Name: Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a visualizar os estágios iniciais de infecção por Magnaporthe oryzae em cevada usando equipamentos básicos de laboratório. Este método simplificado permite o rastreamento rápido de mutantes fúngicos sem microscopia avançada.

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Os autores agradecem o financiamento do prêmio USDA-NIFA 2016-67013-24816.

1. Preparação de materiais experimentais
<ol><li>Prepare o ágar aveia (OMA) misturando a aveia até obter um pó fino. Adicionar 25 g de aveia em pó e 15 g de ágar a 500 mL de ddH2O e autoclave em ciclo de meio (alternativamente, deixe ferver por 20 min). Despeje o meio em placas de Petri estéreis de 60 mm. NOTA: Outros tipos de meios que induzem esporulação, como ágar V8, são aceitáveis para este protocolo.</li>
	<li>A placa M. oryzae filtra diretamente nas placas OMA usando pinças estéreis e permite que cubram toda a placa (9-12 dias). Coloque as placas em uma incubadora de crescimento a 25 °C com ciclos dia:noite de 12:12 h para ajudar a induzir a esporulação. NOTA: Alguns mutantes crescem mais lentamente e requerem cuidados adicionais (por exemplo, mídia completa primeiro, depois uma transferência para o OMA), e podem levar uma semana adicional para produzir conídios suficientes.</li>
	<li>Plante diretamente sementes de cevada (Hordeum vulgare Lacey) em um meio de crescimento úmido (por exemplo, meio de vaso sem solo) com 10-15 sementes por vaso de 6 polegadas. Coloque as panelas em bandejas com 1-2 em água.</li>
	<li>Defina as condições da câmara de crescimento da cevada como 22 °C por 12 h (luz do dia) e 19 °C por 12 h (escuro) com 60% de umidade relativa. Continue a regar do fundo para não perturbar as sementes.</li>
	<li>Cultivar a cevada até o estágio de segunda folha, aproximadamente por 14 dias. Usando tesoura estéril, corte a planta de cevada logo acima da linha do solo. Usando pinça e um barbeador/bisturi, corte cuidadosamente a bainha foliar da primeira folha que está aberta longitudinalmente e, usando a pinça, retire-a da base da segunda folha. OBS: Limpe as ferramentas (pinças, bisturi, etc.) antes de usar com etanol 75%-80%. A bainha é a fina camada da epiderme que fornece a fixação da primeira à segunda folha (segunda à terceira folha, etc.; ver Figura 1).</li>
	<li>Coloque a primeira folha plana em uma placa de Petri estéril de 60 mm, contendo uma toalha de papel molhada para manter a umidade dentro da placa. Com o bisturi, corte a maior parte da primeira folha longe da bainha, deixando apenas 0,5 pol do tecido foliar para montagem.</li>
	<li>Tape o tecido foliar no fundo da placa de Petri. NOTA: A bainha se enrola, mas isso é aceitável, pois uma bainha enrolada segura a gota de conídio com mais facilidade.</li>
	<li>Coletar placas de M. oryzae com 9-12 dias de idade e adicionar 0,5-2 mL de água estéril às placas. Usando uma alça de inoculação estéril, raspe suavemente o micélio para liberar os conídios anexados. Pipetar cuidadosamente a suspensão de conídios para um tubo de microcentrífuga contendo um pequeno pedaço de pano de queijo para filtrar quaisquer pedaços grandes de micélio da suspensão de conídios. NOTA: Os esporos podem ser coletados a partir de 7 dias, se o crescimento e a esporulação forem suficientes para atingir a concentração de esporos desejada. A coleta pode ser adiada no máximo 14 dias se trabalhar com um mutante genético de crescimento lento</li>
	<li>A concentração de esporos desejada é de 5 x 10 4 esporos por mL, mas um intervalo (1 x 10 4-1 x 10 5) é aceitável. Uma concentração muito alta torna a imagem de locais de infecção individuais desafiadores; Diluir a concentração de esporos com água estéril, se necessário.</li>
	<li>Pipetar cuidadosamente a suspensão conidial dentro da bainha de folhas laminadas. Comece com 25 μL (o tamanho da gota pode ser aumentado dependendo do tamanho da bainha, até 50 μL). NOTA: Recomenda-se realizar de três a cinco réplicas de cada cepa mutante ou linha de cevada. É comum que ocorram danos durante o processo de coloração, portanto, réplicas adicionais da bainha são recomendadas.</li>
