Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras
November 11th, 2022
O presente protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canal de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de células inteiras.
Este protocolo registra com sucesso os efeitos da aconitina no IKv das células H9C2. Promover novas fases para investigar o mecanismo de cardiotoxicidade de fármacos sob a perspectiva dos canais iônicos. A técnica de patch-clamp de células inteiras é o padrão-ouro da pesquisa de canais iônicos com alta sensibilidade, alta precisão e alta especificidade.
A técnica de patch-clamp de células inteiras pode ser empregada para explorar os mecanismos farmacológicos ou tóxicos de justagem de canais iônicos específicos para doenças multissistêmicas, como o sistema cardiovascular e o sistema nervoso. Para começar, digerir as células com tripsina a 0,25% por 30 segundos, uma vez que a placa de cultura H9C2 se torne 80% confluente. Cultura 2 vezes 10 a 5ª células por mililitro com meio normal ou meio contendo fármaco em um prato de 35 milímetros acarpetado com placas de vidro por 24 horas a 37 graus Celsius, com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% e 70 a 80% de umidade relativa.
Ligue o extrator da micropipeta e pré-aqueça por 30 minutos. Em seguida, coloque um capilar de vidro borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta. Selecione o programa e clique em Enter no painel de controle.
Clique no programa de rampa no canto superior direito para determinar o valor de calor do capilar de vidro. Escreva o programa para puxar o eletrodo de acordo com o valor determinado pelo teste de rampa e clique em puxar para começar a fabricar as pipetas. Ligue o conversor analógico digital, o amplificador de sinal, o micromanipulador, o microscópio e a câmera.
Abra o aplicativo de imagem, o software amplificador de sinal e o software de aquisição de dados em sequência. Clique em adquirir e selecionar o protocolo de edição no software de aquisição de dados. Edite o programa na interface de forma de onda.
Insira valores para primeiro nível, nível delta, primeira duração e duração delta para a época A, a época B e a época C.Em seguida, clique na interface de taxa de modo e defina os dados da hierarquia de avaliação. Em seguida, clique em editar protocolo para selecionar o botão de estímulo e defina o programa de subtração de vazamento na caixa de diálogo de subtração de vazamento PM. Para estabelecer o caminho de armazenamento de dados, clique em arquivo e selecione definir nomes de arquivo de dados no software de aquisição de dados.
Em seguida, abra o protocolo lKv estabelecido selecionando adquirir e clicando em protocolo aberto no software de aquisição de dados. Finalmente, clique na opção ferramentas e selecione teste de membrana para começar a executar o protocolo. Adicionar a solução extracelular ao banho celular no aparelho de fixação de colchões de células inteiras e colocar a tampa deslizada para cima com as células H9C2 no banho.
Encher 30% da pipeta com a solução extracelular e instalá-la no suporte do eléctrodo de gravação integrado no aparelho patch-praçadeira. Aperte a pipeta com o suporte do eléctrodo de gravação. Em seguida, solte a pipeta no banho com o micromanipulador.
Clique na interface de deslocamento da pipeta do software do amplificador de sinal para manter a linha de base da corrente lKv em zero picoamps. Descarregue uma pressão positiva adequada manualmente com uma seringa de 1,0 mililitros, ligada ao suporte do elétrodo de gravação, através de um tubo de plástico. Mova ligeiramente a pipeta manipulando o micromanipulador em três dimensões para entrar em contacto com a célula.
Uma vez que a membrana testa a onda quadrada cai de um terço a meio depois que a pipeta toca a membrana celular, remova a pressão positiva e entregue manualmente uma pressão negativa apropriada. Em seguida, clique na interface de patch do software de aquisição de dados para formar o gigaseal. Use o software de amplificador de sinal lento de compensação de capacitância rápida e compensação de capacitância durante o teto da célula para compensar a capacitância rápida e lenta.
Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper um pedaço da membrana celular. Execute a compensação da capacitância da membrana de célula inteira clicando no botão de célula inteira do software do amplificador de sinal. Por fim, salve e registre os dados, clicando no botão de gravação de dados.
Abra os dados lKv salvos com o software de análise de dados. Salve as relações de tensão de corrente. Clique em analisar para selecionar estatísticas.
Selecione o intervalo como Cursores 1 2 para análise de dados, clique nos botões de amplitude de pico e média e, em seguida, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados. Finalmente, copie a coluna de dados médios lKv no software de desenho de funções para análise posterior. Salve os rastreamentos de corrente lKv representativos.
Clique em editar para selecionar os rastreamentos de transferência e, em seguida, selecione o rastreamento completo na região a ser transferida. Em seguida, clique em selecionar na seleção de rastreamento e selecione IN 0 em sinais. Finalmente, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados e copie os dados totais para o software de desenho de funções para desenhar os traços atuais.
