Registro de Corrente de Potássio Dependente de Voltagem em Cardiomiócitos H9c2 através da Técnica de Patch-Clamp de Células Inteiras

Este protocolo registra com sucesso os efeitos da aconitina no IKv das células H9C2. Promover novas fases para investigar o mecanismo de cardiotoxicidade de fármacos sob a perspectiva dos canais iônicos. A técnica de patch-clamp de células inteiras é o padrão-ouro da pesquisa de canais iônicos com alta sensibilidade, alta precisão e alta especificidade.

A técnica de patch-clamp de células inteiras pode ser empregada para explorar os mecanismos farmacológicos ou tóxicos de justagem de canais iônicos específicos para doenças multissistêmicas, como o sistema cardiovascular e o sistema nervoso. Para começar, digerir as células com tripsina a 0,25% por 30 segundos, uma vez que a placa de cultura H9C2 se torne 80% confluente. Cultura 2 vezes 10 a 5ª células por mililitro com meio normal ou meio contendo fármaco em um prato de 35 milímetros acarpetado com placas de vidro por 24 horas a 37 graus Celsius, com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% e 70 a 80% de umidade relativa.

Ligue o extrator da micropipeta e pré-aqueça por 30 minutos. Em seguida, coloque um capilar de vidro borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta. Selecione o programa e clique em Enter no painel de controle.

Clique no programa de rampa no canto superior direito para determinar o valor de calor do capilar de vidro. Escreva o programa para puxar o eletrodo de acordo com o valor determinado pelo teste de rampa e clique em puxar para começar a fabricar as pipetas. Ligue o conversor analógico digital, o amplificador de sinal, o micromanipulador, o microscópio e a câmera.

Abra o aplicativo de imagem, o software amplificador de sinal e o software de aquisição de dados em sequência. Clique em adquirir e selecionar o protocolo de edição no software de aquisição de dados. Edite o programa na interface de forma de onda.

Insira valores para primeiro nível, nível delta, primeira duração e duração delta para a época A, a época B e a época C.Em seguida, clique na interface de taxa de modo e defina os dados da hierarquia de avaliação. Em seguida, clique em editar protocolo para selecionar o botão de estímulo e defina o programa de subtração de vazamento na caixa de diálogo de subtração de vazamento PM. Para estabelecer o caminho de armazenamento de dados, clique em arquivo e selecione definir nomes de arquivo de dados no software de aquisição de dados.

Em seguida, abra o protocolo lKv estabelecido selecionando adquirir e clicando em protocolo aberto no software de aquisição de dados. Finalmente, clique na opção ferramentas e selecione teste de membrana para começar a executar o protocolo. Adicionar a solução extracelular ao banho celular no aparelho de fixação de colchões de células inteiras e colocar a tampa deslizada para cima com as células H9C2 no banho.

Encher 30% da pipeta com a solução extracelular e instalá-la no suporte do eléctrodo de gravação integrado no aparelho patch-praçadeira. Aperte a pipeta com o suporte do eléctrodo de gravação. Em seguida, solte a pipeta no banho com o micromanipulador.

Clique na interface de deslocamento da pipeta do software do amplificador de sinal para manter a linha de base da corrente lKv em zero picoamps. Descarregue uma pressão positiva adequada manualmente com uma seringa de 1,0 mililitros, ligada ao suporte do elétrodo de gravação, através de um tubo de plástico. Mova ligeiramente a pipeta manipulando o micromanipulador em três dimensões para entrar em contacto com a célula.

Uma vez que a membrana testa a onda quadrada cai de um terço a meio depois que a pipeta toca a membrana celular, remova a pressão positiva e entregue manualmente uma pressão negativa apropriada. Em seguida, clique na interface de patch do software de aquisição de dados para formar o gigaseal. Use o software de amplificador de sinal lento de compensação de capacitância rápida e compensação de capacitância durante o teto da célula para compensar a capacitância rápida e lenta.

Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper um pedaço da membrana celular. Execute a compensação da capacitância da membrana de célula inteira clicando no botão de célula inteira do software do amplificador de sinal. Por fim, salve e registre os dados, clicando no botão de gravação de dados.

Abra os dados lKv salvos com o software de análise de dados. Salve as relações de tensão de corrente. Clique em analisar para selecionar estatísticas.

Selecione o intervalo como Cursores 1 2 para análise de dados, clique nos botões de amplitude de pico e média e, em seguida, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados. Finalmente, copie a coluna de dados médios lKv no software de desenho de funções para análise posterior. Salve os rastreamentos de corrente lKv representativos.

Clique em editar para selecionar os rastreamentos de transferência e, em seguida, selecione o rastreamento completo na região a ser transferida. Em seguida, clique em selecionar na seleção de rastreamento e selecione IN 0 em sinais. Finalmente, clique em OK para visualizar os dados na página de resultados e copie os dados totais para o software de desenho de funções para desenhar os traços atuais.

Salve o protocolo lKv. Clique em editar para selecionar criar sinal de forma de onda de estímulo e selecione ok. Em seguida, repita a etapa para desenhar traços de corrente sem selecionar o sinal.

O lKv foi desencadeado por 150 milissegundos de estímulo de pulso despolarizante de menos 40 a mais 60 milivolts com potencial de retenção de menos 60 milivolts. O lKv dos cardiomiócitos de ratos H9C2 apareceu pela primeira vez em torno de menos 20 milivolts e, em seguida, a amplitude aumentou com mais despolarização. Em comparação com o grupo controle, a amplitude do lKv foi observavelmente reduzida após os cinco minutos de tratamento com 4-PA 1,5 milimolar.

Além disso, o lKv diminuiu significativamente nos potenciais de membrana de 10 para 60 milivolts de forma dose-dependente, após o tratamento AC de 24 horas. A célula individual após o canal iônico de gravação pode ser usada para avaliação ômica adicional de célula única, como genômica de célula única, transcriptômica, proteômica e metabolômica.