Microscopia de Força Atômica em Modo de Contato como Técnica Rápida para Observação Morfológica e Análise de Danos Celulares Bacterianos
30 de junho de 2023
Aqui, apresentamos a aplicação da microscopia de força atômica (AFM) como um método simples e rápido para caracterização bacteriana e analisamos detalhes como o tamanho e a forma bacteriana, biofilmes de cultura bacteriana e a atividade de nanopartículas como bactericidas.
Este protocolo mostra o uso da microscopia de força atômica em modo de contato para observar alterações na morfologia celular devido a uma doença ou tratamento específico. É altamente recomendável usar recipientes selados para este procedimento para evitar contaminação e analisar a amostra fixa o mais rápido possível para evitar o envelhecimento. Comece fixando as amostras na lâmina, passando suavemente a lâmina sobre uma chama várias vezes até que a amostra esteja seca.
Coloque as amostras fixas em uma placa de Petri e transporte-as para o equipamento de microscópio de força atômica para observação. Em seguida, ligue o computador e o microscópio de força atômica. Em seguida, selecione o modo de contato, as sondas ContAI-G e as opções de inclinação automática no software.
Defina os valores padrão para o controlador Z definindo o ponto de ajuste em 20 nanômetros, ganho de P em 10.000, ganho de I em 1.000, ganho de D em zero e tensão de ponta em zero milivolts. Usando a cabeça do intervalo de varredura de 70 micrômetros, coloque as amostras no modo de contato AFM. Obtenha uma visão rápida da superfície da área sob a sonda usando uma câmera montada em duas lentes integradas à cabeça de digitalização.
Agora, escolha a área desejada deslocando-a manualmente no plano XY. Permitir que a sonda se aproxime eletronicamente da superfície da amostra até que o contato seja alcançado. Ajuste eletronicamente o plano de medição XY do scanner e a superfície da amostra reduzindo a direção da inclinação XY.
Defina os parâmetros padrão do software para uma linha por segundo e 256 pontos por linha. Em seguida, execute uma faixa de varredura completa de uma área de 70 por 70 micrômetros. Selecione a área menor usando a ferramenta de zoom.
Selecione uma nova área da amostra retraindo o cantilever eletronicamente e movendo a amostra ao longo do plano XY. Em seguida, execute uma nova varredura conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, use o nivelamento linha por linha no menu de ferramentas da imagem na seleção de filtro para executar o processamento de dados.
Otimize a altura máxima e mínima na barra de cores para obter a melhor resolução de imagem. Por fim, realize a análise das imagens utilizando o menu de análise. Selecione os pontos iniciais e finais com a ferramenta desejada para determinar o comprimento e a distância.
A análise microscópica de força atômica das culturas bacterianas mostrou que as culturas de Staphylococcus aureus estavam distribuídas por zonas com agregados de cocos. O aumento das escalas mostrou maior valorização da distribuição populacional e da morfologia dos cocos. As imagens do modo de contato AFM permitiram a determinação do tamanho dos cocos que apresentaram largura média de 1,25 micrômetros.
Pseudomonas hunanensis apresentou distribuição homogênea em toda a superfície de suporte de vidro, formando uma monocamada aderente. As culturas foram em forma de bastonete, com comprimento de 1,9 micrômetros e largura de 0,9 micrômetros. A exposição por microdiluição de nanopartículas de óxido de magnésio de Staphylococcus aureus resultou na perda de uma superfície lisa e contornos homogêneos devido à grave deterioração da estrutura celular.
A formação de vesículas e a liberação de material citosólico foram observadas em culturas em concentrações mais elevadas que a CIM. Resultados semelhantes foram obtidos em culturas de E.coli, com os controles mostrando superfícies lisas, destacando sua forma homogênea de bastonetes. A estrutura desapareceu completamente com a exposição de nanopartículas de 1.000 PPM apenas com silhuetas distinguíveis.
É importante realizar a fixação correta da amostra, pois ela é essencial para uma análise mais aprofundada. O filtro de imagem ajuda a fornecer boa resolução de imagem e detalhes de amostra. Usando o método de fixação, modos sem contato AFM podem ser aplicados, o que pode ser útil no estudo das propriedades mecânicas.
Esta metodologia pode ser uma ferramenta barata e útil para pesquisas médicas e microbiológicas focadas na análise de danos celulares bacterianos.
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Visão Geral
Este estudo utiliza microscopia de força atômica (AFM) para caracterização bacteriana detalhada, focando no tamanho das bactérias, forma, biofilmes culturais e os efeitos bactericidas das nanopartículas. O protocolo enfatiza a preparação cuidadosa da amostra e técnicas de imagem específicas para observar mudanças morfológicas nas células bacterianas.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Microbiologia
- Caracterização bacteriana
- Pesquisa de nanopartículas
Fundamentos
- A microscopia de força atômica é uma ferramenta importante para observar a morfologia bacteriana.
- Entender a formação de biofilmes bacterianos e a resposta aos bactericidas auxilia na pesquisa médica.
- A preparação da amostra é crítica para a obtenção precisa de imagens e análise.
Métodos Utilizados
- Microscopia de força atômica em modo de contato
- Culturas de Staphylococcus aureus e Pseudomonas hunanensis
- Ensaios de exposição a nanopartículas
Principais Resultados
- A análise AFM revelou o tamanho e a distribuição das células bacterianas, com Staphylococcus aureus apresentando uma largura média de 1,25 micrômetros.
- Concentrações aumentadas de nanopartículas de óxido de magnésio levaram a mudanças morfológicas significativas nas células bacterianas.
- O estudo demonstra a eficácia do AFM para analisar a integridade estrutural bacteriana.
Conclusões
- Esta metodologia destaca a utilidade do AFM na microbiologia, particularmente na avaliação de danos bacterianos.
- Os resultados contribuem para uma compreensão mais ampla das respostas bacterianas aos tratamentos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
