Name: Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a rastrear células neurais transplantadas em organoides cerebrais humanos usando NPCs derivadas de iPSCs. Este protocolo permite avaliação de longo prazo da enxertia celular in vitro para terapias neurológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os fundos para este trabalho foram fornecidos através dos fundos filantrópicos IRIC da fundação Marcelle e Jean Coutu e do Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. tem apoio salarial da FRQS na forma de uma bolsa Chercheurs-boursiers Junior 1 (#283502). M.I.I.R. foi apoiado por um IRIC Doctoral Award do Institut of Research in Immunology and Cancer, um Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat da Universidade de Montreal, e Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Dado o significativo interesse em abordagens terapêuticas celulares para o tratamento de lesões do SNC/doenças neurodegenerativas1,2,3,4,5,6,7,8, modelos de função celular em ambiente de transplante vêm ganhando importância. Este trabalho apresenta um método para o transplante de NPCs humanas marcadas em organoides cerebrais humanos, juntamente com seu rastreamento de células vivas e avaliação de desfecho por histologia e coloração por imunofluorescência. É importante ressaltar que mostramos que as células transplantadas foram capazes de migração, diferenciação e persistência a longo prazo (4 meses) no ambiente organoide. Essa persistência em longo prazo representa um aumento acentuado em relação à mantenabilidade das culturas de fatias cerebrais17. Esse sistema é, portanto, apropriado para examinar muitos dos comportamentos que seriam necessários avaliar em um cenário terapêutico potencial, como sobrevivência, proliferação e diferenciação. De fato, um estudo ortogonal demonstrou recentemente que NPCs transplantados se comportaram de forma semelhante em organoides cerebrais em comparação com NPCs transplantados em cérebros de camundongos NSG20, confirmando assim a utilidade dos organoides como receptor de transplante. Como este é um sistema in vitro, também é simples adicionar citocinas ou drogas de interesse. Isso poderia ser usado para entender melhor os efeitos de ambientes específicos, como inflamação e imunossupressores, nas células transplantadas para imitar ainda mais o que elas podem encontrar em um ambiente terapêutico. O protocolo de imunofluorescência cíclica que demonstramos (baseado em pesquisas anteriores21) amplia ainda mais o poder dessa abordagem, permitindo que uma ampla gama de marcadores específicos de linhagem e, potencialmente, doença-específicos sejam avaliados simultaneamente em um único corte e, assim, permitindo o rastreamento preciso das células transplantadas e seu impacto no tecido. Naturalmente, outros métodos de avaliação de desfechos poderiam ser usados em vez disso, dependendo dos objetivos da análise. Por exemplo, a limpeza tecidual com reconstrução 3D poderia ser usada se a morfologia celular for de interesse primário, ou a dissociação seguida de citometria de fluxo poderia ser usada se a quantificação de tipos celulares específicos for o objetivo final. Esperamos que este método seja facilmente extensível a outros tipos celulares, como os tumores do SNC, potencialmente permitindo seu estudo em um contexto microambientalmente relevante. Da mesma forma, os organoides utilizados como receptores poderiam ser trocados por organoides modelo de doença25,26,27, potencialmente permitindo a modelagem de abordagens de transplante para essas condições.
Como acontece com todos os modelos, o apresentado aqui também tem suas próprias limitações. Por um lado, os organoides derivados da iPSC são imaturos no desenvolvimento19 e, portanto, apresentam diferenças importantes em relação ao cérebro envelhecido, no qual muitas doenças neurodegenerativas se manifestam. Os organoides cerebrais também não são uniformes no desenvolvimento19, impossibilitando a injeção consistente no mesmo nicho fisiológico exato. Além disso, embora contenham os tipos celulares das regiões cerebrais relevantes18,19, eles carecem dos componentes endotelial, microglial e imunológico, que também são importantes no cenário in vivo 14. Isso limita o estudo de como o hospedeiro reagirá ao transplante celular. Atualmente, estão sendo disponibilizadas técnicas para adicionar células vasculares28 e microgliais29, bem como aumentar a consistência organoide e regionalização18, melhorando assim o poder de modelagem do sistema de transplante organoide. Eles exigiriam, no entanto, mais testes e otimização além do que é apresentado aqui. Embora esse protocolo seja de baixo custo e não necessite de equipamentos especializados, ainda há uma série de considerações técnicas importantes - a profundidade de injeção, por exemplo. Isso se deve ao fato de que os organoides não são perfundidos e, portanto, muitas vezes têm um centro necrótico se crescerem muito grandes19 e que a luz não pode penetrar através do núcleo organoide para rastreamento de células vivas. Assim, as células que foram injetadas muito profundamente e colônias que migraram para dentro podem ser perdidas. Embora isso possa ser amenizado pelo uso de fluoróforos de comprimento de onda mais longo com melhor penetrância tecidual30, dependendo do tamanho do organoide e do aparelho de detecção, isso provavelmente permanecerá uma consideração. Finalmente, como os organoides cerebrais estão em um estado de desenvolvimento, o momento do transplante é outra consideração fundamental, pois o ambiente provavelmente será diferente dependendo do estágio de desenvolvimento do organoide no qual ele é injetado. Embora isso possa ser controlado até certo ponto, garantindo uma idade organoide consistente no momento da injeção, é, sem dúvida, um fator que precisa ser considerado.
Esse protocolo é barato, simples, livre de animais e não requer equipamentos especializados, tornando a modelagem de transplantes acessível a uma maior variedade de laboratórios. Com o rápido avanço tanto na terapêutica de células neurais quanto em sistemas de modelos organoides, antecipamos que o protocolo de transplante de organoides aqui apresentado será um modelo útil para uma variedade de doenças e abordagens terapêuticas.

