</li>
		<li>Adicionar 2 ml do tampão de separação de células magnéticas à suspensão celular e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão de separação de células magnéticas.</li>
		<li>Umedeça a coluna de separação de células magnéticas com 1 mL do tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células magnéticas. Aplique as células à coluna de separação de células magnéticas. Recolher o fluxo e centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. NOTA: Os fibroblastos são selecionados positivamente e permanecem na coluna, enquanto as células de Schwann passam pela coluna. Os fibroblastos podem ser coletados com um carimbo (por exemplo, como controle negativo para protocolos de coloração de células de Schwann).</li>
		<li>Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 1 ml do meio de cocultura (ver passo 3.1.1). Contar as células após coloração com azul de tripano e uma câmara de coloração.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultura de explantes DRG
<ol><li>Preparação do meio de crescimento DRG<ol><li>Preparar o meio de crescimento DRG adicionando 2% de B27, 2% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, 0,5% de penicilina/estreptomicina e 10 ng/mL de fator de crescimento nervoso (NGF) ao meio neurobasal. Conservar o meio de cultura a 4 °C. NOTA: O meio de crescimento pode ser usado por 2 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Revestimento para explantes DRG<ol><li>Incubar as lamínulas em etanol 70% por 1 h e colocar nos poços de placas de 4 poços usando pinças curvas. Após a secagem do etanol, aplicar 300 μL de poli-D-lisina (PDL) 0,2 mg/mL por poço e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Lave as lamínulas 3x por 5 min cada com DPBS consecutivamente. Retirar o DPBS, aplicar 300 μL de 1 μg/mL de laminina nas lamínulas e incubar durante a noite a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Após três etapas de lavagem com DPBS por 5 min, substitua o DPBS por 190 μL de meio de crescimento DRG. Coloque as placas de 4 poços na incubadora a 37 °C e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação para DRG NOTA: Colher o DRG de ratos embrionários sob uma bancada limpa.<ol><li>Antes do preparo, limpe todos os instrumentos com etanol 70%. Encher 10 (duas por embrião) placas de TC de 35 mm com 2 mL de HBSS gelado por prato, e duas placas de TC de 100 mm com 5 mL de HBSS gelado por prato.</li>
		<li>Eutanásia das ratas prenhes (fêmeas adultas de ratos Sprague Dawley, E13.5) por inalação e decapitação de CO2 .</li>
		<li>Borrifar o corpo com etanol 70% e abrir o tronco ventral do rato. Retire cuidadosamente o útero e coloque-o em uma placa TC de 100 mm com HBSS gelado.</li>
		<li>Segure o útero usando pinças curvas e abra a parede do útero com pinças finas. Retire um saco amniótico e abra-o cuidadosamente apertando um orifício com pinça fina.</li>
		<li>Remova o embrião dos tecidos circundantes, corte o cordão umbilical e decapite o embrião usando pinças finas. Coloque o tronco em uma placa de TC de 100 mm preenchida com HBSS usando pinça curva e uma espátula.</li>
		<li>Retire rapidamente todos os embriões do útero e transfira-os para uma placa de 100 mm de TC preenchida com HBSS. Se houver mais de cinco embriões, preparar uma placa adicional de 35 mm de TC com 2 mL de HBSS, de acordo com a etapa 2.3.1.</li>
		<li>Coloque delicadamente um tronco embrionário em uma placa TC de 35 mm cheia de HBSS usando uma espátula e pinça curva. Sob um estereomicroscópio, abra a parte dorsal do tronco para dividir o embrião em duas metades usando pinça fina e microtesoura. Vire uma metade para o lado e identifique o fio de DRG localizado em uma linha na parte dorsal do embrião.</li>
		<li>Corte o fio DRG como um todo usando pinças finas e micro tesouras. Coloque o DRG em uma placa de TC de 35 mm fresca preenchida com 2 mL de HBSS e separe um único DRG do tecido restante usando pinça fina e microtesoura.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de células DRG<ol><li>Leve placas de 4 poços contendo 190 μL de meio de crescimento DRG da incubadora para a bancada limpa onde o DRG deve ser preparado. Transfira um único DRG cuidadosamente para um poço de uma placa de cultura de 4 poços usando pinça fina e uma espátula. Coloque o DRG no centro de cada poço, pois uma posição central é importante para a fixação do DRG.</li>