	<li>Encha quatro ou cinco copos de 500 mL com ddH2O e aqueça até cozinhar no vapor (usando um micro-ondas ou placa de aquecimento). Tenha cuidado ao mover os copos de água quente. Segure a tampa da placa de Petri sobre um dos copos fumegantes para reter a umidade dentro do prato.</li>
	<li>Empilhe as placas de bainha de folhas infectadas e envolva-as com os copos quentes restantes. Isso cria um ambiente úmido e úmido, necessário para que os esporos germinem. NOTA: Tenha cuidado ao cozinhar as tampas para garantir que nenhuma água quente ou vapor toque nas bainhas.</li>
	<li>Proteja as bainhas das folhas da luz, cubra com uma caixa de borracha ou plástico de cor sólida (preto preferencial) e deixe descansar por 48 h ou o tempo desejado para a obtenção de imagens. NOTA: Uma caixa de papelão não é adequada porque não trava a umidade/umidade e absorve o vapor dos copos de água quente. Uma cuba de plástico com trava funciona bem para conter a umidade, e pode ser coberta com tecido preto ou um recipiente escuro maior para bloquear a luz.</li>
</ol>2. Processo de coloração
<ol><li>Prepare a mancha da seguinte forma: prepare uma diluição fresca de ácido acético a 45% e adicione 0,1% v/v de azul de tripano. Alíquota 1 mL da solução corante em tubos de microcentrífuga. Ajuste um bloco de calor ou banho-maria para 40 °C.</li>
	<li>Com cuidado, usando uma navalha ou bisturi, corte a bainha de folhas longe da fita. Usando pinças, coloque a bainha no tubo da microcentrífuga e certifique-se de que ela esteja completamente submersa na solução do corante. Aguarde 2 h para que o corante penetre na folha. Aquecer as amostras a 40 °C durante o tempo de processo de coloração em bloco térmico ou banho-maria para aumentar a penetração do corante. OBS: As bainhas tentam flutuar no tubo da microcentrífuga; Para evitar bolsas de tecido foliar sem manchas, preencha os tubos, submerja as bainhas e feche o tubo. Não coloque várias bainhas no mesmo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Enxágue cuidadosamente as bainhas das folhas em glicerol a 60% para remover o corante extra. Três enxaguamentos (cada um em glicerol fresco) são geralmente suficientes. Mantenha a bainha em glicerol até que esteja pronta para montar em lâminas.</li>
</ol>3. Processo de montagem e geração de imagens
<ol><li>Coloque a bainha em uma lâmina de vidro limpa e adicione algumas gotas de glicerol a 60%. Com o uso de um microscópio dissecante e dois pares de pinças, desenrole cuidadosamente a bainha, deixando o centro inoculado voltado para cima. Mantenha a bainha aberta com a pinça e coloque a lamínula por cima para evitar que a bainha se enrole e bloqueie o local da infecção. OBS: A bainha foliar é muito frágil, e essas etapas precisam ser feitas com cuidado para evitar danos à bainha.</li>
	<li>Sele a tampa usando esmalte para armazenamento de longo prazo ou fita para armazenamento de curto prazo. Observe as lâminas sob um microscópio de luz composta.</li>
	<li>Tire imagens básicas usando um microscópio e um telefone celular. Aqui, as imagens foram feitas com um adaptador de celular e um smartphone. Para dispositivos Android, ajuste o aplicativo da câmera para as seguintes configurações: flash desligado, desativar Top Shot, desativar o ajuste automático de brilho e sombras e definir a resolução da foto como total. NOTA: Usar o aplicativo da câmera no telefone diminui a vida útil da bateria mais rápido do que o normal, portanto, é recomendável ter energia externa.</li>
	<li>Uma vez que o celular é montado no microscópio, tire uma imagem de um micrômetro de escala com o objetivo que será usado para adquirir os dados. Os dados deste estudo foram adquiridos em uma objetiva de ar de 40x 0,65 NA, e o adaptador de telefone foi montado em uma ocular de 10x. Ajuste o zoom do telefone para 2,5x e mantenha-o consistente para manter um tamanho de pixel constante.</li>
	<li>O centro da bainha abriga a maior concentração de esporos e apressórios infectantes; Portanto, busque-se de 9 a 12 imagens de cada bainha para obter números significativos para análise estatística. O número de esporos e apressórios varia de acordo com a concentração de esporos aplicados.</li>