O cérebro humano é um órgão complexo composto por múltiplos tipos celulares das linhagens neural e glial. Juntos, eles formam uma rede sofisticada que dá origem à cognição. Há um interesse significativo no transplante de células para esse sistema como tratamento para uma ampla variedade de distúrbios neurológicos, incluindo traumatismo cranioencefálico (TCE)1,2, doenças neurodegenerativas3,4,5,6,7 e acidente vascular cerebral8. Uma grande limitação no avanço de tais estratégias, no entanto, é a relativa escassez de modelos pré-clínicos disponíveis para determinar os resultados esperados do transplante. Os modelos mais utilizados atualmente são os métodos de cultivo in vitro para determinação do potencial celular e xenotransplante em camundongos. Embora os métodos de cultura celular possam avaliar a diferenciação e o potencial de auto-renovação9, estes são realizados sob condições ótimas de crescimento que não mimetizam o microambiente que as células encontrariam em um contexto de transplante. Além disso, a forma como as células são cultivadas pode influenciar seu comportamento10.
Cérebros de camundongos contêm todas as células do microambiente e são, portanto, sistemas modelo extremamente poderosos para transplante11. Há, no entanto, diferenças importantes entre o córtex de camundongo e humano12,13, e nem todos os fatores de crescimento reagem de forma cruzada entre as espécies. Modelos de primatas são uma alternativa mais próxima que mimetiza melhor o sistema humano e também têm produzido resultados pré-clínicos importantes14. Mesmo esses parentes mais próximos, no entanto, mantêm diferenças importantes em sua composição celular15. Embora ambos os sistemas-modelo forneçam informações valiosas sobre o comportamento celular durante o transplante e incorporem os elementos cirúrgicos de uma eventual terapia, eles permanecem imperfeitos. Eles também são caros e tecnicamente desafiadores (ou seja, deve-se realizar uma cirurgia cerebral nos animais), limitando assim o rendimento possível. Além disso, há uma infinidade de questões éticas associadas ao transplante de células cerebrais humanas em animais16. As culturas de fatias cerebrais permitem que um cérebro seja cortado e usado para múltiplos tratamentos, removendo assim algumas das limitações dos transplantes de animais; no entanto, estes têm vida útil limitada (semanas), ainda são derivados de animais e (sendo uma fatia fina) não têm volume/integridade de superfície suficiente para mimetizar a injeção de células17. Assim, permanece uma importante lacuna entre modelos estritamente de cultura celular/potencial e transplante in vivo.
Os organoides cerebrais são um modelo in vitro contendo os principais tipos de células neurais presentes no cérebro e podem ser gerados em grande número a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs)18,19. Tais organoides fornecem, assim, um contexto celular, que poderia permitir a avaliação da capacidade funcional de uma célula-teste de interesse no cenário do transplante. De fato, um estudo recente demonstrou que as células progenitoras neurais (NPCs) transplantadas em organoides cerebrais humanos sobrevivem, proliferam e se diferenciam de forma semelhante às NPCs transplantadas no cérebro de um camundongo com anemia imunodeficiente combinada (NSG)20. Os organoides cerebrais representam, portanto, um sistema livre de crueldade, de vida longa (>6 meses), econômico que captura os tipos celulares do cérebro humano. Como tal, eles poderiam representar um receptor de transplante ideal para o teste em estágio inicial da capacidade regenerativa das células neurais.
Este trabalho apresenta um protocolo para o transplante e posterior rastreamento de NPCs humanas marcadas em organoides cerebrais humanos (Figura 1). Isso começa com a injeção de NPCs marcados com GFP em organoides cerebrais maduros (2-4 meses de idade)18. As células transplantadas são seguidas por microscopia de fluorescência de células vivas durante um período de 4 meses. Durante esse tempo, mostramos tanto a persistência das células no local da injeção quanto a migração para regiões distais do organoide. Ao final, demonstramos a recuperação, coloração e imagem antigênica de cortes histológicos derivados desses organoides, incluindo um protocolo para a têmpera de corantes existentes à base de AlexaFluor para permitir rondas adicionais de coloração e imagem, com base em trabalhos anteriores21. Esse protocolo poderia, portanto, ser útil na mensuração da capacidade de diferenciação de células em um ambiente de transplante, durabilidade do enxerto, expansão celular in situ e migração celular do local do transplante. Prevemos que isso será útil tanto para aplicações de medicina regenerativa/terapia celular, bem como modelagem tumoral por enxertia de células tumorais em organoides específicos de região relevantes.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>mistura de enzimas proteolíticas-colagenolíticas</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP (clone SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2)</td> <td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulina &beta; 3 (TUBB3) (clone TUJ1)</td> <td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Cítrico Monohidratado</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek-Álcool</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>etílico desnaturado (anidro)</td> <td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12 / Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sulfoxide (DMSO), Estéril</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fator de Crescimento Reduzido (TFG)</td><td>Corning</td><td>356231</td> Fenol Lâmina de micrótomo MX35 <td>livre, livre de LDEV</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina Dicloridrato</td><td>Thermo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de ROCK Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Moldes de Base de Aço Inoxidável</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE de Processamento/Incorporação de Biópsia</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Diferenciação de Neurônios do Prosencéfalo STEMdiff</td><td>StemCell Technologies</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Progenitor Neural Médio</td><td>StemCell Technologies</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Kit de Indução Neural</td><td>StemCell Technologies</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Preparação</td><td></td></tr> de <tr><td>Tecidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6&nbsp; Processador de tecidos AI</td><td>Sakura Finetek-Tolueno</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(histológico)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blue; 0,4% (peso / vol)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo organoide cerebral humano de transplante de células neurais

