Técnicas e práticas de cultura celular para evitar a contaminação por fungos e bactérias no laboratório de cultura de células de pesquisa

A cultura de células é uma habilidade delicada necessária para o crescimento de vários tipos de células e tecidos em um ambiente laboratorial controlado. A principal preocupação ao realizar o trabalho de cultura de células é a contaminação. Essa contaminação pode vir na forma de bactérias, mofo ou micoplasma.

As técnicas e práticas descritas neste vídeo garantirão que suas células permaneçam viáveis, saudáveis e livres de contaminação. Essas práticas devem ser rigorosamente seguidas, e todo o pessoal do laboratório deve receber treinamento pelo menos uma vez por ano. Antes de começar a trabalhar, use um jaleco limpo designado para uso apenas na sala de cultura de células.

Use luvas novas que não tenham tocado em nenhuma outra superfície. Certifique-se de que as luvas se encaixam bem. Luvas sem pó nitrílicas são as melhores.

O jaleco e as luvas não precisam ser estéreis. Para se preparar para o trabalho, borrife luvas, mangas de jaleco e o interior do armário de segurança biológica com etanol 70%. Borrife a superfície de trabalho, as laterais, a parte de trás, quaisquer itens no armário e no painel de vidro frontal, tanto por dentro quanto por fora.

Limpe a superfície de trabalho e o painel de vidro com uma toalha de papel sem fiapos. Reserve algum tempo para organizar o espaço de trabalho dentro do armário. Mantenha banhos de água dentro da sala de cultura de células e use-os apenas para fins de cultura de células, como meios de aquecimento ou descongelamento de células.

Os banhos de água devem ser drenados e lavados uma vez por semana. Limite a quantidade de itens trazidos para o armário e não interrompa o fluxo de ar dentro do armário de segurança biológica, bloqueando as grades dianteiras ou traseiras. Borrife todos os itens colocados dentro do armário com etanol 70% e limpe-os secos.

Comece borrifando a parte superior da garrafa de mídia e trabalhe para baixo. Com uma toalha de papel limpa, comece pela parte superior da garrafa de mídia para secá-la, indo progressivamente até o fundo. Não volte para cima em direção à tampa.

A maneira como esses armários funcionam é que eles puxam o ar da sala e do próprio armário através das grades dianteira e traseira. O ar vai em direção à parte de trás do gabinete e até o topo. Lá, o ar contaminado passa por um monte de filtros, e parte do ar limpo filtrado é empurrado para baixo sobre a área de trabalho no gabinete.

Se o armário for grande o suficiente para acomodar pipetas sorológicas, elas podem ser colocadas no interior, caso contrário, elas podem ser armazenadas em um recipiente montado na parte externa do armário. É uma boa prática verificar em ambos os lados da pipeta envolta se há furos, rasgos ou furos na embalagem antes de usar. Não rasgue o embrulho.

Em vez disso, descasque suavemente as extremidades do invólucro. Insira a pipeta sorológica em um auxiliar de pipeta e remova o invólucro em um movimento fluido. Não passe o mouse sobre garrafas ou frascos abertos.

Não é recomendável alcançar um frasco ou frasco aberto, ou trabalhar acima de frascos abertos. O fluxo de ar dentro dos armários empurra para baixo qualquer coisa dentro. Estender a mão permitirá que sua manga ou luva esteja em cima de itens que podem potencialmente empurrar qualquer contaminação presente em sua manga, por exemplo, para sua cultura celular.

Sempre que possível, não despeje líquidos. Em vez disso, adicione-os usando uma pipeta sorológica. Misture bem o conteúdo e inicie o frasco.

Anote o que a mídia é complementada. Se você está trabalhando com culturas aderentes e precisa de um frasco de plástico, borrife toda a embalagem e coloque-a dentro. Sempre que suas luvas secarem, borrifem-nas com o etanol novamente.

Ao trabalhar com uma linha celular aderente, use pipetas de vidro autoclavadas ou pipetas plásticas estéreis descartáveis para aspirar meios ou soluções de lavagem. Retire cuidadosamente a tampa metálica do recipiente de armazenamento. Isole uma pipeta de vidro agitando suavemente o recipiente em um ângulo.

Ao entrar no recipiente, evite tocar em outras pipetas. Manuseie a pipeta escolhida a partir de apenas uma extremidade. Substitua rapidamente as tampas dos frascos e frascos o mais rápido possível.

Coloque tampas na superfície de trabalho de cabeça para baixo para que o aro não toque na superfície de trabalho. Não pegue a tampa de cima ou de baixo. Em vez disso, toque em tampas pelas laterais.

Ao aspirar líquidos, use um frasco de armadilha de vácuo localizado fora do gabinete em um recipiente secundário no chão. Os resíduos serão criados enquanto se trabalha dentro do gabinete. Como mover as mãos para dentro e para fora do armário com muita frequência interromperá o fluxo de ar, não há problema em deixar temporariamente qualquer resíduo dentro do armário.

Coloque-o ao lado para que não interrompa o seu trabalho. Borrife generosamente as luvas com etanol 70% sempre que ficarem secas. Esfregue as mãos para que não fiquem molhadas.

Uma nota rápida sobre pipetas sorológicas. Se eles acidentalmente tocarem em outra coisa no capô, não hesite em jogá-los fora. É melhor começar de novo com uma pipeta sorológica limpa em vez de usar uma que possa estar contaminada.

Antes de colocar as células na incubadora, verifique como elas ficam sob o microscópio. Células isoladas devem ser observadas. Isso indica que as células foram ressuspensas completamente.

Não fale, espirre, tosse ou respire muito nas incubadoras. Abra e feche rapidamente as portas da incubadora. Deixá-los abertos por mais tempo do que o necessário pode permitir que contaminantes presentes no ar entrem nas incubadoras.