		<li>Trabalhe em condições estéreis a partir de agora. Colocar as culturas de explantes na estufa a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte, adicionar cuidadosamente 50 μL do meio de crescimento DRG a cada poço usando uma pipeta de 100 mL.</li>
		<li>Observe a aderência do explante DRG e a expansão do axônio usando um microscópio diariamente, e descarte os explantes DRG que se desprenderam da lamínula ou não conseguiram superar os axônios no dia 3 de cultura. OBS: Os explantes DRG são muito frágeis nos primeiros dias de cultivo e precisam ser manuseados com cuidado, principalmente ao movimentar as placas para dentro e para fora da incubadora quando o meio é trocado, ou mesmo ao fechar a porta da incubadora. O volume preciso de 190 μL de meio por poço é crucial para manter os explantes DRG no local durante o primeiro dia de cultivo. Explantes DRG soltos podem ser facilmente identificados durante o controle diário, pois nadam no meio em vez de aderir à lamínula.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cocultura
<ol><li>Transferência de células de Schwann para a cultura de explantes DRG<ol><li>Preparar o meio de cocultura adicionando ácido ascórbico a 0,1% ao meio de cultura DRG.</li>
		<li>No dia 3 da cultura do explante DRG, substituir cuidadosamente o meio de crescimento DRG por 250 μL do meio de cocultura contendo 30.000 células de Schwann (a partir da etapa 1.8) por poço.</li>
		<li>Manter a cocultura dos explantes DRG e células de Schwann por até 22 dias. Substitua cuidadosamente 250 μL do meio de cocultura a cada dois dias e observe a aparência das células usando um microscópio. NOTA: Para obter um exemplo de axônios DRG e células de Schwann na cocultura nos primeiros dias de cultura, consulte a Figura 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração imunocitoquímica OBS: Manusear as amostras de cocultura com extremo cuidado durante o procedimento de coloração, pois elas podem ser danificadas facilmente.<ol><li>Para fixar as células nas lamínulas, retire o meio lentamente, lave 3x com DPBS cuidadosamente e incube em paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min. Substitua o PFA por DPBS e armazene as células fixas a 4 °C por até 1 semana. CUIDADO: Ao manusear 4% de PFA, use o equipamento de proteção individual recomendado.</li>
		<li>Lavar as lamínulas 3x com DPBS por 5 min, em seguida, bloquear com solução de bloqueio (10% de soro de cabra, 10% de albumina de soro bovino [BSA], 0,1% de gelatina e 0,05% de Triton X-100) em DPBS por 1 h. Diluir os anticorpos primários βIII-tubulina (1:7.500) e proteína básica da mielina (MBP) (1:750) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave as células 3x com DPBS por 5 min. Use anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente em uma diluição de 1:1.000 em solução de bloqueio e incube por 2 h à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Lavar as células 3x com DPBS por 5 min e montar as células em lâminas microscópicas com meio de montagem de fluorescência, incluindo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar as lâminas no escuro a 4 °C até documentação microscópica. CUIDADO: Ao manusear o meio de montagem com fluorescência, use o equipamento de proteção individual recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise<ol><li>Tire fotos de oito regiões definidas ao redor do explante DRG no centro usando um microscópio invertido.</li>
		<li>Utilizar um software de análise de imagens para quantificar as áreas de axônios βIII-tubulina positiva e mielinização coradas pela MBP.</li>
		<li>Calcular a porcentagem de mielinização como uma proporção dos axônios mielinizados e axônios não mielinizados.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Aqui, apresentamos um protocolo rápido e fácil para a geração de mielinização in vitro através da fusão de duas culturas de tipos celulares distintas, células de Schwann e explantes do gânglio da raiz dorsal.
Uma etapa crítica do protocolo é o cultivo de explantes DRG, especialmente nos primeiros dias de cultivo. Os DRG são muito frágeis antes que uma rede axonal forte seja construída e devem ser manuseados com muito cuidado, por exemplo, quando retirados da incubadora ou durante uma ...