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

O avanço das abordagens de transplante de células requer sistemas modelo que permitam uma avaliação precisa da potência funcional das células transplantadas. Para o sistema nervoso central, embora o xenotransplante permaneça no estado da arte, tais modelos são tecnicamente desafiadores, limitados em rendimento e caros. Além disso, os sinais ambientais presentes não reagem perfeitamente de forma cruzada com as células humanas. Este artigo apresenta um modelo barato, acessível e compatível com alto rendimento para o transplante e rastreamento de células neurais humanas em organoides cerebrais humanos. Esses organoides podem ser facilmente gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando kits comerciais e contêm os principais tipos de células do cérebro. 
Primeiramente demonstramos esse protocolo de transplante com a injeção de células progenitoras neurais (NPCs) humanas marcadas com iPSC marcadas com EGFP nesses organoides. Em seguida, discutimos considerações para rastrear o crescimento dessas células no organoide por microscopia de fluorescência de células vivas e demonstramos o rastreamento de NPCs transplantadas marcadas com EGFP em um organoide durante um período de 4 meses. Finalmente, apresentamos um protocolo para seccionamento, coloração por imunofluorescência cíclica e imagem das células transplantadas em seu contexto local. O modelo de transplante organoide aqui apresentado permite o rastreamento em longo prazo (pelo menos 4 meses) de células humanas transplantadas diretamente em um microambiente humano com um protocolo barato e de simples execução. Representa, portanto, um modelo útil tanto para terapias de células neurais (transplantes) como, provavelmente, para modelar tumores do sistema nervoso central (SNC) de forma mais precisa do ponto de vista microambiental.

