Name: Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a isolar folículos ovarianos humanos para análise de expressão gênica usando técnicas enzimáticas e mecânicas controladas. Este método preserva a integridade celular e permite estudos detalhados em biologia reprodutiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Erasme (Bruxelas, Bélgica). A paciente incluída neste protocolo foi submetida à criopreservação de tecido ovariano (COT) para preservação da fertilidade antes da exposição à quimioterapia em 2000. A paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido para doação de seu tecido residual congelado para pesquisa ao final do período de armazenamento.
1. Descongelamento do tecido ovariano criopreservado
<ol><li>Prepare uma placa de 6 poços contendo cinco soluções de descongelamento. O primeiro poço contém 5 mL de solução crioprotetora composta de meio Leibovitz-15, sacarose 0,1 mol/L, dimetilsulfóxido (DMSO) 1,5 mol/L e albumina sérica humana (HSA) a 1%. Os poços seguintes contêm 5 mL de meio Leibovitz-15 com concentrações decrescentes de crioprotetor: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO. NOTA: A solução crioprotetora pode diferir de acordo com o protocolo utilizado na clínica de fertilidade.</li>
	<li>Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano de azoto líquido em conformidade com as regras de segurança (luvas criogénicas, óculos de proteção e sapatos fechados) e mantenha o tubo à temperatura ambiente (TR) durante 30 s.</li>
	<li>Mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante 2 minutos em RT com agitação suave antes de abrir o frasco para injetáveis sob um capuz vertical e transferi-lo diretamente para o primeiro poço da placa de 6 poços (sobre gelo).</li>
	<li>Transfira o fragmento sucessivamente para cada poço da placa de 6 poços, com cada um contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em 5 mL de meio Leibovitz-15. Agitar suavemente o tecido em cada meio por 5 min (sobre gelo).</li>
</ol>2. Isolamento dos folículos
NOTA: Todos os experimentos são conduzidos usando materiais livres de RNase e sob uma capa vertical.
<ol><li>Transferir o tecido descongelado para uma placa de Petri quadriculada de 2 mm preenchida com 10 mL de meio de dissecção (meio Leibovitz-15, piruvato de sódio [2 mmol/L], L-glutamina [2 mmol/L], HSA [0,3%], penicilina G [30 μg/mL] e estreptomicina [50 μg/mL]). Ajuste o tamanho do tecido com um bisturi, se necessário. OBS: Dependendo do protocolo clínico, o tamanho do tecido congelado pode variar de 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Para esse protocolo, foram utilizadas duas tiras de 4 mm x 2 mm x 1 mm.</li>
	<li>Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido, colocar o fragmento entre os dois blocos e cortar o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 mm de espessura.</li>
	<li>Use o cortador de tecido para cortar o fragmento e obter pedaços menores. Se necessário, corte as peças restantes manualmente com um bisturi até que o tecido esteja totalmente quebrado.</li>
	<li>Transferir o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada preenchida com 7 mL de meio de digestão (meio de cultura [meio McCoy's 5A, 3 mmol/L de glutamina, 0,1% HSA, 30 μg/mL de penicilina G, 50 μg/mL de estreptomicina, 2,5 μg/mL de transferrina, 4 ng/mL de selênio e 50 μg/mL de ácido ascórbico] suplementado com 0,2% de colagenase e 0,02% de DNase).</li>
	<li>Coloque o prato na incubadora a 5% CO2 e 37 °C. A cada 10 min, retire a placa de Petri da incubadora e lave o tecido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Após 45 min de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de 5x-6,3x e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal. OBS: A pipetagem bucal deve ser realizada com cuidado para evitar a perda de material na tubulação e contaminação.</li>
	<li>Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de 27 G, arrancando o córtex com a ponta das seringas para liberar os folículos do estroma. NOTA: Não toque nos folículos com as seringas para evitar danificá-los.</li>