Salve o protocolo lKv. Clique em editar para selecionar criar sinal de forma de onda de estímulo e selecione ok. Em seguida, repita a etapa para desenhar traços de corrente sem selecionar o sinal.
O lKv foi desencadeado por 150 milissegundos de estímulo de pulso despolarizante de menos 40 a mais 60 milivolts com potencial de retenção de menos 60 milivolts. O lKv dos cardiomiócitos de ratos H9C2 apareceu pela primeira vez em torno de menos 20 milivolts e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. Em comparação com o grupo controle, a amplitude do lKv foi observavelmente reduzida após os cinco minutos de tratamento com 4-PA 1,5 milimolar.
Além disso, o lKv diminuiu significativamente nos potenciais de membrana de 10 para 60 milivolts de forma dose-dependente, após o tratamento AC de 24 horas. A célula individual após o canal iônico de gravação pode ser usada para avaliação ômica adicional de célula única, como genômica de célula única, transcriptômica, proteômica e metabolômica.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método eficiente para a aquisição dinâmica e em tempo real de correntes de canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) em cardiomiócitos H9c2 usando a técnica de patch-clamp de célula inteira. Ele registra com sucesso os efeitos da aconitina no IKv das células H9C2, promovendo novas fases para investigar os mecanismos de cardiotoxicidade na perspectiva dos canais iônicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia Cardiovascular
- Eletrofisiologia
- Pesquisa de canais iônicos
Fundo
- A técnica de patch-clamp de célula inteira é o padrão ouro para pesquisa de canais iônicos.
- Oferece alta sensibilidade, precisão e especificidade.
- Este método pode explorar mecanismos farmacológicos ou tóxicos dos canais iônicos.
- É aplicável a doenças multissistêmicas, incluindo os sistemas cardiovascular e nervoso.
Propósito do Estudo
- Investigar os efeitos da aconitina nos canais Kv em cardiomiócitos H9C2.
- Compreender os mecanismos de cardiotoxicidade dos medicamentos.
- Utilizar a técnica de patch-clamp de célula inteira para aquisição dinâmica de correntes.
Métodos Utilizados
- Digestão celular com 0,25% de tripsina por 30 segundos.
- Cultivo de células H9C2 a 2 x 10^5 células/mL em uma placa de 35 mm.
- Incubação a 37 graus Celsius com 5% de CO2 e 70-80% de umidade relativa.
- Aplicação de meio normal ou contendo medicamento por 24 horas.
Principais Resultados
- Gravação bem-sucedida de correntes do canal Kv em células H9C2.
- Efeitos demonstrados da aconitina no IKv.
- Forneceu insights sobre os mecanismos de cardiotoxicidade.
- Validou a eficácia da técnica de patch-clamp de célula inteira.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para estudar a dinâmica dos canais iônicos.
- Abre novos caminhos para pesquisa de toxicidade de medicamentos.
- O patch-clamp de célula inteira continua sendo uma ferramenta crítica na eletrofisiologia.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Voltage-dependent potassium current recording in H9c2 cardiomyocytes using whole-cell patch-clamp provides a high-precision platform for interrogating ion channel function and drug-induced cardiotoxicity. This approach enables mechanistic de-risking at the early discovery stage, supporting predictive confidence in cardiac safety assessment for portfolio compounds. Integration of quantitative electrophysiological data informs target validation and translational continuity in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of Kv channel function under pharmacological modulation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying drug effects on cardiac ion channels.
- Provides functional target validation for cardiac safety liabilities.
- Facilitates predictive confidence in early-stage compound triage.
Screening & Assay Development
- Delivers validated electrophysiological readouts for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization and reproducibility through quantitative current measurements.
- Supports screening readiness for evaluating compound-induced ion channel modulation.
- Provides scalable data outputs for comparative compound assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro electrophysiological findings with translational cardiac safety biomarkers.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of ion channel liabilities.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative current inhibition profiles.
- Facilitates integration with single-cell omics for deeper mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and mechanistic de-risking for cardiac ion channels.
- Discovery Biology: Quantifies drug-induced modulation of Kv currents to clarify cardiac safety mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound comparison.
- Analytics: Enables statistical analysis of current-voltage relationships and dose-dependent inhibition.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical cardiac safety endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for diverse compound and target evaluations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac safety assessment.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable electrophysiological data.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by early identification of cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiovascular and multisystem compounds.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch-clamp techniques.
- Demands access to advanced instrumentation and analytical software for data acquisition and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and data interpretation criteria.
- Adaptation may be needed for different cell models or ion channel targets.
- Throughput and scalability are limited by manual operation and technical complexity.