Como validação da identidade organoide cerebral, cortes histológicos de um organoide cerebral maduro (2 meses de idade) foram corados para PAX6 (um marcador de NPCs dorsais23) e SATB2 (um marcador de neurônios maduros, pós-mitóticos da camada superior24). Como esperado, as células PAX6+ estavam presentes no interior do organoide e as células SATB2+ nas camadas superiores (Figura 2). Estes resultados suportam que os organoides cerebrais utilizados eram, de fato, prosencéfalo dorsal, conforme especificado no kit de diferenciação. Para estabelecer a dose-dependência do sistema de transplante organoide cerebral, organoides cerebrais de 2 meses de idade foram injetados com um número crescente de NPCs derivados do EGFP+ iPSC. Uma clara dependência da fluorescência da GFP com a fluorescência da GFP no número de células de entrada estava presente, com detecção consistente do adesivo de EGFP+ em 10.000 células ou acima (Figura 3). A persistência e a migração das NPCs transplantadas foram avaliadas em seguida, acompanhando-se os organoides transplantados ao longo do tempo. Para isso, 50.000 NPCs EGFP+ derivados de iPSC foram transplantados em organoides cerebrais de 2-3 meses de idade gerados a partir da mesma linhagem iPSC. Os organoides injetados e os controles foram imageados para positividade do EGFP nos momentos indicados nos próximos 3-4 meses. Nesta série de transplantes, observamos persistência do local injetado durante todo o período de rastreamento de 4 meses (Figura 4A). Placas adicionais de células EGFP+ apareceram até 9 dias após o transplante e persistiram até o final do estudo (3-4 meses, dependendo do organoide), indicando a migração das células e integração em seus novos locais (Figura 4A). Em uma ampliação maior, observou-se morfologia neural clara com projeções longas para dentro do organoide (Figura 4B), confirmando a integração das células injetadas.
Para determinar o status de diferenciação das células injetadas no final da injeção, o organoide rastreado por 4 meses e seu controle foram fixados, incluídos em parafina, cortados em cortes de 15 μm de espessura e montados em lâminas de vidro. Os cortes foram então processados e corados em uma única rodada de coloração fluorescente (EGFP, TUJ1, NESTIN) ou por dois ciclos consecutivos de coloração para adicionar marcadores adicionais (MAP2, GFAP). A coloração inicial de rodada única confirmou a presença de células EGFP+ no local da injeção, incluindo uma mistura de células retendo o status NPC (NESTIN+TUJ1−) e aquelas que se diferenciaram para um destino neural (NESTIN−TUJ1+) (Figura 5). Tanto para os organoides controle quanto para os injetados, muito poucos NPCs NESTIN+ foram observados (a maioria, embora não todos sendo NPCs transplantados com EGFP+ no local da injeção), com a maioria dos neurônios TUJ1+ imaturos-maduros (Figura 5). A coloração de duas rodadas forneceu mais detalhes, revelando neurônios maduros (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) ao redor da maior parte da região externa do organoide, com áreas de neurônios imaturos (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) em direção ao meio (Figura 6A,B). Astrócitos (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) estavam presentes nos organoides injetados e controle e foram intercalados ao redor das bordas externas (Figura 6A,B). O corte para o qual a coloração de dois rounds foi realizada no organoide injetado mostrou uma pequena colônia satélite de células EGFP+ distante do local da injeção que adotou o fenótipo de neurônios maduros (Figura 6B,C). Alguns deles pareciam estar próximos aos astrócitos; no entanto, não havia células EGFP+ com sobreposição completa à coloração GFAP, sugerindo que elas eram adjacentes em vez de gerar os astrócitos propriamente ditos (Figura 6B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Figura 1: Modelo de transplante de células marcadas em organoides cerebrais. Visão geral esquemática da geração de células marcadas por transdução lentiviral, seu transplante em organoides cerebrais e rastreamento por imagem de células vivas e imunofluorescência. Abreviação: GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Figura 2: Imunofluorescência dos cortes histológicos mostrando a arquitetura dos organoides precoce e tardio. Um organoide cerebral com 2 meses de idade foi fixado, incluído em parafina, fatiado e corado com PAX6, SATB2 e DAPI. Um corte não corado foi usado para definir o tempo de exposição e integração para evitar um sinal falso-positivo de autofluorescência. As células PAX6+ estavam presentes no interior do organoide, enquanto as células SATB2+ estavam presentes nas camadas superiores. Imagens Z-stack foram obtidas a cada 4,2 μm através de todo o corte de tecido de 15 μm. As seções ópticas foram combinadas usando a opção de empilhamento de foco no software Gen5 com opções padrão. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: PAX6 = proteína caixa 6 pareada; SATB2 = proteína especial de ligação à sequência AT-rica em AT; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Figura 3: Enxertia dose-dependente de NPCs em organoides cerebrais. Os organoides foram transplantados com 0 (controle negativo), 1.000, 5.000, 10.000 ou 50.000 NPCs derivados de GFP+ iPSC. 1 semana após o transplante, os organoides foram fotografados em um Cytation 5 com um cubo de filtro de GFP. O controle negativo foi utilizado para definir o tempo de exposição e integração para minimizar a autofluorescência. Cores mais escuras indicam mais fluorescência EGFP em relação ao controle negativo. Barras de escala = 100 μm. Estas são imagens 4x de todos os organoides. Após a obtenção de imagens, a subtração de fundo da bola rolante com um raio de pixel de 50 foi realizada antes da exibição para corrigir a intensidade de fundo variável nos organoides. Os locais de injeção identificados como as regiões de maior enxertia são indicados com uma seta vermelha onde a enxertia estava presente. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; GFP = proteína fluorescente verde; FEGP = GFP reforçada; iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Figura 4: Rastreamento do crescimento, migração e persistência de células vivas transplantadas com imagens de células vivas fluorescentes. (A) Organoides de controle e transplantados (50.000 NPCs derivados de GFP+ iPSC) foram seguidos por imagens de células vivas de fluorescência ao longo de 2-4 meses a partir de dois conjuntos de transplantes independentes. Organoides de controle negativo foram usados para definir o tempo de exposição e integração para minimizar a autofluorescência em cada ponto de tempo. As imagens de EGFP foram capturadas usando um cubo de filtro de GFP no Cytation 5 nos horários indicados após o transplante. Cores mais escuras indicam mais fluorescência EGFP em relação ao controle negativo para aquele ponto de tempo. A subtração de fundo da bola rolante com um raio de pixel de 50 foi realizada antes da exibição para corrigir a intensidade de fundo variável nos organoides. Os organoides foram colocados aproximadamente na mesma orientação em cada momento, e as imagens foram giradas para consistência do display e para mostrar claramente o crescimento celular transplantado. Os locais de injeção identificados como as regiões de maior enxertia no momento mais precoce são indicados com uma seta vermelha. Um exemplo de organoide de controle negativo é mostrado na parte inferior da figura. (B) Exemplo de imagens 20x de organoides enxertados na semana 1 e na semana 15 pós-transplante. O contraste local foi melhorado antes da exibição usando FIJI para garantir a visibilidade do neurito. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; GFP = proteína fluorescente verde; FEGP = GFP reforçada; iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Figura 5: Imunofluorescência dos cortes histológicos revelando a persistência das NPCs transplantadas no local da injeção, com migração e diferenciação neural. Imagens de fluorescência de canal único de organoides (A) não injetados e (B) transplantados. A imagem sobreposta à direita mostra os três canais de interesse (NESTIN, TUJ1 e EGFP), mas não inclui DAPI. Os mínimos de exibição foram ajustados para apenas excluir o sinal das células negativas (determinado para EGFP do controle não injetado e para outros canais com base em combinações de marcadores conhecidos). Os máximos de exibição foram baseados no sinal mais alto observado para esse anticorpo em qualquer célula. Os intervalos de exibição foram mantidos constantes entre os organoides não injetados e transplantados para permitir a comparação direta. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: NPCs = células progenitoras neurais; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína fluorescente verde reforçada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Figura 6: Avaliação do estado de diferenciação e localização das células enxertadas por imunofluorescência cíclica dos cortes histológicos. Imagens de fluorescência de canal único dos organoides não injetados, (A) pareados por idade e (B) transplantados são mostradas para a primeira e segunda rodada de coloração, conforme indicado. Os mínimos de exibição foram ajustados para apenas excluir o sinal das células negativas (determinado para EGFP do controle não injetado e para outros canais com base em combinações de marcadores conhecidos). Os máximos de exibição foram baseados no sinal mais alto observado para esse anticorpo em qualquer célula. Os intervalos de exibição (e, claro, os parâmetros de imagem) foram mantidos constantes entre os organoides controle e injetados para permitir a comparação direta. Barras de escala = 100 μm. Uma imagem sobreposta (excluindo DAPI) é mostrada para cada rodada de coloração para cada organoide à direita. (B) Para o organoide injetado onde foi realizado o registro das imagens, todas as imagens são recortadas para a região observada em ambas as rodadas de coloração. (B,C) Para o organoide injetado, as regiões celulares do EGFP+ são delineadas em azul. Um diagrama de como o DAPI é usado para corresponder aos recursos durante o registro da imagem é mostrado em (C), seguido por uma mesclagem geral da imagem registrada. Abreviações: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = tubulina beta-III; EGFP = proteína fluorescente verde reforçada; MAP2 = proteína 2 associada aos microtúbulos; GFAP = proteína glial fibrilar ácida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Clone</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Concentração</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTINA</td>
			<td>10C2</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 em 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 em 2.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFP</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 em 200</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 em 500</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1 em 1.000</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>O18-1330</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1 em 100</td>
		</tr><tr><td>Anti-SATB2</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1 em 500</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Concentrações de anticorpos para coloração. Abreviações: TUBB3 = beta-tubulina III; GFP = proteína fluorescente verde; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; MAP2 = proteína 2 associada aos microtúbulos; PAX6 = proteína caixa 6 pareada; SATB2 = proteína especial de ligação à sequência AT-rica em AT.