</ol>4. Avaliação e contagem de imagens utilizando ImageJ (FIJI)
<ol><li>Transfira as imagens para um computador executando o ImageJ (FIJI). Para abrir as imagens, arraste e solte os arquivos na barra do ImageJ.</li>
	<li>Defina a escala das imagens carregando a imagem do micrômetro do estágio e desenhando uma linha reta entre duas marcações para a escala. Abra Definir Escala, digite a Distância Conhecida para a linha medida e digite a unidade para a escala. No micrômetro, neste exemplo, a menor linha era de 10 μm. Marque a caixa Definir Global e pressione OK. Todas as imagens subsequentes carregadas terão a mesma escala.</li>
	<li>Para contar apressórios, esporos ou outros objetos, selecione a ferramenta Ponto . Em seguida, abra o Gerenciador de ROI. Clique na tecla T no teclado para adicionar pontos à lista. Essas regiões de interesse podem ser salvas, se necessário, e recarregadas na mesma imagem.</li>
	<li>Dependendo dos objetivos experimentais, faça medições adicionais, como comprimento dos esporos, tamanho dos apressórios e comprimento do tubo germinativo.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+%28MoT%29+in+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+pressure%3A+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li>
<li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996(2013).</li>
<li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84(2016).</li>
<li>Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangridge%2C+P+%22The+Barley+Genome.+Compendium+of+Plant+Genomes%22">The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes</a>. , Springer. Cham. 1-10 (2018).</li>
<li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice%2C+goosegrass%2C+and+weeping+lovegrass%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li>
<li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li>
<li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Direct%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).</li>
<li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+no+feeding+frenzy%3F+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li>
<li>Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Delaware%22">University of Delaware</a>. , Doctoral dissertation (2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((al.The+plant+infection+test%3A+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li>
<li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li>
<li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Existem muitos ensaios comumente utilizados disponíveis para testar cepas de M. oryzae que fornecem uma visão em nível macroscópico de uma resposta infecciosa compatível ou incompatível, como inoculações em spray ou gotículas, e o uso de sistemas de classificação para quantificar o tamanho das lesões13,14. Outro ensaio comum para M. oryzae é testar a capacidade do patógeno de formar sua estrutura de penetração especializada, o apressório<sup cla...

Magnaporthe oryzae, o fungo da brusone do arroz, infecta uma variedade de culturas de grãos, incluindo cevada, trigo e arroz1. Este patógeno causa doenças devastadoras e representa uma ameaça mundial para essas valiosas culturas, causando perda completa de safra se não for controlado. Muitos laboratórios ao redor do mundo se concentram na doença da brusone do arroz devido à sua ameaça global e seus atributos como um excelente modelo para interações planta-fungos2. Foi completamente sequenciada, e a genética de seu ciclo infeccioso, particularmente os eventos iniciais, foi estabelecida 3,4. O ciclo de vida começa com um esporo germinando na superfície da folha, formando a estrutura de penetração especializada chamada apressório. O apressório penetra no tecido foliar e a infecção continua com o desenvolvimento de lesões que iniciam o processo de esporulação e disseminação da doença4. Prevenir qualquer um desses eventos iniciais inibiria drasticamente essa doença devastadora. Consequentemente, a maioria das pesquisas atuais sobre a doença blástica tem se concentrado nas etapas iniciais da infecção, desde os conídios germinados formando um apressório até o desenvolvimento das hifas invasivas e do complexo interfacial biotrófico (BIC)5.
