Name: Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a expandir e manipular geneticamente células-tronco hematopoéticas de camundongos ex vivo usando cultura à base de álcool polivinílico. Este método permite estudos longitudinais de hematopoiese com eficiência de transdução de aproximadamente 30%.

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Agradecemos ao WIMM Flow Cytometry Core pelo acesso à citometria de fluxo e ao WIMM Virus Screening Core pela geração do vetor lentiviral. Este trabalho foi financiado pelo Kay Kendall Leukaemia Fund e pelo UK Medical Research Council.

Todos os procedimentos com animais, incluindo a criação e a eutanásia, devem ser realizados dentro das diretrizes institucionais e nacionais. Os experimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Ministério do Interior do Reino Unido. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.
1. Preparação de soluções de estoque
<ol><li>Solução de estoque PVA<ol><li>Tomar 50 mL de água de qualidade para cultura de tecidos em uma pequena garrafa de vidro (adequada para autoclavagem). Aqueça a água até quase ferver no micro-ondas.</li>
		<li>Pesar 5 g de pó de PVA e adicionar à água. NOTA: Recomenda-se dissolver apenas 1-5 g de PVA. Dissolver quantidades maiores pode resultar em reconstituição incompleta.</li>
		<li>Feche bem a tampa e agite para misturar. Em seguida, solte a tampa. NOTA: Tenha cuidado ao reabrir, pois a pressão pode mudar devido à mudança de temperatura da água.</li>
		<li>Autoclave e deixe esfriar. Feche bem a tampa e agite para misturar. Faça alíquotas em tubos estéreis e armazene por até 3 meses a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissolver citocinas liofilizadas em meio F-12 contendo 1 mg/mL de PVA. Reconstituir o fator de células-tronco para 10 μg/mL e a trombopoietina para 100 μg/mL para gerar estoques de 1:1.000. Faça alíquotas em tubos estéreis e armazene a longo prazo a -80 °C. Como alternativa, guarde as alíquotas a 4 °C por até 1 semana. NOTA: Evitar a reconstituição de citocinas na albumina do soro bovino devido ao impacto negativo na expansão da HSC em camundongos.</li>
</ol>2. Extração de medula óssea por HSC e enriquecimento com c-Kit+
<ol><li>Disseque os fêmures, tíbias, pelve e coluna vertebral de camundongos C57BL/6 recém-eutanasiados com 8-12 semanas de idade (via asfixia por CO2 e/ou luxação cervical) e coloque os ossos em PBS sobre gelo. NOTA: Certifique-se de que as superfícies e ferramentas estão esterilizadas com etanol 70%.</li>
	<li>Limpe os ossos usando lenços de tarefas delicadas sem fiapos, removendo o músculo e a medula espinhal, e adicione a uma argamassa com ~3 mL de PBS. NOTA: Certifique-se de que o pilão e a argamassa sejam esterilizados com etanol 70% e depois lavados uma vez com PBS.</li>
	<li>Esmague os ossos com o pilão sem moer para minimizar as forças de cisalhamento. Quebrar grandes fragmentos de medula óssea liberados no PBS usando uma agulha de 19 G acoplada a uma seringa de 5 mL. Transferir a suspensão celular através de um filtro de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Uma vez transferida a suspensão, repita com PBS fresco até que os ossos estejam branqueados e nenhuma medula seja visível. Procure um volume final de ~30 mL por camundongo e ~50 mL para dois camundongos.</li>
	<li>Misturar as células da medula óssea, coletar 10 μL de células e contar usando solução de Türks em uma diluição de 1:10-1:20 com um hemocitômetro. NOTA: Espera-se que um camundongo produza 2-5 ×10 8 células inteiras da medula óssea.</li>
	<li>Girar a 450 × g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS frio (350 μL para um camundongo ou 500 μL para dois camundongos).</li>
	<li>Adicionar 0,2 μL de anticorpo anti-c-Kit aloficocianina (APC) por 10 milhões de células e incubar durante 30 minutos no escuro a 4 °C.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de PBS frio às células incubadas para lavar o excesso de anticorpos e filtrar através de um filtro de 50 μm para um tubo cônico fresco de 15 mL.</li>
	<li>Lave o tubo original com 7 mL de PBS frio e transfira através do filtro. Se ocorrer entupimento do filtro, risque a superfície do filtro com uma ponta P1000.</li>