Aqui, descrevemos um protocolo para o transplante e rastreamento de células neurais marcadas em organoides cerebrais humanos.

Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Com o crescente interesse em terapias celulares, novos métodos para avaliar a funcionalidade dessas células são necessários. Este protocolo permite a avaliação in vitro a longo prazo da enxertia celular em um contexto neural. As principais vantagens desta técnica é que todos os componentes vêm de origem humana.Além disso, o enxerto pode ser facilmente rastreado, e o ambiente do organoide pode ser facilmente alterado, o que permite testar diferentes drogas ou tipos de tratamentos. Quem demonstrará essa técnica será Iliana Ibanez, uma talentosa aluna de doutorado em meu laboratório. Comece removendo a suspensão de célula única de células-tronco pluripotentes induzidas ou células progenitoras neurais derivadas de iPSC, ou NPCs, do gelo e centrifugando-as a 300g por cinco minutos a 4 graus Celsius.Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 3 miligramas por mililitro de matriz de membrana basal solubilizada para obter um volume final de dois microlitros por injeção. Coloque imediatamente a suspensão de volta no gelo até o uso. Transfira a seringa pré-refrigerada do congelador de 20 graus Celsius para um balde de gelo para uso posterior.Em seguida, remova a placa organoide cerebral da incubadora e transfira o organoide para um prato de 35 milímetros usando uma ponta de furo largo. Para estabilizar os organoides e facilitar a injeção, remova o meio tanto quanto possível sem danificar o organoide. Coloque a placa de 35 milímetros contendo o organoide sob um microscópio dissecante para facilitar a injeção.Quando os organoides estiverem prontos para injetar, ressuspenda suavemente as células NPC marcadas com EGFP usando uma ponta de pipeta P20 resfriada e mova dois microlitros dessas células para uma lâmina de vidro estéril pré-refrigerada. Pegue uma seringa de insulina pré-cheia do gelo e retire lentamente os 2 microlitros de suspensão celular com o bisel da agulha virado para baixo. Abra a tampa da placa que contém o organoide antes de focar o microscópio nele.Segure o prato com uma mão, coloque o bisel da agulha para cima. E com a outra mão, injetar a célula lentamente na superfície organoide. Depois de injetar as células, coloque a tampa de volta no prato e incube o organoide injetado por um a dois minutos.Em seguida, adicione suavemente 500 microlitros do meio organoide à placa antes de transferir o organoide para uma placa de 24 poços com uma ponta de furo largo. Incubar o organoide a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com uma mudança completa do meio a cada dois dias. Coloque um organoide de controle negativo ou não injetado em um microscópio de fluorescência.E defina a intensidade de iluminação entre 1 e 2 e o tempo de exposição entre 80 e 100 milissegundos para autofluorescência mínima. Em seguida, carregue o organoide de controle positivo e aumente o tempo de exposição para garantir que as células marcadas sejam visíveis. Reposicione o organoide com uma ponta de pipeta de furo largo para encontrar a proteína fluorescente verde reforçada ou a região EGFP plus para injeção.Retire completamente o meio do organoide antes de carregar o organoide. E crie uma imagem com as configurações selecionadas. Quando a imagem estiver completa, adicione imediatamente um meio fresco para evitar que o organoide seque.Depois de repetir a remoção do meio e imagem para todos os organoides, retornar os organoides à incubação normal e mudanças do meio. Repita a imagem nos intervalos desejados. Coloque a lâmina em um frasco de coloração Coplin cheio de tolueno por dois minutos e repita esta etapa.Em seguida, transfira a lâmina de vidro para um frasco de coloração de lâmina Coplin de vidro preenchido com álcool etílico a 100% por dois minutos. E repita este passo antes de transferir a lâmina para um frasco Coplin cheio de água por dois minutos. Repita a lavagem com água.Em seguida, coloque um recipiente plástico no banho-maria, garantindo que o plástico não toque no fundo do banho. Despeje o tampão citrato dentro do recipiente plástico e deixe atingir 95 a 100 graus Celsius. Assim que o tampão atingir a temperatura