No sistema nervoso periférico (SNP), a rápida transdução de informação é mediada por axônios envoltos em mielina. A mielinização dos axônios é essencial para permitir a rápida propagação dos impulsos elétricos, uma vez que a velocidade de condução das fibras nervosas correlaciona-se com o diâmetro do axônio e a espessura da mielina1. A sinalização sensorial da periferia para o sistema nervoso central (SNC) depende da ativação de neurônios sensoriais de primeira ordem que residem em ampliações da raiz dorsal, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG). Para a formação e manutenção da mielina,é obrigatória a comunicação contínua entre os axônios e as células de Schwann, que são as células mielinizantes da Glia no SNP2.
Muitas doenças dos SPN perturbam a transdução de informações por dano axonal primário ou desmielinizante, resultando em hipoestesia ou disestesia. Os neurônios sensoriais de primeira ordem têm a capacidade de se regenerar até certo ponto após dano neuronal, por meio de uma complexa interação entre o neurônio e as células de Schwanncircundantes 3. Nesse caso, as células de Schwann podem sofrer reprogramação celular para limpar debris axonais e mielínicos e promover regeneração axonal, resultando em remielinização4. A compreensão dos mecanismos da mielinização na saúde e na doença é importante, a fim de encontrar possíveis opções de tratamento para as desordens desmielinizantes dos SPN. A mielina também pode ser lesada por neurotrauma agudo, e abordagens para promover mielinização para avançar na recuperação funcional após lesão de nervo periférico estão sendo investigadas5.
Nosso conhecimento da mielinização periférica tem se beneficiado em grande parte das coculturas mielinizantes de células de Schwann e neurônios sensoriais. Desde as primeirasabordagens 6,7,8, a mielinização tem sido intensamente estudada com o uso de diferentes sistemas de cocultura9,10,11. Aqui, fornecemos um protocolo rápido e fácil para mielinização in vitro robusta de axônios ganglionares da raiz dorsal. O protocolo para preparação de células de Schwann é baseado no protocolo de Andersen et al.12, publicado anteriormente em Pitarokoili et al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratos juvenis e culturas embrionárias de explantes DRG para a cocultura, na qual a mielinização ocorre por volta do 14º dia. O objetivo do método é fornecer um sistema para investigar a formação de mielina como resultado da interação direta axônio-célula de Schwann, e estudar moduladores da mielinização do SNP. Em comparação com culturas de células neuronais dissociadas, os explantes DRG são mais anatomicamente preservados e formam processos axonais longos. A quantificação da área do axônio mielinizado fornece uma leitura suficiente para mielinização na cocultura. O método é uma ferramenta valiosa para triagem de compostos terapêuticos quanto ao seu potencial efeito sobre a mielinização dos SPN, podendo também ser utilizado em complemento a estudos in vivo em modelosanimais14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, coelho</td><td>Novus Biologicals, Centannial, EUA</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig; III-tubulina de camundongo</td><td>Biolegend, San Diego, EUA</td><td>657402</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27-suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Ponta do Filtro Biosphere, 100 &micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>70760212</tr><tr><td>Ponta de Filtro Biosphere, 1250 &micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>701186210</tr><tr><td>Ponta de Filtro Biosphere, 20 &micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>701114210</tr><tr><td>Ponta de Filtro Biosphere, 300 &micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>70765210</tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células, 100 &micro; M</td><td>BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810-R</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora CO2 Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Lamínulas 12 mm</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina curvada</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, Alemanha</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>4942078001</tr><tr><td>Água destilada (Sistema de Purificação de Água)&nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, França</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>31331093</tr><tr><td>DPBS (sem Ca2+ e sem Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>VWR, Radnor, EUA&nbsp;</td><td></td><td></td>1009862500</tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS deve ser testado para cultura de células Schwann</td></tr><tr><td>Fórceps fino (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho para cabras Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (sem Ca2+ e sem Mg2+)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>14170138</tr><tr><td>Incubadora HERAcell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>51029882</tr><tr><td>Soro para cavalos</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, Alemanha</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>HIH, Bethesda, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&agudo; s L-15 Medium Thermo</td><td>Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>11415064</tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>MACS Multistand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio&nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, Alemanha</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Axio observador 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, Alemanha&nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>VWR, Radnor, EUA&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>colunas MS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Neubauer&nbsp;</td><td>Assistente, Erlangen, Alemanha</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, Rocky Hill, EUA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Biozol, Eching, Alemanha</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon &Delta; multiplacas, 4 poços</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Acros Organics, Nova Jersey, EUA&nbsp;</td><td></td><td></td>10342243</tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td>4430000018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação, 15&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>62554502</tr><tr><td>Tubos de reação, 50&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>62547254</tr><tr><td>Vasos de reação, 1,5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>72690001</tr><tr><td>Armário de Segurança S2020 1.8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>51026640</tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 10 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>861254025</tr><tr><td>Pipeta sorológica, 25 mL</td><td>de Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>861685001</tr><tr><td>Pipeta sorológica, 5 mL</td><td>de Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>861253001</tr><tr><td>Spatula</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Descoberta de Estereomicroscópio.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, Alemanha&nbsp;</td><td>495015-0012-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>TC prato 100, célula +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>833902300</tr><tr><td>prato TC 35, célula +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>833900300</tr><tr><td>prato TC 60, célula +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>833901300</tr><tr><td>Thy-1 Microesferas (Kit MACS)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solução 0,4%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>Tripsina (2,5%), sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha&nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tipo I Collagenase</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemanha&nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria tipo 1008</td><td>GFL, Burgwedel, Alemanha&nbsp;</td><td>Nº 4285</td><td></td></tr></tbody></table>

mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de schwann

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

O processo de mielinização é essencial para permitir a transdução rápida e suficiente do sinal no sistema nervoso. No sistema nervoso periférico, neurônios e células de Schwann se envolvem em uma interação complexa para controlar a mielinização dos axônios. Distúrbios dessa interação e quebra da bainha de mielina são características das neuropatias inflamatórias e ocorrem secundariamente em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos um modelo de cocultura de explantes do gânglio da raiz dorsal e células de Schwann, que desenvolve uma mielinização robusta de axônios periféricos para investigar o processo de mielinização no sistema nervoso periférico, estudar as interações axônio-célula de Schwann e avaliar os potenciais efeitos dos agentes terapêuticos sobre cada tipo celular separadamente. Metodologicamente, gânglios da raiz dorsal de ratos embrionários (E13.5) foram colhidos, dissociados de seu tecido circundante e cultivados como explantes inteiros por 3 dias. Células de Schwann foram isoladas de ratos adultos com 3 semanas de idade, e os nervos ciáticos foram digeridos enzimaticamente. As células de Schwann resultantes foram purificadas por triagem celular ativada por magnetismo e cultivadas sob condições enriquecidas com neuregulina e forskolina. Após 3 dias de cultura do explante do gânglio da raiz dorsal, 30.000 células de Schwann foram adicionadas a um explante do gânglio da raiz dorsal em meio contendo ácido ascórbico. Os primeiros sinais de mielinização foram detectados no 10º dia de cocultivo, através de sinais esparsos para proteína básica de mielina na coloração imunocitoquímica. A partir do 14º dia, bainhas de mielina foram formadas e propagadas ao longo dos axônios. A mielinização pode ser quantificada pela coloração da proteína básica da mielina como uma razão entre a área de mielinização e a área axonal, para explicar as diferenças na densidade axonal. Este modelo oferece oportunidades experimentais para o estudo de vários aspectos da mielinização periférica in vitro, o que é crucial para a compreensão da patologia e possíveis oportunidades de tratamento para desmielinização e neurodegeneração em doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico.

A mielinização na cocultura foi avaliada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os explantes DRG e as células de Schwann foram corados para MBP, βIII-tubulina e DAPI. A rede axonal na cocultura foi densa e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação. Os primeiros sinais de mielina, na forma de pequenos fragmentos, foram detectáveis no 10º dia e aumentaram no 12º dia (Figura 2). As áreas positivas para PAM aumentaram ao longo do tempo até o 20º dia de cultura. A mielinização foi...