	<li>Girar a 450 × g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS frio (350 μL para um camundongo ou 500 μL para dois camundongos).</li>
	<li>Adicionar 0,2 μL de microesferas anti-APC por 10 milhões de células e incubar por 15 min no escuro a 4 °C. Adicione 12 mL de PBS estéril para lavar o excesso de microesferas.</li>
	<li>Gire as células a 450 × g por 5 min a 4 °C e ressuspenda em 2 mL de PBS frio. Enquanto as células estiverem girando nesta etapa, prossiga para a etapa 2.13.</li>
	<li>Prepare-se para o enriquecimento da coluna colocando uma coluna de filtração magnética no ímã de um separador de coluna magnética, com um filtro de 50 μm na parte superior e um tubo cônico de 15 mL abaixo.</li>
	<li>Executar 3 mL de PBS estéril através do filtro de 50 μm e da coluna de filtração. Uma vez que o PBS tenha passado, passe a suspensão celular através da coluna, seguido de três lavagens de 3 mL de PBS frio de cada vez. Para cada lavagem, espere a coluna parar de pingar antes de adicionar a próxima lavagem.</li>
	<li>Retire a coluna do ímã e coloque-a em cima de um tubo fresco de 15 mL. Adicione 5 mL de PBS frio, encaixe o êmbolo da coluna na coluna e elimine as células empurrando o êmbolo.</li>
	<li>Misturar as células enriquecidas com c-Kit, coletar 10 μL de células e contar usando a solução de Türks em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. O rendimento típico de um camundongo é de 2-5 × 106 células c-Kit+ . NOTA: Neste ponto, as células podem ser semeadas diretamente em meios HSC ou preparadas para purificação de células ativadas por fluorescência (FACS) HSC.</li>
</ol>3. Iniciando culturas de células com HSPCs enriquecidos com c-Kit
<ol><li>Preparar meio fresco (Tabela 1) para o número de células/poços necessários. Semear 0,5-1 milhão de células por mL para HSPCs enriquecidos com c-Kit.</li>
	<li>Gire as células enriquecidas com c-Kit e ressuspenda em meio HSC na densidade celular desejada.</li>
	<li>Transferir as células para placas revestidas com fibronectina ou com carga superficial negativa, a 200 μL por placa de 96 poços ou 1 mL por placa de 24 poços.</li>
	<li>Colocar as células numa incubadora de cultura de tecidos regulada para 37 °C e 5% CO2.</li>
</ol>4. Iniciando culturas celulares com HSCs purificadas FACS
<ol><li>Preparar um volume apropriado da coloração de anticorpos de linhagem biotinilada: 3 μL de mistura mestre (Tabela 2) por 10 milhões de células, diluídos 1:100 em PBS.</li>
	<li>Gire as células enriquecidas com c-Kit e ressuspenda na coloração de anticorpos de linhagem por 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar com 10 ml de PBS estéril e girar para baixo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Preparar um volume adequado da coloração de anticorpos HSC frescos (Tabela 3): 300 μL por 10 milhões de células. Juntamente com esta coloração da amostra, prepare amostras de controle de coloração apropriadas para compensação e gating. NOTA: Trabalhe em uma capa de cultura de tecidos com a luz apagada ao usar anticorpos conjugados com corante.</li>
	<li>Ressuspender as células na coloração de anticorpos HSC e incubar a 4 °C por 90 min. Misture as células a cada 20-30 min tocando para evitar a peletização celular.</li>
	<li>Lavar com 10 ml de PBS estéril e girar para baixo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante, agitar o pellet para interromper e ressuspender em PBS estéril com 0,5 μg/mL de iodeto de propídio (PI).</li>
	<li>Preparar meio fresco (Tabela 1) para o número de poços necessários e placa em fibronectina ou placas com carga superficial negativa (200 μL por placa de 96 poços ou 1 mL por placa de 24 poços).</li>
	<li>Prepare a máquina FACS para classificar e classificar CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSCs diretamente em poços contendo mídia (consulte a Figura 1 para a estratégia de vedação FACS padrão usada aqui). Classifique até 200 células por poço de placa de 96 poços ou até 1.000 células por poço de placa de 24 poços. NOTA: As máquinas FACS devem ser operadas por um cientista treinado. Recomenda-se que os usuários entrem em contato com o recurso FACS local para discutir essa estratégia de classificação se não tiverem experiência no isolamento FACS de HSCs de camundongos.</li>