	<li>Transferir os folículos com o microcapilar em uma placa de 4 poços contendo gotas de 15 μL do meio de cultura calibrado coberto por 500 μL de cultura de óleo (1 a 10 folículos por gota). Essa etapa mantém a viabilidade do folículo durante o processo de coleta. No final do procedimento, lave os folículos duas vezes por 5 s cada vez em duas gotas de 15 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) cobertas por 500 μL de cultura de óleo (sobre gelo).</li>
	<li>Coletar 20 folículos com uma quantidade mínima de PBS usando a pipeta bucal (máximo de 10 μL) em um tubo vazio e manter o tubo sobre gelo. NOTA: Para a estabilidade do RNA, é crucial executar a etapa 2.8 e a etapa 2.9 no gelo. Cerca de 20 folículos (<75 μm) são necessários para ter RNA suficiente para RT-qPCR padrão (SYBR Green).</li>
	<li>Após um máximo de 90 min de incubação no meio de digestão, interromper a reação enzimática adicionando à placa de Petri um excesso de solução bloqueadora fria (4 °C) (7,5 mL) composta de meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). NOTA: A solução de bloqueio pode ser adicionada assim que o experimentador observar folículos grudados na placa ou folículos danificados (forma assimétrica ou folículos de cor mais escura). Recomenda-se realizar o isolamento do folículo dentro de um período máximo de 2,5 h para evitar danos foliculares e realizar a extração de RNA imediatamente após o isolamento.</li>
</ol>3. Extração de RNA
NOTA: A extração de RNA é realizada seguindo as instruções fornecidas com um kit de extração de RNA, adaptando os volumes de eluição.
<ol><li>Suspender os folículos isolados adicionando 100 μL da solução de lise fornecida com o kit de extração de RNA ao tubo contendo os folículos sob uma capa química e vórtice em alta velocidade (2.500 rpm/min) para quebrar a estrutura dos folículos. Adicionar 50 μL de etanol (100%) ao tubo e agitar brevemente a alta velocidade. NOTA: Como o tampão de lise contém 2-mercaptoetanol e ácido tiocianico, esta etapa deve ser executada com cautela sob um capuz químico.</li>
	<li>Transferir o volume total do tubo (aproximadamente 160 μL) para um conjunto de cartucho de microfiltro composto por uma coluna e um tubo de recolha e centrifugar-o durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Lavar a coluna com 180 μL da solução de lavagem 1, fornecida com o kit, e centrifugar o tubo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C.</li>
	<li>Adicionar 180 μL de solução de lavagem 2/3, fornecida com o kit, à coluna e centrifugar durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Execute esta etapa duas vezes. Centrifugar o tubo uma última vez por 1 min para secar o filtro e colocar um novo tubo de coleta sob o cartucho.</li>
	<li>Realizar a eluição dos ácidos nucleicos em duas etapas:<ol><li>Primeiro, adicionar 8 μL de solução de eluição quente (75 °C) ao filtro, aguardar 1 min em RT e centrifugar durante 30 s a 16,363 x g a 4 °C.</li>
		<li>Repetir este passo com 7 μL de solução de eluição. NOTA: O tubo que contém os ácidos nucleicos eluídos deve ser mantido no gelo. Para evitar a contaminação do DNA, uma etapa suplementar de degradação do DNA é altamente recomendada- etapa 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar o tubo com 2 UI de DNase e 1x tampão DNase durante 20 min a 37 °C. Bloquear a atividade enzimática com o reagente de inativação da 1/10 DNase por 2 min em TR.</li>
	<li>Centrifugar o tubo durante 1,5 min a 16,363 x g a 4 °C. Por fim, colete a suspensão contendo o RNA e transfira-o para um novo tubo.</li>
	<li>Avaliar a quantidade de RNA presente na amostra utilizando um espectrofotômetro (software NanoDrop 2000 > Ácido Nucleico > RNA). Use 1 μL de solução de eluição como um branco e meça a quantidade de RNA extraída de folículos isolados com 1 μL de solução.</li>
	<li>Verifique a relação 260/280 para a pureza do RNA (em torno de 2,0). Armazenar a amostra a −80 °C ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR. NOTA: Para avaliar a integridade do RNA, a amostra pode ser processada com um sistema de eletroforese automatizado de alta resolução antes ou depois do congelamento a -80 °C. Neste trabalho, após retrotranscrição, foi realizada RT-qPCR com o seguinte ciclo: Estágio de espera com 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C 40 ciclos de PCR com 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C Estágio da curva de fusão com 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da foliculogênese. Al...