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Este modelo oferece oportunidades experimentais para estudar vários aspectos da mielinização do sistema nervoso periférico in vitro. Permite a quantificação da mielina e o exame das interações celulares Axon-Schwann. A co-cultura desenvolve uma mielinização robusta a partir do 14º dia.As culturas de explantes DRG fornecem a vantagem da arquitetura estrutural intacta em comparação com culturas neuronais dissociadas. Este método está disponível para triagem de compostos tropóticos para doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico. Para começar, esterilize a área de trabalho no tronco do rato eutanasiado com etanol 70%.Abra o membro inferior esquerdo dorsal do rato com uma tesoura e remova cuidadosamente o músculo femoral do bíceps. Solte o nervo ciático por elevação suave com pinça curva, garantindo não machucar o nervo. Usando pinças, transfira os nervos cortados para uma placa de cultura de tecidos com meio L-15 de Leibovitz gelado com 50 microgramas por mililitro de gentamicina.Em seguida, usando um microscópio estéreo, remova a gordura, o músculo e os vasos sanguíneos dos nervos com dois pares de pinças finas. Identificar as extremidades proximal e distal do nervo ciático e remover o epineuro com uma pinça fina na direção proximal a distal enquanto segura a extremidade proximal do nervo com o segundo par de pinças finas. Depois de transferir os nervos purificados para outra placa de cultura de tecidos com meio L-15 gelado de Leibovitz com gentamicina, provoque os fascículos nervosos isolados para separar e isolar fibras nervosas únicas usando dois pares de pinças finas.Transfira as fibras nervosas para um tubo de 50 mililitros usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros e use o mínimo de meio possível. Em seguida, adicione 50 mililitros do meio L 15 de leibovitz com gentamicina às fibras nervosas em slew algumas vezes. Centrifugar o tubo contendo as fibras nervosas a 188 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a remoção do sobrenadante, transfira o pellet com o restante meio L-15 de Leibovitz para uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Enxágue o tubo de 50 mililitros com 10 mililitros da solução de digestão enzimática e adicione-o ao prato de fibras nervosas. Distribua as fibras nervosas no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta.Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. E pare a digestão enzimática adicionando 10 mililitros a 40%FCS em HBSS. Transfira os nervos digeridos para um tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM contendo 10%FCS e 50 microgramas por mililitro de gentamicina. Em seguida, filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de 100 micrômetros. após centrifugação a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, suspender novamente o pellet com quatro mililitros de DMEM contendo FCS e gentamicina.Adicione dois mililitros da suspensão celular a cada uma das duas placas de cultura de tecidos revestidas de polilisina e laminina de 60 milímetros. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, deixando as placas intactas por dois dias na incubadora. Centrifugar a suspensão da célula de Schwann a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e ressuspender a pastilha da célula em 90 microlitros de tampão de separação de células magnéticas por uma vez 10 até a sétima célula.Em seguida, adicione 10 microlitros de ti1 micro esferas por uma vez 10 para a sétima célula. Incubar a solução ressuspensa durante 15 minutos no escuro a oito graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros no tampão de separação de células magnéticas à suspensão da célula.Após centrifugar a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células e umedeça a coluna com um mililitro do tampão de separação de células magnéticas. Em seguida, aplique as células para coletar o fluxo para centrifugação.Retire cuidadosamente o útero de uma rata grávida eutanasiada e coloque-o em uma placa de cultura de tecido de 100 milímetros com HBSS gelado. Segurando o útero usando pinças curvas, abra a parede do útero com pinças finas. Retire um saco amniótico e abra-o cuidadosamente apertando um orifício com pinça fina.Retire rapidamente todos os embriões do útero e transfira-os para um prato cheio de HBSS. Delicadamente, coloque um tronco embrionário em um prato de 35 milímetros preenchido com HBSS. sob um microscópio estéreo, abra a parte dorsal do tronco para dividir o embrião em duas metades.Vire a metade para o lado e identifique o fio de gânglios da raiz dorsal, ou DRG, localizado na linha na parte dorsal do embrião. Corte o fio DRG como um todo usando pinças finas e micro tesouras. Depois de colocar o DRG em um prato fresco preenchido com dois mililitros de HBSS, Separe um único DRG do tecido restante usando pinça fina e micro tesoura.Pegue uma placa de 4 poços contendo 190 microlitros de meio de crescimento DRG em cada poço e transfira cuidadosamente um único DRG para o centro de cada poço usando pinças finas e uma espátula. Em seguida, coloque as culturas de explante DRG na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione cuidadosamente 50 microlitros do meio de crescimento DRG a cada poço e observe a aderência do explante DRG e o crescimento do axônio usando um microscópio diariamente.Para o co-cultivo no terceiro dia da cultura do explante DRG, substitua cuidadosamente o meio de crescimento DRG por 250 microlitros do meio de co-cultura contendo 30.000 células de schwann por poço. Para a realização da coloração imunocitoquímica, fixar as células nas lamínulas da tampa incubando as células lavadas em paraformaldeído a 4% por 10 minutos. Tire fotos das amostras coradas imunocitoquimicamente em oito regiões definidas ao redor do explante DRG no centro usando um microscópio invertido.A aparência de células de schwann com uma morfologia alongada e fusiforme e os axônios DRG finos em uma co-cultura é descrita aqui. A mielinização na co-cultura foi avaliada em diferentes dias pela coloração dos explantes DRG e células de Schwann para proteína básica de mielina ou MBP, beta três tubulina e DAPI. A rede axonal na co-cultura foi densa, e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação.Os primeiros sinais de mielinização foram visíveis nos dias 10 e 12 da co-cultura. A partir do 14º dia, o sinal do MVP foi mais pronunciado, e axônios envoltos em mielina foram detectados. A mielinização aumentou com o tempo de co-cultura até o 20º dia.A mielinização foi quantificada como uma razão entre as áreas positivas para PVM e beta três tubulinas. Um aumento significativo na mielinização foi observado nos dias 18 e 20 em comparação com o dia 10. As culturas de explantes DRG são frágeis e precisam ser manuseadas com cuidado.Por exemplo, quando retirado da incubadora ou durante a troca e fixação do meio. A análise da expressão gênica de amostras de co-cultura pode ser formada para investigar a mielina em maior detalhe. Aqui, detectamos os marcadores de mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 no dia 22.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A protocolos para um sistema cerebral de ratos embrionários cultura agregada é descrita. Progenitores multipotentes nos agregados podem se desenvolver e se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