</ol>5. Realizando alterações de mídia
<ol><li>Para culturas de células iniciadas a partir de células enriquecidas com c-Kit, iniciar as trocas de meios após 2 dias. Para culturas de células iniciadas a partir de CTHs isoladas de FACS, iniciar as trocas de meios após 5 dias.</li>
	<li>Preparar meio HSC pré-aquecido (~37 °C) fresco suficiente (Tabela 1) para todos os poços.</li>
	<li>Remova suavemente a placa da incubadora de cultura de tecidos. NOTA: Como os HSPCs em placas carregadas de superfície negativa são mais facilmente perturbados do que aqueles em fibronectina, deve-se tomar cuidado extra ao trocar o meio em placas carregadas de superfície negativa para evitar perturbar as culturas celulares.</li>
	<li>Usando uma pipeta ou bomba de vácuo, remova lentamente ~90%-95% do meio do menisco do poço. NOTA: Evite retirar o meio da base do poço, caso contrário muitas células serão removidas.</li>
	<li>Adicionar 200 μL (para placas de 96 poços; 1 mL para placas de 24 poços) de meio fresco ao poço.</li>
	<li>Retorne a placa para a incubadora de cultura de tecidos.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.6 a cada 2-3 dias até o desfecho experimental.</li>
	<li>Para culturas celulares iniciadas com HSPCs enriquecidas com c-Kit (seção 3), dividir as culturas em uma proporção de 1:2-1:3 após ~3 semanas. Para culturas celulares iniciadas com HSCs purificadas FACS (seção 4), dividir as culturas em uma proporção de 1:2-1:3 após ~3 semanas e quando as culturas estiverem >90% confluentes. NOTA: O cronograma exato dependerá dos interesses experimentais. Essas culturas foram caracterizadas por 4-8 semanas8, mas comprimentos de cultura adicionais podem ser possíveis.</li>
</ol>6. HSPCs cultivados eletroporando
NOTA: Este protocolo é para eletroporação de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA (RNP), mas poderia ser adaptado para eletroporação de mRNA ou outras proteínas recombinantes. Iniciar culturas com número suficiente de células para realizá-lo no momento experimental desejado.
<ol><li>Efectuar uma mudança do meio 1 dia antes da electroporação, conforme descrito na secção 5. NOTA: Recomenda-se um mínimo de uma cultura noturna antes da eletroporação. No entanto, as células são tipicamente cultivadas por 1-3 semanas antes da transdução.</li>
	<li>No dia da eletroporação, configure o nucleofector. Ligue a máquina. Na tela sensível ao toque, selecione o módulo X e, em seguida, o tamanho da cubeta usado.</li>
	<li>Preparar solução P3 suficiente (de acordo com as instruções do fabricante) para a escala da eletroporação (100 μL por cubeta ou 20 μL por microcubeta) e deixar equilibrar-se à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar meio fresco suficiente (Tabela 1) para o número de poços a serem banhados e adicionar 500 μL de meio para um poço de placa de 24 poços ou 100 μL de meio para um poço de placa de 96 poços.</li>
	<li>Descongelar o sgRNA (pré-diluído a 2 μg/mL em água livre de RNase) no gelo e misturar 16 μg de sgRNA com 30 μg da enzima Cas9 (a 10 μg/mL) em um tubo de PCR estéril. Incluir um tubo de PCR extra contendo apenas a proteína Cas9 como controle. Misture mexendo o tubo e, em seguida, gire brevemente para baixo. Incubar a 25 °C por 10 min em um termociclador para complexar o RNP e, em seguida, manter os tubos no gelo. NOTA: Isso pode ser reduzido em cinco vezes se for realizada eletroporação em microcubetas.</li>
	<li>Misturar e transferir os HSPCs para eletroporação em um tubo; coletar 10 μL das células e contar usando solução de Türks em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. NOTA: Recomenda-se eletroporar 1-5 milhões de células por 100 μL de cubeta (reduzido em cinco vezes para a microcubeta).</li>