O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.
O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri gradeada de 2 mm</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumento Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 Software</td><td>Expert Agilent</td><td>versão B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 poços</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp; EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent total RNA 6000 pico kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript transcriptase reversa</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A + bicarbonato + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tecidos McIlwain</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilary RI EZ-Tips 200 &micro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilar RI EZ-Tips 75 &micro; m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c software operacional</td><td>ThermoFisher</td><td>versão 1.6</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR green master mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Primers: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Primers: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Primers: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>QPCR EM TEMPO REAL Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA total RNAqueous-micro</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Série II&nbsp; com camisa de água CO2&nbsp; incubadoras</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stadie-Riggs fatiador de tecidos</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr></tbody></table>

análise da expressão gênica em folículos humanos

Gene Expression Analyses in Human Follicles

O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.

Usando este procedimento de isolamento, o experimentador pode recuperar folículos do ambiente estromal para realizar análises específicas de expressão gênica. Com base no tamanho e morfologia dos folículos, é possível diferenciar os diferentes estágios da foliculogênese. O experimentador pode selecionar folículos de interesse de acordo com seu tamanho usando uma pipeta microcapilar adaptada. Usando um microcapilar de no máximo 75 μm, é possível discriminar folículos primordiais e primários de folículos secundários, antra...

Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Este protocolo descreve um método eficiente para isolar folículos ovarianos das células do estroma circundante para avaliar análises de expressão gênica nessas células germinativas. Esta técnica, utilizando isolamentos enzimáticos e mecânicos controlados, permite a recuperação dos folículos mantendo sua integridade. Seguindo esse protocolo, o pesquisador pode avaliar expressões gênicas específicas dessas células.A técnica poderia ser usada para entender melhor o déficit de expressão gênica nos folículos relacionado a doenças que afetam a função ovariana ou após exposição a agentes tóxicos. Comece a preparar uma placa de seis poços adicionando cinco mililitros de solução crioprotetora ao primeiro poço e cinco mililitros de meio Leibovitz 15 com concentrações decrescentes de crioprotetor aos próximos quatro poços. Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano do azoto líquido, em conformidade com as regras de segurança.Após 30 segundos à temperatura ambiente, ou RT, mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante dois minutos. Dentro de um capuz vertical, agite suavemente e abra o frasco de fragmento cortical ovariano antes de transferir o conteúdo para o primeiro poço da placa de seis poços colocada no gelo. Em seguida, transferir o fragmento cortical ovariano no primeiro poço sucessivamente para cada poço da placa de seis poços contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em cinco mililitros de meio Leibovitz 15.Agite suavemente o tecido em cada meio durante cinco minutos. Para o isolamento dos folículos, transfira o tecido ovariano descongelado para uma placa de Petri quadriculada de dois milímetros preenchida com 10 mililitros de meio de dissecção, 30 microgramas por mililitro de penicilina G e 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Ajuste o tamanho do tecido com o bisturi, se necessário.Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido e colocar o fragmento ovariano entre os dois blocos. Corte o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 milímetro de espessura. Corte o tecido usando o cortador de tecido para obter os pedaços menores.Se necessário, corte as peças restantes manualmente com o bisturi até que o tecido seja esmagado. Uma vez que o tecido é esmagado, transfira o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada cheia com sete mililitros de meio de digestão antes de colocar a placa na incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Retire a placa de Petri da incubadora a cada 10 minutos.Lave o tecido pipetando o meio de digestão para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Após 45 minutos de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de cinco a 6,3 vezes e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal.Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de calibre 27, arrancando o córtex com a ponta das seringas e liberando folículos do estroma. Usando o microcapilar, transferir os folículos isolados para uma placa de quatro poços contendo 15 microlitros do meio de cultura calibrado coberto por 500 microlitros de cultura de óleo. Após transferir de um a 10 folículos, enxágue-os duas vezes em duas gotas de 15 microlitros de PBS cobertas com 500 microlitros de cultura de óleo por cinco segundos cada.Usando a pipeta bucal, colete 20 folículos com PBS mínimo em um tubo vazio e mantenha o tubo no gelo. Após 90 minutos de incubação no meio de digestão, pare a reação enzimática adicionando uma solução de bloqueio a frio. Sob a capa química, suspender os folículos isolados em 100 microlitros da solução de lise fornecida com o Kit de Extração de RNA.Vórtice os folículos isolados a 2500 RPM por minuto para quebrar sua estrutura e, em seguida, adicione 50 microlitros de etanol a 100% ao tubo. E brevemente vórtice o tubo em alta velocidade. Após o vórtice, transfira o volume total do tubo para um conjunto de cartuchos de microfiltro, composto por uma coluna e um tubo de coleta.E centrifugar o conjunto por 10 segundos a 16, 363g a quatro graus Celsius. Lave a coluna com 180 microlitros da Solução de Lavagem 1 fornecida com o kit antes de centrifugar o tubo por 10 segundos. Depois de dar duas lavagens de 180 microlitros de Wash Solution 2, 3 à coluna, seque o filtro centrifugando o tubo uma última vez e coloque um novo tubo de coleta sob o cartucho.Para realizar a eluição dos ácidos nucleicos, primeiro adicione oito microlitros de solução de eluição de 75 graus Celsius ao conjunto do filtro. Após um minuto, centrifugar o conjunto por 30 segundos. Repita este passo com sete microlitros de Solução de Eluição .Uma vez feito, adicione duas unidades internacionais DNase e DNase tampão ao tubo e incube o tubo por 20 minutos a 37 graus Celsius. Bloquear a atividade enzimática com um por 10 reagente de inativação da DNase por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar o tubo por 1,5 minutos a 16, 363g a quatro graus Celsius e transferir a suspensão contendo o RNA para um novo tubo.Usando um espectrofotômetro, avaliar a quantidade de RNA na amostra. Use uma solução de eluição de microlitro como um branco e uma solução de microlitro de RNA extraído de folículos isolados. Verifique se a relação 260/280 está em torno de 2,0 para a pureza do RNA.E armazenar a amostra a menos 80 graus Celsius ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR. Utilizando esse protocolo, os dois fragmentos ovarianos homogeneizados de 4x2x1 milímetro da mesma paciente foram processados para isolar os folículos. A quantificação do RNA revelou que 4,8 nanogramas por microlitro de RNA total foram extraídos de folículos com menos de 75 micrômetros de tamanho com uma razão de pureza de 1,89.Dos folículos de menos de 200 micrômetros, foram extraídos 10,5 nanogramas por microlitro de RNA total, com uma razão de pureza de 1,74. Os valores do número de integridade do RNA, ou NIR, foram 7,1 e 7,9 nos tubos um e dois, respectivamente, validando a qualidade do RNA de nossas amostras. Após a execução de um ciclo padrão em um sistema de PCR em tempo real, os limiares de ciclo, ou CT, obtidos foram 30,87 e 29,56 para HPRT, 33,5 e 31,77 para kit ligante e 30,71 e 30,57 para GDF9.A digestão enzimática do tecido é um ponto crítico. O experimentador tem que avaliar continuamente e garantir a integridade do folículo durante a reação, interrompendo-a quando necessário. Além das análises de expressão gênica, folículos isolados são usados para desenvolver sistemas experimentais para preservar a fertilidade de pacientes com câncer, como cultura de folículos in vitro ou ovário artificial.A técnica de isolamento exigiu uma curva de aprendizado para recuperar um grande número de folículos intactos. Os pesquisadores são aconselhados a garantir que o tecido esteja bem quebrado antes da digestão.