Certifique-se de que as tampas de todos os frascos estejam bem fechadas antes de removê-las do armário. A mídia é sensível à luz. Deve ser armazenado no escuro a quatro graus Celsius quando não estiver em uso.

Borrife o interior do gabinete com etanol a 70% novamente após a conclusão do trabalho de cultura celular e seque a superfície com um papel toalha. Esvazie o saco de lixo de risco biológico. Repita esse processo e substitua as luvas ao mudar para uma linha celular diferente.

Ao trabalhar com culturas de suspensão cultivadas em frascos de vidro, certifique-se de que as luvas estejam molhadas. Toque a folha de alumínio com as luvas molhadas e, em seguida, borrife apenas o fundo do frasco antes de colocá-lo dentro do armário de segurança biológica. Ao colher uma amostra para contagem celular, remova apenas um tubo de 1,5 ml do recipiente.

Não toque em nenhum dos outros tubos. Coloque a tampa de cabeça para baixo na superfície de trabalho. Não toque no aro interno.

Manuseie-o com cuidado pelas laterais e substitua-o assim que terminar. Ao manusear células de suspensão e frascos de vidro, remova cuidadosamente a peça dobrada dupla de folha de alumínio que cobre todo o gargalo do frasco. Puxe suavemente os quatro cantos e coloque a folha de cabeça para baixo na superfície de trabalho.

Manuseie o frasco de vidro apenas a partir do fundo. Não toque no pescoço quando o papel alumínio estiver desligado. Utilizar uma pipeta serológica de 1 ml para colher uma amostra para contagem celular.

Não deixe o meio escorrer pela lateral dos frascos. Se isso acontecer, borrife papel toalha com etanol 70% e limpe-o imediatamente. Certifique-se de que as tampas ou a folha de alumínio estão apertadas antes de remover garrafas ou frascos dos armários de segurança biológica.

Use incubadoras separadas para diferentes tipos de células. Isso evitará a contaminação cruzada de diferentes tipos celulares. Recomenda-se a colocação do frasco de armadilha de vácuo para coleta de resíduos líquidos fora do armário no chão em um recipiente secundário rotulado como resíduos.

A mangueira é conectada a um filtro que é substituído mensalmente. A mangueira entra pela lateral do gabinete. Remova o lixo de risco biológico assim que o trabalho for concluído.

Mantenha um protocolo de lavagem de vidro na parede ao lado da pia. Primeiro, mergulhe as células descartadas com água sanitária a 10% por cerca de cinco minutos. Em seguida, descarte a mistura de água sanitária e enxágue bem o frasco com água.

Adicione o sabão com água, esfregue com uma escova muito bem, enxágue com mais água. E então o passo final é enxaguar os vidros com a água DI na torneira à direita. Lave os frascos de vidro o mais rápido possível, esfregue bem os vidros.

As células Sf9 deixarão essa borda de células mortas se não forem esfregadas corretamente. Use esses frascos apenas para cultura de células, vidro de cultura de células em autoclave em vez de enviá-lo para uma instalação de lavagem de vidro. Utilizar o ciclo de vácuo na autoclave por 40 minutos de tempo esterilizado e 40 minutos de tempo seco.

Mantenha-o separado dos utensílios de vidro na área principal do laboratório. Organizar a sala de cultura de células de modo que todos os suprimentos estejam localizados em uma área, minimizando assim a necessidade de os membros do laboratório saírem da sala de cultura de células em busca de suprimentos. Rotular quaisquer garrafas de plástico usadas para colher células e reutilizadas em cultura de células posteriormente, apenas para uso em cultura de células.

Use os frascos de cultura celular designados para um tipo de célula específico. Guarde esses frascos na sala de cultura celular para facilitar o acesso. Para culturas que são cultivadas em suspensão, o mofo será reconhecido como bolas flutuantes na mídia.

Quanto à contaminação bacteriana, ela tornará a mídia branca e turva. Da mesma forma, para células aderentes, a contaminação por mofo pode ser facilmente reconhecida como manchas difusas. A contaminação bacteriana tornará o meio normalmente claro, branco e turvo.

Muitas espécies de micoplasma podem ser identificadas de forma confiável usando um ensaio baseado em PCR. A faixa à esquerda mostra os padrões de peso molecular para o DNA. As quatro faixas à direita são controles positivos.

Não aparecem bandas nos tipos celulares testados porque o micoplasma não foi detectado. O meio de cultura celular mudará de cor de vermelho para amarelo se os indicadores de pH estiverem presentes. A cor amarela indica que o pH está baixo e o meio deve ser substituído.

Se outros crescimentos ou formas de células são observados sob o microscópio de luz durante a realização de contagens de células, então isso pode ser um indicador de contaminação. Note-se que uma limpeza completa do hemocitômetro deve ser feita antes da contagem celular, pois esse tipo de detrito pode estar presente apenas no hemocitômetro e não na cultura celular em si. Embora a contaminação seja uma das principais preocupações ao realizar o trabalho de cultura de células, esses riscos podem ser mitigados seguindo as práticas e técnicas descritas neste vídeo.

Se um teste mensal de micoplasma é realizado todos os meses, o pessoal do laboratório é treinado anualmente e essas práticas são rigorosamente cumpridas, então suas células permanecerão saudáveis e livres de contaminação. Isso também ajudará a reduzir os custos associados à compra de meios de cultura de células caros, à compra de novas células e reduzirá o tempo de inatividade de descontaminação da incubadora. Lembre-se, a chave para o sucesso da cultura celular é a ação precoce, a fim de evitar a contaminação em primeiro lugar.