	<li>Gire o número adequado de células em um tubo de 1,5 mL a 450 × g por 5 min a 4 °C. Aspirar o máximo possível do sobrenadante e ressuspender com 100 μL de tampão de nucleofeção.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular imediatamente para o tubo de PCR contendo o RNP complexado e pipeta para cima e para baixo lentamente para misturar suavemente e transferir para uma cubeta de eletroporação de 100 μL. Ejete a mistura na cubeta lentamente e em um movimento fluido para evitar a formação de bolhas de ar na cubeta.</li>
	<li>No eletroporador, selecione a posição dos poços que estão sendo eletroporados. Usando a tela sensível ao toque, selecione o programa de tipo de célula CD34+, humano, ou digite o código de pulso EO100. Pressione o botão OK .</li>
	<li>Transfira as cubetas para o eletroporador. Pressione o botão Iniciar na tela sensível ao toque para iniciar a eletroporação. Logo após a eletroporação, adicionar 500 μL do meio de cultura à cubeta (100 μL se utilizar uma microcubeta).</li>
	<li>Transfira suavemente as células para a placa preparada e retorne à incubadora de cultura de tecidos.</li>
	<li>Para procedimentos que empregam um modelo de doador AAV6, adicione o vetor imediatamente após as células terem sido transferidas para uma placa revestida com fibronectina a uma concentração de 5.000 vetores/célula.</li>
	<li>Após 6-18 h, prepare o meio fresco e efectue uma mudança do meio conforme descrito na secção 5. Para esta mudança de meio, remova apenas 80%-90% do meio. OBS: Evite retirar o meio da base do poço.</li>
	<li>Analisar as células por citometria de fluxo após 2 ou mais dias (ver secção 8 para mais detalhes).</li>
	<li>Continuar a efectuar trocas de meios de 2 em 2 dias, conforme descrito na secção 5, até atingir o ponto final experimental. NOTA: As taxas de edição de CRISPR/Cas9 usando esse método dependem muito da eficiência de direcionamento do sgRNA projetado. Taxas de edição de até 95% têm sido observadas com um guia eficiente15. Diretrizes para o projeto de sgRNA foram previamente detalhadas em outros estudos19,20.</li>
</ol>7. Transdução de HSPCs cultivadas com vetor lentiviral
NOTA: Iniciar culturas com número suficiente de células, para realizar isso no momento experimental desejado.
<ol><li>Gerar e titular vetor lentiviral (dependendo dos objetivos experimentais). Descongelar o vetor lentiviral no gelo.</li>
	<li>Realizar uma mudança de meio (como na seção 5); em seguida, misture e transfira os HSPCs para transdução em um tubo. Recolher 10 μL das células e contar utilizando a solução de Türks numa diluição de 1:2 com um hemocitómetro. NOTA: As células podem ser transduzidas imediatamente após o plaqueamento. No entanto, as células são tipicamente cultivadas por 1-3 semanas antes da transdução.</li>
	<li>Replaquear a dose necessária de células para transdução (tipicamente 100.000 células por placa de 96 poços). Separadamente, as células de controle negativo não transduzidas em placa. NOTA: Se usar placas com carga superficial negativa, transfira as células para placas revestidas com fibronectina para transdução de vetor lentiviral.</li>
	<li>Adicione vetor lentiviral a cada poço de células: adicione 20 unidades de transdução por célula para alcançar ~30% de eficiência de transdução. No entanto, determinar a dose do vetor lentiviral empiricamente, dependendo das exigências experimentais. OBS: Garantir que o vetor lentiviral seja descartado de acordo com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Retornar as células à incubadora de cultura de tecidos por 6 h. Depois, efectue uma mudança de meio conforme descrito na secção 5. NOTA: O sobrenadante contém vírus vivo. Descarte de acordo com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Analisar as células por citometria de fluxo (por exemplo, para expressão de GFP) após 2 dias ou mais. Consulte a seção 8 para obter detalhes.</li>
	<li>Continuar a efectuar trocas de meios de 2 em 2 dias, conforme descrito na secção 5, até atingir o ponto final experimental.</li>
</ol>8. Análise por citometria de fluxo de culturas de HSPC
<ol><li>Preparar uma mistura de anticorpos HSC cultivada concentrada ex vivo em PBS contendo SFB a 2% (Tabela 4). Conservar a mistura a 4 °C no escuro até 1 mês. NOTA: Trabalhe em uma capela de cultura de tecidos com as luzes apagadas ao usar anticorpos conjugados com corante.</li>