gene-expression-analyses-in-human-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.

Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

O avanço do estudo da foliculogênese pré-antral requer métodos eficientes de isolamento do folículo a partir de ovários únicos. Apresenta-se aqui um protocolo mecânico simplificado para isolamento folículo de ovários bovinos usando um cortador de tecido e homogeneizador. Este método permite a coleta de um grande número de folículos pré-antrais viáveis de um único ovário.

Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos

Este artigo apresenta um modelo de co-cultivo de células de teca e granulosa bovinas. Este método tem o potencial de servir como uma base confiável para análises focadas no estudo da comunicação parácrina e transporte de substrato entre as células somáticas dentro do folículo.

Um sistema de co-cultura modificado para entender as interações entre células granulosa-teca no ovário bovino

Este protocolo descreve métodos padronizados para isolar e processar fluido folicular, células somáticas e oócitos imaturos de procedimentos de fertilização in vitro, permitindo análises moleculares e celulares de alta qualidade. Essas abordagens apóiam a pesquisa translacional em fertilidade, envelhecimento reprodutivo e disfunção ovariana usando materiais normalmente descartados em cuidados clínicos.

Coleta de fluido folicular humano, células somáticas foliculares e oócitos imaturos de indivíduos submetidos à fertilização in vitro

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Aprenda a isolar folículos ovarianos humanos para análise de expressão gênica usando técnicas enzimáticas e mecânicas controladas. Este método preserva a integridade celular e permite estudos detalhados em biologia reprodutiva.

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

Explorar mais vídeos