O vídeo demonstra a co-cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) com células de Schwann. Os neurônios DRG são cultivados primeiro em uma membrana pré-esticada para o crescimento do axônio alinhado. As células de Schwann são então introduzidas, que se ligam aos axônios, isolando-os e promovendo a sobrevivência e a função das células neurais.

Co-cultura de células de Schwann com neurônios DRG em uma membrana pré-esticada

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Este vídeo demonstra um método para isolar células de Schwann das fibras do nervo ciático de camundongos.

Separação magnética de células de Schwann de nervos ciáticos de camundongos

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas que contêm os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. Quando dissociada, podem ser co-cultivadas com células estaminais do tipo SC, derivadas de tecido adiposo (ASC), proporcionando um valioso modelo para estudar a regeneração de nervos em vitro e mielinização, simulando o ambiente in vivo, no local da lesão.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Este protocolo descreve métodos para estabelecer culturas de montagem inteira e dissociadas de gânglios da raiz dorsal de camundongos (DRG) e seu uso para avaliar as interações tumor-nervo.

Estabelecendo modelos in vitro de cultura de gânglios da raiz dorsal: abordagens complementares para investigar a diafonia câncer-nervo

Aprenda a mielinização in vitro de axônios periféricos usando cocultura de gânglios dorsais de rato e células de Schwann. Este método permite quantificar a mielina e avaliar compostos terapêuticos para doenças neurodegenerativas.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

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