	<li>Adicionar 2 μL de mistura concentrada de anticorpos a 50 μL de células. Incubar durante 30 min a 4 °C no escuro. Juntamente com esta coloração da amostra, prepare amostras de controle de coloração apropriadas para compensação e gating.</li>
	<li>Adicionar 200-1.000 μL de PBS contendo 2% de FBS e centrifugar a 450 × g por 5 min a 4 °C. Remover o sobrenadante possível e ressuspender em 100-500 μL de PBS contendo 2% de SFB e 0,5 μg/mL de IP.</li>
	<li>Configure o citômetro de fluxo e registre pelo menos 10.000 células vivas por amostra. NOTA: Os citômetros de fluxo devem ser operados por um cientista treinado. Os usuários devem entrar em contato com a instalação local do FACS para discutir essa análise se não tiverem experiência em citometria de fluxo.</li>
	<li>Exporte os dados no formato FCS e analise os dados usando o software de análise de citometria de fluxo apropriado. Consulte a Figura 2 para a estratégia de vedação padrão usada aqui.</li>
</ol>

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<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Esperamos que este protocolo forneça uma abordagem útil para investigar a biologia da THS, hematopoese e hematologia de forma mais geral. Desde o desenvolvimento inicial do método de cultura à base de PVA para HSCs purificadas porFACS8, o método tem sido ampliado. Por exemplo, foi demonstrado que o método funciona com c-Kit enriquecido com medula óssea e com placas carregadas superficialmentenegativas14. Sua compatibilidade com transdução e eletroporação também foi demonstr...

O sistema hematopoiético suporta uma série de processos essenciais em mamíferos, desde o fornecimento de oxigênio até o combate a patógenos, passando por tipos especializados de células sanguíneas e imunológicas. A produção contínua de sangue (hematopoiese) é necessária para dar suporte à homeostase do sistema sanguíneo, que é sustentada por células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPCs)1. A célula hematopoética mais primitiva é a célula-tronco hematopoética (CTH), que possui capacidades únicas de auto-renovação e diferenciação de multilinhagens2,3. Esta é uma população celular rara, encontrada principalmente na medula óssea adulta4, onde ocorrem com uma frequência de apenas aproximadamente uma a cada 30.000 células. Acredita-se que as CTHs apoiem a hematopoiese ao longo da vida e ajudem a restabelecer a hematopoiese após o estresse hematológico. Essas capacidades também permitem que as HSCs reconstituam de forma estável todo o sistema hematopoiético após o transplante em um receptor irradiado5. Isso representa a definição funcional de uma CAR e também forma a base científica para a terapia de transplante de THC, um tratamento curativo para uma série de doenças hematológicas e imunológicas6. Por essas razões, as HSCs são um dos principais focos da hematologia experimental.
Apesar de um grande foco de pesquisa, tem permanecido desafiador expandir de forma estável HSCs ex vivo7. Recentemente, desenvolvemos o primeiro sistema de cultura de expansão ex vivo de longo prazo para HSCs de camundongos8. A abordagem pode expandir HSCs transplantáveis em 234-899 vezes ao longo de uma cultura de 4 semanas. Em comparação com abordagens alternativas, a principal mudança no protocolo foi a remoção da albumina sérica e sua substituição por um polímero sintético. O álcool polivinílico (PVA) foi identificado como um polímero ótimo para culturas de HSC em camundongos8, que agora também tem sido usado para culturas de outros tipos de células hematopoéticas9. No entanto, outro polímero chamado Soluplus (um copolímero de enxerto de polivinil caprolactama-acetato-polietilenoglicol) também foi identificado recentemente, o que parece melhorar a expansão clonal de CTE10. Antes do uso de polímeros, albumina sérica na forma de soro fetal bovino, albumina sérica V de soro bovino ou albumina sérica recombinante eram usadas, mas estas tinham suporte limitado para expansão de CTE e suportavam apenas cultura ex vivo de curto prazo (~1 semana)7. No entanto, deve-se ressaltar que protocolos de cultura de CAR que retêm as HSC em estado quiescente podem suportar um tempo de cultura ex vivo maior11,12.