A vasta quantidade de pesquisas sobre a brusone tem sido conduzida em arroz, embora M. oryzae seja um patógeno significativo para uma variedade de culturas, e cepas recém-evoluídas estejam emergindo como uma ameaça global ao trigo6. Enquanto o arroz é uma das três principais culturas básicas usadas para alimentar a população, juntamente com o trigo e o milho, a cevada é o quarto grão de cereal em termos de ração animal e produção de cerveja7. À medida que a indústria da cerveja artesanal cresce, cresce também o valor econômico da cevada. Existem vantagens distintas do uso de M. oryzae e cevada como um patossistema para estudar a doença blástica. Primeiro, existem cepas de M. oryzae que infectam apenas cevada, bem como cepas que podem infectar várias espécies de gramíneas. Por exemplo, 4091-5-8 infecta principalmente apenas cevada, enquanto Guy11 e 70-15 podem infectar cevada e arroz8. Essas cepas são geneticamente semelhantes e o processo de infecção é comparável9. Em segundo lugar, sob condições padrão de laboratório e estufa, a cevada é mais fácil de cultivar, pois não tem os requisitos complicados do arroz (controle conciso de temperatura, alta umidade, espectros de luz específicos). Há também desafios de imagem com o arroz devido à hidrofobicidade da superfície foliar, que a cevada não apresenta10.
Este protocolo apresenta um método simples para isolar e utilizar efetivamente bainhas foliares de cevada para análise microscópica de múltiplos estágios de infecção, utilizando material laboratorial comum e um smartphone para coleta de dados. Este método para o ensaio da bainha da folha de cevada é adaptável para laboratórios em todo o mundo, pois requer suprimentos mínimos, e ainda fornece uma imagem clara da interação microscópica entre o patógeno e as primeiras células que ele infecta. Enquanto ensaios de patogenicidade, como a inoculação por spray ou gotícula, podem fornecer uma visão macro da capacidade do patógeno de formar lesões, este ensaio permite ao pesquisador visualizar etapas específicas da infecção precoce, desde eventos de pré-penetração até a colonização de células epidérmicas. Além disso, os pesquisadores podem facilmente comparar a infecção com o fungo do tipo selvagem à infecção com um mutante reduzido em virulência.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Celular&nbsp;</td><td>Google&nbsp;</td><td>Pixel 4A</td><td>Qualquer smartphone com uma câmera traseira que possa ser montada em um suporte será suficiente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Adaptador de microscópio</td><td>para celular Vankey</td><td>B01788LT3S</td><td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQQTMzNk9Ebr/ M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BMbr/ DQQTMzNk9 ><md2lkZZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td></tr><tr><td>Microscópio de glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AmScope</td><td>FM690TC</td><td>40x&ndash; 2500x Trinocular microscópio de epi-fluorescência vertical</td></tr><tr><td>Aveia aveia em flocos à moda antiga</td><td>Quaker</td><td>N / A</td><td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& hvptwo=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& hvtargid =pla-568492637928& psc=1</td></tr><tr><td>ProMix BX</td><td>ProMix</td><td>1038500RG</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Vidro de Cobertura Retangular</td><td>Corning</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr>, <tr><td>microscópio</td><td>Micrômetro de palco Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OMAX</td><td>A36CALM7</td><td>lâmina de calibração de microscópio de 0,1 mm e 0,01 mm</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (magnaporthe oryzae) em cevada (hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Entender como plantas e patógenos interagem, e se essa interação culmina em defesa ou doença, é necessário para desenvolver estratégias mais fortes e sustentáveis para a saúde das plantas. Avanços em métodos que capturam amostras de fitopatógenos de forma mais eficaz durante a infecção e colonização produziram ferramentas como o ensaio da bainha foliar do arroz, que tem sido útil no monitoramento da infecção e dos eventos de colonização precoce entre o arroz e o patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemibiotrófico causa severa perda de doenças em arroz e monocotiledôneas relacionadas, incluindo milheto, centeio, cevada e, mais recentemente, trigo. O ensaio de bainha foliar, quando realizado corretamente, produz uma seção opticamente clara da planta, com várias camadas de espessura, o que permite aos pesquisadores realizar imagens de células vivas durante o ataque do patógeno ou gerar amostras fixas coradas para características específicas. Investigações celulares detalhadas sobre a interação cevada-M. oryzae têm ficado atrás daquelas do hospedeiro arroz, apesar da crescente importância deste grão como fonte de alimento para animais e humanos e como bebidas fermentadas. Relata-se aqui o desenvolvimento de um ensaio de bainha foliar de cevada para estudos intrincados de interações de M. oryzae durante as primeiras 48 h pós-inoculação. O ensaio da bainha foliar, independentemente da espécie estudada, é delicado; É fornecido um protocolo que abrange tudo, desde as condições de crescimento da cevada e obtenção de uma bainha foliar, até a inoculação, incubação e imagem do patógeno nas folhas das plantas. Esse protocolo pode ser otimizado para triagem de alto rendimento usando algo tão simples quanto um smartphone para fins de imagem.