desejada, coloque as lâminas dentro do tampão e cubra o recipiente com uma tampa, deixando as lâminas dentro do banho-maria por 30 a 40 minutos.Após a incubação, retire o recipiente plástico do banho-maria e deixe esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos. Lave as lâminas três vezes por dois minutos cada com PBS. Remova o PBS com um lenço de papel sem tocar na amostra.Prepare o tampão de permeabilização e encha um frasco de coloração de lâmina de vidro com ele. Imergir as lâminas no tampão de permeabilização e incubar por 10 minutos. Repita três lavagens de PBS por dois minutos cada.Em seguida, prepare a mistura de coloração para cobrir cada amostra e adicione 25 microlitros à lâmina organoide antes de incubar a lâmina à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, repita três lavagens de PBS por dois minutos cada, e remova os sais enxaguando a lâmina com água destilada dentro de um frasco de coloração de lâmina de vidro. Em seguida, adicione 10 microlitros de líquidos e DAPI a cada amostra antes de obter imagens da lâmina usando o microscópio de fluorescência.Para o frasco de coloração Coplin de vidro preenchido no meio do caminho com tampão de têmpera 2X, adicione 45 mililitros de PBS e coloque as lâminas dentro deste frasco. Incube o frasco durante a noite a 4 graus Celsius. Use microscopia de fluorescência para verificar se os fluoróforos foram efetivamente extintos antes de repetir a coloração e a imagem.Uma clara dependência da dose de fluorescência de GFP estava presente no número de células de entrada, com detecção consistente de EGFP mais adesivo celular em 10.000 células e acima. Os organoides injetados e controles com imagem positiva para EGFP mostraram a persistência do local injetado durante todo o período de rastreamento de quatro meses. Adesivos celulares adicionais positivos para EGFP apareceram nove dias após o transplante e persistiram até o desfecho do estudo, indicando a migração das células e integração em seus novos locais.Em uma maior magnificação, observou-se morfologia neural clara com projeções longas no organoide, confirmando a integração das células injetadas. A coloração inicial de rodada única confirmou a presença de células EGFP plus no local da injeção, incluindo uma mistura de células que retêm o status NPC, e aquelas que se diferenciaram em direção a um destino neural. Para os organoides controle e injetados, muito poucos Nestin mais NPCs foram observados, com a maioria de TUJ1 mais neurônios maduros imaturos.A coloração de duas rodadas deu mais detalhes, revelando neurônios maduros ao redor da maior parte da região externa do organoide, com áreas de neurônios imaturos em direção ao meio. Astrócitos estavam presentes nos organoides injetados e controle, e foram intercalados ao redor das bordas externas. O corte para o qual a coloração de duas voltas foi realizada no organoide injetado mostrou uma pequena colônia satélite de EGFP mais células distantes do local da injeção que adotaram o fenótipo de neurônios maduros.Algumas dessas colônias parecem estar próximas aos astrócitos. No entanto, nenhum EGFP mais células com sobreposição completa à coloração GFP sugeriu que elas eram adjacentes em vez de gerar os próprios astrócitos. Quando você está injetando o organoide é que você tem que evitar aplicar muita força ou fazê-lo muito rápido, como você pode destruir o organoide completamente.Assim, após o rastreamento da vida, os organoides podem ser associados e usados para análise de citometria de fluxo ou abordagens de sequenciamento de célula única. Isso nos permitirá conhecer o estado molecular das células. Essa técnica pode ser extremamente útil para o avanço da terapia celular para doenças neurodegenerativas, inclusive para a modelagem de tumores cerebrais ou metástases.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Palma-Tortosa, S., et.al. Culturas organotípicas do córtex humano adulto como um modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o transplante de células-tronco progenitoras neuronais derivadas de células-tronco em fatias de tecido cortical humano. O procedimento envolve isolar e ressuspender células progenitoras em uma matriz de membrana basal, seguida por sua injeção em uma fatia cortical colocada em um conjunto transwell.

