Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Este modelo oferece oportunidades experimentais para estudar vários aspectos da mielinização do sistema nervoso periférico in vitro. Permite a quantificação da mielina e o exame das interações celulares Axon-Schwann. A co-cultura desenvolve uma mielinização robusta a partir do 14º dia.

As culturas de explantes DRG fornecem a vantagem da arquitetura estrutural intacta em comparação com culturas neuronais dissociadas. Este método está disponível para triagem de compostos tropóticos para doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico. Para começar, esterilize a área de trabalho no tronco do rato eutanasiado com etanol 70%.

Abra o membro inferior esquerdo dorsal do rato com uma tesoura e remova cuidadosamente o músculo femoral do bíceps. Solte o nervo ciático por elevação suave com pinça curva, garantindo não machucar o nervo. Usando pinças, transfira os nervos cortados para uma placa de cultura de tecidos com meio L-15 de Leibovitz gelado com 50 microgramas por mililitro de gentamicina.

Em seguida, usando um microscópio estéreo, remova a gordura, o músculo e os vasos sanguíneos dos nervos com dois pares de pinças finas. Identificar as extremidades proximal e distal do nervo ciático e remover o epineuro com uma pinça fina na direção proximal a distal enquanto segura a extremidade proximal do nervo com o segundo par de pinças finas. Depois de transferir os nervos purificados para outra placa de cultura de tecidos com meio L-15 gelado de Leibovitz com gentamicina, provoque os fascículos nervosos isolados para separar e isolar fibras nervosas únicas usando dois pares de pinças finas.

Transfira as fibras nervosas para um tubo de 50 mililitros usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros e use o mínimo de meio possível. Em seguida, adicione 50 mililitros do meio L 15 de leibovitz com gentamicina às fibras nervosas em slew algumas vezes. Centrifugar o tubo contendo as fibras nervosas a 188 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após a remoção do sobrenadante, transfira o pellet com o restante meio L-15 de Leibovitz para uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Enxágue o tubo de 50 mililitros com 10 mililitros da solução de digestão enzimática e adicione-o ao prato de fibras nervosas. Distribua as fibras nervosas no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta.

Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. E pare a digestão enzimática adicionando 10 mililitros a 40%FCS em HBSS. Transfira os nervos digeridos para um tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM contendo 10%FCS e 50 microgramas por mililitro de gentamicina. Em seguida, filtre a suspensão da célula através de um filtro de célula de 100 micrômetros. após centrifugação a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, suspender novamente o pellet com quatro mililitros de DMEM contendo FCS e gentamicina.

Adicione dois mililitros da suspensão celular a cada uma das duas placas de cultura de tecidos revestidas de polilisina e laminina de 60 milímetros. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, deixando as placas intactas por dois dias na incubadora. Centrifugar a suspensão da célula de Schwann a 188 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e ressuspender a pastilha da célula em 90 microlitros de tampão de separação de células magnéticas por uma vez 10 até a sétima célula.

Em seguida, adicione 10 microlitros de ti1 micro esferas por uma vez 10 para a sétima célula. Incubar a solução ressuspensa durante 15 minutos no escuro a oito graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros no tampão de separação de células magnéticas à suspensão da célula.

Após centrifugar a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células e umedeça a coluna com um mililitro do tampão de separação de células magnéticas. Em seguida, aplique as células para coletar o fluxo para centrifugação.

Retire cuidadosamente o útero de uma rata grávida eutanasiada e coloque-o em uma placa de cultura de tecido de 100 milímetros com HBSS gelado. Segurando o útero usando pinças curvas, abra a parede do útero com pinças finas. Retire um saco amniótico e abra-o cuidadosamente apertando um orifício com pinça fina.

Retire rapidamente todos os embriões do útero e transfira-os para um prato cheio de HBSS. Delicadamente, coloque um tronco embrionário em um prato de 35 milímetros preenchido com HBSS. sob um microscópio estéreo, abra a parte dorsal do tronco para dividir o embrião em duas metades.

Vire a metade para o lado e identifique o fio de gânglios da raiz dorsal, ou DRG, localizado na linha na parte dorsal do embrião. Corte o fio DRG como um todo usando pinças finas e micro tesouras. Depois de colocar o DRG em um prato fresco preenchido com dois mililitros de HBSS, Separe um único DRG do tecido restante usando pinça fina e micro tesoura.

Pegue uma placa de 4 poços contendo 190 microlitros de meio de crescimento DRG em cada poço e transfira cuidadosamente um único DRG para o centro de cada poço usando pinças finas e uma espátula. Em seguida, coloque as culturas de explante DRG na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione cuidadosamente 50 microlitros do meio de crescimento DRG a cada poço e observe a aderência do explante DRG e o crescimento do axônio usando um microscópio diariamente.

Para o co-cultivo no terceiro dia da cultura do explante DRG, substitua cuidadosamente o meio de crescimento DRG por 250 microlitros do meio de co-cultura contendo 30.000 células de schwann por poço. Para a realização da coloração imunocitoquímica, fixar as células nas lamínulas da tampa incubando as células lavadas em paraformaldeído a 4% por 10 minutos. Tire fotos das amostras coradas imunocitoquimicamente em oito regiões definidas ao redor do explante DRG no centro usando um microscópio invertido.

A aparência de células de schwann com uma morfologia alongada e fusiforme e os axônios DRG finos em uma co-cultura é descrita aqui. A mielinização na co-cultura foi avaliada em diferentes dias pela coloração dos explantes DRG e células de Schwann para proteína básica de mielina ou MBP, beta três tubulina e DAPI. A rede axonal na co-cultura foi densa, e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação.

Os primeiros sinais de mielinização foram visíveis nos dias 10 e 12 da co-cultura. A partir do 14º dia, o sinal do MVP foi mais pronunciado, e axônios envoltos em mielina foram detectados. A mielinização aumentou com o tempo de co-cultura até o 20º dia.

A mielinização foi quantificada como uma razão entre as áreas positivas para PVM e beta três tubulinas. Um aumento significativo na mielinização foi observado nos dias 18 e 20 em comparação com o dia 10. As culturas de explantes DRG são frágeis e precisam ser manuseadas com cuidado.

Por exemplo, quando retirado da incubadora ou durante a troca e fixação do meio. A análise da expressão gênica de amostras de co-cultura pode ser formada para investigar a mielina em maior detalhe. Aqui, detectamos os marcadores de mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 no dia 22.