Uma representação do fluxo de trabalho inicial para essa técnica é exibida na Figura 1. As bainhas foram colhidas de plantas de cevada (H. vulgare) suscetíveis aos 14 dias de idade. Os conídios foram colhidos de placas de OMA esporulantes de M. oryzae com 10 dias de idade, com uma suspensão de conídios preparada com ddH2O estéril para uma concentração final de 5 x 104 esporos por mL. A suspensão de inóculo foi aplicada diretamente nas bainhas foliares,...

Este é um protocolo simples de um ensaio de bainha de folha de cevada usando reagentes mínimos e equipamentos de laboratório comuns (incluindo um smartphone básico). O objetivo é visualizar o processo de infecção precoce da doença blástica em laboratórios sem acesso a equipamentos avançados de microscopia.

Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Nosso protocolo é um método simplificado que permite aos pesquisadores visualizar as etapas iniciais da infecção de mutantes fúngicos selvagens e genéticos sem o uso de equipamentos caros. A principal vantagem desta técnica é o uso de suprimentos laboratoriais básicos para responder questões biológicas complexas e para a triagem rápida de mutantes fúngicos para análises posteriores. Uma parte difícil dessa técnica é o tratamento da bainha.A bainha é uma fina camada de células que pode ser facilmente danificada, por isso o manuseio cuidadoso é essencial para um experimento bem-sucedido. Para começar, selecione a cevada cultivada até o estágio da segunda folha. E usando tesoura estéril, corte a planta de cevada logo acima da linha do solo.Usando pinça e bisturi, corte cuidadosamente a bainha da primeira folha que é aberta longitudinalmente. E usando a pinça, retire-a da base da segunda folha. Usando um bisturi, corte a maior parte da primeira folha longe da bainha, deixando apenas 0,5 centímetros do tecido foliar para montagem.Coloque a primeira folha plana em uma placa de Petri estéril de 60 milímetros contendo uma toalha de papel molhada para manter a umidade dentro da placa. Tape o tecido foliar no fundo da placa de Petri. Selecione uma placa de cultura Magnaporthe oryzae de nove a 12 dias e adicione 0,5 a dois mililitros de água estéril a ela.Usando uma alça de inoculação estéril, raspe suavemente o micélio para liberar os conídios anexados. Pipetar cuidadosamente a suspensão de conídios para um tubo de microcentrífuga contendo um pequeno pedaço de pano de queijo para filtrar quaisquer pedaços grandes de micélio da suspensão de conídios. Se necessário, dilua a concentração de esporos com água estéril para cinco vezes 10 a quarto esporos por mililitro, pois uma concentração muito alta torna a obtenção de imagens de locais de infecção individuais desafiadoras.Dependendo do tamanho da bainha, pipetar cuidadosamente 25 a 50 microlitros da suspensão conidial dentro da bainha de folha laminada. Em seguida, encha quatro ou cinco copos de 500 mililitros com água bidestilada e aqueça até cozinhar. Segure a tampa da placa de Petri sobre um dos copos fumegantes para reter a umidade dentro do prato.Empilhe as placas de bainha de folhas infectadas e cerque-as com os copos quentes restantes, pois cria um ambiente úmido e úmido para os esporos germinarem. Proteja esta configuração da luz, cobrindo-a com uma caixa de borracha ou plástico de cor sólida e deixando-a intacta por 48 horas ou o ponto de tempo desejado para a obtenção de imagens. Prepare a mancha misturando ácido acético a 45% diluído na hora e azul de tripano a 0,1%.Alíquota um mililitro da solução corante em tubos de microcentrífuga. Usando um bisturi, corte cuidadosamente a bainha de folhas longe da fita. Usando pinças, coloque a bainha no tubo da microcentrífuga e certifique-se de que ela esteja completamente submersa na solução do corante.Deixe os tubos repousarem por duas horas em um bloco de calor de 40 graus