Transplante de progenitores neuronais derivados de células-tronco em fatias corticais humanas

Fonte: Ibanez-Rios, M.I., et al., Um Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra a injeção de células progenitoras neurais (NPCs) marcadas com fluorescência em organoides cerebrais humanos usando uma mistura de matriz celular. O método é reprodutível e livre de animais, permitindo o transplante com o mínimo de ruptura organoide. Ele oferece uma plataforma valiosa para modelar transplantes neurais e doenças do sistema nervoso...

Injeção de células progenitoras neurais fluorescentes em organoides cerebrais humanos para modelagem de transplante

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Este estudo introduz e descreve protocolos para derivar dois organóides neurais humanos específicos como um modelo relevante e exato para estudar 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro dos organóides neural humanos exclusivamente nos seres humanos e 2) neurônio dopaminérgicos diferenciação, gerando um organoide tridimensional.

Organóides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Este protocolo descreve culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto combinadas com transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas, que apresentam uma nova metodologia para testar ainda mais terapias baseadas em células-tronco para distúrbios neurodegenerativos humanos.

Culturas organotípicas do córtex humano adulto como modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.

Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda a rastrear células neurais transplantadas em organoides cerebrais humanos usando NPCs derivadas de iPSCs. Este protocolo permite avaliação de longo prazo da enxertia celular in vitro para terapias neurológicas.

Modelo Organoide Cerebral Humano de Transplante de Células Neurais

Explorar mais vídeos