Em comparação com outros métodos de cultura, uma grande vantagem das culturas baseadas em PVA é o número de células que podem ser geradas e o tempo que o protocolo pode ser usado para rastrear HSCs ex vivo. Isso supera várias barreiras no campo da hematologia experimental, como o baixo número de HSCs isoláveis por camundongo (apenas alguns milhares) e a dificuldade de rastrear HSCs ao longo do tempo in vivo. No entanto, é importante lembrar que essas culturas estimulam a proliferação de HSC, enquanto o pool de HSC in vivo é predominantemente quiescente em estado estacionário13. Além disso, embora as culturas sejam seletivas para CTHs, tipos celulares adicionais se acumulam com as culturas ao longo do tempo, e as CTHs transplantáveis representam apenas aproximadamente uma em cada 34 células após 1 mês. As células progenitoras hematopoéticas mieloides parecem ser o principal tipo celular contaminante nessas culturas deCTH8. No entanto, podemos usar essas culturas para enriquecer para HSCs de populações celulares heterogêneas (por exemplo, c-Kit+ HSPCs de medula óssea14). Também suporta a transdução ou eletroporação de CTHs para manipulação genética14,15,16. Para ajudar a identificar HSCs da população heterogênea de HSPC cultivadas, CD201 (EPCR) foi recentemente identificado como um marcador útil ex vivo de HSC10,17,18, com HSCs transplantáveis restritas à fração CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-.
Este protocolo descreve métodos para iniciar, manter e avaliar culturas de expansão de HSC de camundongos baseadas em PVA, bem como protocolos para manipulação genética dentro dessas culturas usando eletroporação ou transdução de vetor lentiviral. Espera-se que esses métodos sejam úteis para uma variedade de hematologistas experimentais.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Kit</td> de <td></td> Hemocitômetro 12764416 <td></td>da <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Appleton Woods Ltd</td><td>HC002</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>pilão e almofariz</td><td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td><td>X18000</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL seringa</td><td>VWR International Ltd</td><td>720-2519</td><td></td></tr><tr><td>19 G agulha</td><td>VWR International Ltd</td><td>613-5394</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; filtro de células m</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2317</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech toalhetes</td><td>VWR International Ltd</td><td>115-2075</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS coluna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &mu; g</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td></td>1081058</tr><tr><td>Fator de células-tronco de camundongo recombinante livre de animais</td><td>Peprotech</td><td>AF-250-03</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoetina de camundongo recombinante livre de animais</td><td>Peprotech</td><td>AF-315-14</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-1171-83</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td><td>Biolegend</td><td>105828</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127&nbsp; APC/Cy7 (clone: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127 biotina (clone: A7R34)</td><td>Biolegend</td><td>135006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201&nbsp; APC (clone: eBio1560)</td><td>ThermoFisher</td><td>17-2012-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4&nbsp; APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100526</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD4 biotina (clone: RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100508</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45R&nbsp; APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45R biotina (clone: RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td><td>Biolegend</td><td>103428</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8 biotina (clone: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a&nbsp; APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&nbsp; APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108424</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotina (clone: RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108108</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119&nbsp; APC/Cy7 (clone: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119 biotina (clone: TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>placas CellBIND, placas CellBIND de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>com carga negativa de superfície</td></tr><tr><td>, 96 poços&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3330</td><td>superfície negativa carregada</td></tr><tr><td>SgRNA sintético personalizado&nbsp;</td><td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td><td>Pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>F7524-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Placas revestidas com fibronectina, 96 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>354409</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio-X (100x)</td> <td>Gibco</td><td>51500.056</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61196. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Álcool polivinílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td><td>EXB-0018</td><td></td></tr><tr><td>Estreptacidina APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405208</td><td></td></tr><tr><td>T&uuml; rks ' solução</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Mettler-Toledo Ltd</td><td>95015662</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo expansão e manipulação genética de células-tronco hematopoéticas de camundongos em culturas à base de Álcool polivinílico

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

As células-tronco hematopoéticas (CTHs) multipotentes auto-renovadoras são um tipo celular importante devido à sua capacidade de suportar a hematopoiese ao longo da vida e reconstituir todo o sistema sanguíneo após o transplante. As CTHs são usadas clinicamente em terapias de transplante de células-tronco, que representam tratamento curativo para uma série de doenças do sangue. Há um interesse substancial tanto na compreensão dos mecanismos que regulam a atividade da TH e da hematopoiese, quanto no desenvolvimento de novas terapias baseadas em HSC. No entanto, o cultivo estável e a expansão de CTHs ex vivo têm sido uma grande barreira no estudo dessas células-tronco em um sistema ex vivo tratável. Recentemente, desenvolvemos um sistema de cultura à base de álcool polivinílico que pode apoiar a expansão a longo prazo e em larga escala de HSCs transplantáveis de camundongos e métodos para editá-los geneticamente. Este protocolo descreve métodos para cultura e manipulação genética de HSCs de camundongos via eletroporação e transdução lentiviral. Espera-se que este protocolo seja útil para uma ampla gama de hematologistas experimentais interessados em biologia da CAR e hematopoese.

Para a purificação FACS de HSCs, esperamos que, dentro da medula óssea enriquecida com c-Kit, ~0,2% das células sejam a população CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- para camundongos jovens (8-12 semanas de idade) C57BL/6 (Figura 1). No entanto, é provável que camundongos transgênicos ou de diferentes idades apresentem diferentes frequências de HSC. Após 4 semanas de cultura, esperamos que a fração CD201+CD150+c-Kit+<sup...

Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Este protocolo permite a expansão e manipulação genética de células-tronco hematopoéticas funcionais de camundongos, permitindo um entendimento mais aprofundado da biologia das células-tronco hematopoéticas e da hematopoese. A vantagem desta técnica é que ela pode apoiar células-tronco hematopoéticas em cultura ex vivo de longo prazo e permitir a manipulação genética para interrogar a genética da hematopoiese. Este sistema de cultura fornece uma tecnologia de plataforma para vários estudos em biologia de células-tronco hematopoéticas e hematopoiese, incluindo estudos genéticos, moleculares e bioquímicos.A tabela de solução de problemas lista as causas e soluções para as dificuldades comuns encontradas com essa técnica. É muito mais fácil e eficaz mostrar como extrair corretamente as células da medula óssea e realizar mudanças completas na mídia em vez de ler sobre isso. Para iniciar a extração de células-tronco hematopoéticas, ou HSC, use lenços de tarefa delicados sem fiapos para limpar os ossos recém-isolados de camundongos devidamente eutanasiados.Remova os músculos e a medula espinhal dos ossos antes de adicioná-los a uma argamassa contendo aproximadamente três mililitros de PBS. Usando um pilão, esmague os ossos sem triturá-los para minimizar as forças de cisalhamento. Em seguida, usando uma agulha de calibre 19 acoplada a uma seringa de 5 mililitros, quebre os grandes fragmentos de medula óssea liberados no PBS e transfira a suspensão através de um filtro de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros.Uma vez transferida a suspensão, repita o processo com PBS fresco até que os ossos estejam clareados. Procure um volume final de aproximadamente 30 mililitros por camundongo e 50 mililitros para dois camundongos para branquear os ossos até que nenhuma medula seja mais visível. Prepare-se para o enriquecimento da coluna colocando uma coluna de filtração magnética no ímã de um separador de coluna magnética com um filtro de 50 mícrons na parte superior e um tubo cônico de 15 mililitros abaixo.Em seguida, depois de tratar as células com o anticorpo anti-c-Kit aloficocianina e microesferas magnéticas de aloficocianina, passe três mililitros de PBS estéril através do filtro de 50 mícrons e da coluna de filtração. Uma vez que o PBS tenha passado, passe a suspensão da célula através da coluna, seguido por três lavagens de três mililitros de PBS frio de cada vez. Após cada lavagem, espere que a coluna pare de pingar antes de adicionar PBS para a próxima lavagem.Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em cima de um tubo fresco de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de PBS frio na coluna antes de encaixar o êmbolo da coluna nela e eluir as células empurrando o êmbolo. Siga o protocolo descrito no texto para preparar meio HSC suficiente para o número desejado de células ou poços para semear de 0,5 a 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, gire as células-tronco hematopoéticas e progenitoras enriquecidas com c-Kit, ou HSPCs, e ressuspenda o pellet no meio HSC recém-preparado na densidade celular desejada.Transferir as células para placas revestidas com fibronectina ou com carga superficial negativa, mantendo o volume adequado. Coloque as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois de remover suavemente a placa da incubadora de cultura de tecidos sem perturbar as culturas celulares, use uma pipeta ou bomba de vácuo para aspirar lentamente cerca de 90 a 95% do meio do menisco líquido de cada poço.Evite tirar o meio da base do poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius no poço. Retorne a placa à incubadora de cultura de tecidos e troque o meio a cada dois ou três dias até que o experimento necessite.Depois de ressuspender as células em tampão de nucleofeção, transfira imediatamente a suspensão celular para o tubo de PCR contendo a ribonucleoproteína complexada e misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Agora transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de volume adequado muito lentamente, mantendo um movimento contínuo de fluido para evitar a formação de bolhas de ar dentro da cubeta. Em seguida, no eletroporador, selecione a posição dos poços que estão sendo eletroporados.Usando a tela sensível ao toque, selecione o programa de tipo de célula como CD34-positivo humano ou digite o código de pulso EO100 e, em seguida, pressione o botão OK. Transfira a cubeta para o eletroporator e pressione o botão Iniciar na tela sensível ao toque para iniciar a eletroporação. Imediatamente após a eletroporação, adicionar cinco vezes o volume de reação do meio de cultura à cubeta.Agora, transfira suavemente as células para a placa preparada e coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos. Depois de realizar uma troca de meio como demonstrado anteriormente, coletar 10 microlitros das células e contá-las usando solução de Turk em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. Replaquear a dose necessária de células em placas revestidas com fibronectina para transdução e, separadamente, plaquear as células de controle negativo não transduzidas.Em seguida, adicione o vetor lentiviral a cada poço contendo células, mantendo uma dose de 20 unidades de transdução por célula para atingir cerca de 30% de eficiência de transdução. No entanto, determinar a dose do vetor lentiviral empiricamente dependendo das exigências experimentais. Finalmente, retornar as células à incubadora de cultura de tecidos por seis horas.Execute uma alteração de meio conforme descrito anteriormente. A classificação celular ativada por fluorescência das HSCs enriquecidas com c-Kit produziu aproximadamente 0,2% das células CD150-positivas, CD34-negativas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas. Após quatro semanas de cultura de HSPC, as frações CD201-positivas, CD150-positivas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas foram encontradas para ser cerca de 10% Após a transdução com um vetor lentiviral que expressa GFP, as células positivas para GFP foram aproximadamente 30%Quando confluentes, a densidade esperada das culturas era de cerca de 2 milhões de células por mililitro.Aproximadamente 50% de morte celular foi observada nas primeiras 24 a 48 horas antes da primeira troca de meio. Após uma semana, no entanto, o número de células retornou a 80 a 100% do número de células semeadas. Mudanças precisas de mídia usando meios frescos e pré-aquecidos são críticas para a estabilidade a longo prazo deste método de cultura HSC.Desde que o método original foi publicado em 2019, a área começou a usá-lo de diferentes maneiras para estudar a biologia do HSC.

ex-vivo-expansion-genetic-manipulation-mouse-hematopoietic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.

Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

Aprenda a expandir e manipular geneticamente células-tronco hematopoéticas de camundongos ex vivo usando cultura à base de álcool polivinílico. Este método permite estudos longitudinais de hematopoiese com eficiência de transdução de aproximadamente 30%.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico (Vídeo) | JoVE Journal

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

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