Celsius ou banho-maria para que o corante penetre na folha. Em seguida, enxágue cuidadosamente as bainhas das folhas três vezes em glicerol fresco a 60% para remover o corante extra. Mantenha a bainha em glicerol até que esteja pronta para montar em lâminas.Coloque a bainha em uma lâmina de vidro limpa e adicione algumas gotas de 60% de glicerol. Com o uso de um microscópio dissecante e dois pares de pinças, desenrole cuidadosamente a bainha, deixando o centro inoculado voltado para cima. Segurando a bainha aberta com a pinça, coloque a tampa por cima para evitar que a bainha se enrole e bloqueie o local da infecção.Sele a tampa usando esmalte para armazenamento de longo prazo ou fita de armazenamento de curto prazo. Observe as lâminas sob um microscópio de luz composta. Tire imagens básicas com um smartphone montando um adaptador de telefone celular para o microscópio.Para dispositivos Android, ajuste as configurações do aplicativo da câmera para piscar, desativar a foto superior, desativar o ajuste automático de brilho e sombras e definir a resolução da foto como total. Após a montagem do celular, tire uma imagem de uma balança micrômetro com o objetivo desejado para a aquisição dos dados. Ajuste o zoom do telefone para 2,5 x e mantenha-o consistente para manter um tamanho de pixel consistente.O centro da bainha abriga a maior concentração de esporos e apressórios infectantes. Portanto, busque-se de nove a 12 imagens de cada bainha para obter números significativos para análise estatística. Os locais de infecção da bainha foram fotografados usando um adaptador de microscópio de smartphone e smartphone após coloração com azul de tripano.O calor e o ácido acético no procedimento de coloração suavizam suavemente o tecido foliar. Os enxaguantes pós-coloração em glicerol a 60% não só removem o excesso de mancha, mas ajudam a reduzir a dispersão de luz causada pela folha e melhoram a qualidade da imagem. Desvios do protocolo de coloração podem resultar em resultados subótimos, como descrito aqui.A cevada infectada com 4091 células silvestres produziu células infectadas com sucesso identificadas pela presença de hifas infectadas dentro do tecido da bainha foliar. No caso da infecção mutante J99A, observou-se desenvolvimento bem-sucedido de apressórios e pinos de penetração, mas não produziu hifas invasivas. O momento é importante para ensaios baseados em infecções.Plantas adequadamente envelhecidas e esporos de fungos são essenciais para o sucesso. Neste estudo, analisamos a presença ou ausência das estruturas infecciosas. Experimentos adicionais poderiam responder a questões sobre o fenótipo da estrutura da infecção e das hifas invasoras.Nossa metodologia não é nova, mas uma versão simplificada e acessível de um experimento mais complexo e caro.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualização de germinossomos e membrana interna em esporos de Bacillus subtilis . J. Vis. (2019)Este vídeo demonstra o uso de microscopia de iluminação estruturada para adquirir imagens de fluorescência tridimensionais que revelam a organização das proteínas de germinação dentro do esporo bacteriano.

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Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção foliar da planta de arroz por meio da inoculação de feridas com micélio Magnaporthe grisea. O tubo germinativo derivado de esporos fúngicos penetra na camada epidérmica, resultando em infecção tecidual e lesões nas folhas. Este método auxilia na triagem de patótipos e melhora a compreensão da resistência das plantas para o melhoramento molecular.

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Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone (Vídeo) | JoVE Journal

Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone

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