Name: Quantificação em tempo real dos efeitos do tnpB associado à família IS200/IS605 na atividade do transposon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Aprenda a quantificar em tempo real a atividade do transposon mediada por TnpB em células individuais de Escherichia coli usando microscopia de fluorescência. Este método revela dinâmicas genéticas celulares com alta resolução.

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O apoio financeiro para esta pesquisa foi fornecido por fundos de inicialização da Universidade da Califórnia.

1. Preparação de culturas bacterianas
<ol><li>Cultivar a cepa MG1655 de E. coli com construções de transposon plasmídico (descritas anteriormente em Kim et al.8) durante a noite em LB com os antibióticos apropriados (25 μg/mL de canamicina, ver Tabela de Materiais) a 37 °C. NOTA: As sequências das construções utilizadas e as sequências relacionadas estão disponíveis como números de adesão do GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085.</li>
	<li>Para alcançar o crescimento exponencial em estado estacionário, diluir as culturas ≥100 vezes no meio M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL de tiamina [vitamina B1]) suplementada com uma fonte de carbono (0,5% p/v de glicose aqui) e antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Cultivar culturas a 37 °C até que a densidade óptica a 600 nm (OD600) atinja ~0,2. As culturas estão prontas para uso.</li>
</ol>2. Preparação de slides
<ol><li>Prepare uma lâmina fervendo M63 com 0,5% p/v de glicose e 1,5% p/v de agarose no micro-ondas para derreter a agarose e garantir que ela esteja completamente derretida e bem misturada.</li>
	<li>Deixe a mistura arrefecer a ~55 °C antes de adicionar antibióticos e indutores (25 μg/ml de canamicina e 10 ng/μL de anidrotetraciclina [aTc], ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque uma lâmina de microscópio na bancada de trabalho. Empilhe mais dois slides perpendiculares ao primeiro e coloque outro em cima, paralelo ao slide inferior. Verifique se há um espaço igual a uma espessura de slide entre os slides inferior e superior. Pipeta ~1 mL da mistura de agarose M63 nesta lacuna entre as lâminas lentamente para criar um pequeno quadrado de gel.</li>
	<li>Uma vez que o gel tenha solidificado (~ 10-15 min), deslize a parte superior para removê-lo. Apare a almofada de agarose com uma lâmina de barbear ou faca. Em seguida, pipetar 2,5 μL da cultura (passo 1.3) e colocar a tampa por cima.</li>
	<li>Sele o espaço entre a lâmina e a folha de cobertura com epóxi (consulte Tabela de materiais). Deixe secar o epóxi e as células se depositem na almofada de agarose durante, pelo menos, 1 h a 37 °C.</li>
</ol>3. Microscopia de fluorescência Timelapse
<ol><li>Colocar a amostra preparada (etapa 1.3) num microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) num ambiente aquecido e mantido a 37 °C.<ol><li>Defina os tempos de exposição apropriados para a câmera usada para aquisição de imagem. Ajuste a intensidade da iluminação para minimizar o fotobranqueamento. NOTA: Um tempo de exposição de 2 s para cada comprimento de onda foi utilizado para o presente estudo.</li>
		<li>Para cada comprimento de onda, encontre um Campo de Visão (FOV) contendo fluorescência mínima. Adquira imagens para usar durante a análise para subtração de fundo.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure um protocolo para adquirir imagens em uma grade em diferentes comprimentos de onda e em intervalos de tempo regulares.<ol><li>Codifique a fotografia de timelapse no protocolo. Defina a frequência de aquisição para o intervalo de tempo desejado (20 min aqui) e a duração total do timelapse para o comprimento desejado (24 h).</li>
		<li>Codifique comprimentos de onda apropriados no protocolo (dependendo da construção usada). NOTA: O pico de excitação mCherry está a 587 nm e o pico de emissão a 610 nm21; mVenus está em 515 nm e 527 nm12, enquanto mCerulean3 está em 433 nm e 475 nm11.</li>
		<li>Defina o tamanho da grade a ser capturado entre o número desejado de FOVs. NOTA: Os dados representativos mostrados aqui usaram 8 x 8 FOVs.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de imagem
<ol><li>Execute a subtração de plano de fundo em cada canal de cor usando as respectivas imagens de plano de fundo adquiridas na etapa 3.1.2. Para todas as etapas de análise, usamos módulos padrão na plataforma de código aberto Fiji22 (consulte Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aproxime a população total em cada ponto no tempo, limitando o canal mCerulean e dividindo a área limiar pela área celular média.</li>
	<li>Para contar os eventos de excisão exclusivos, pegue a derivada de tempo do canal mCerulean3. Execute isso subtraindo imagens sucessivas no canal mCerulean3. Os eventos de excisão serão detectados na derivada do tempo como um flash brilhante de fluorescência.<ol><li>Limite da pilha de eventos de excisão para eliminar a fluorescência indesejada. Observe que esse processo limitará partes das próprias excisão. Para corrigir isso, dilate as imagens para restaurar as excisões aos seus tamanhos originais. NOTA: Análises usando técnicas semelhantes de limiares e análise de imagem também podem ser realizadas nos outros canais de fluorescência (por exemplo, correlacionar eventos de excisão com níveis de transposase TnpA [fluorescência amarela de Vênus] e TnpB [fluorescência mCherry vermelha].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O método único apresentado aqui para imagens em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células vivas é um ensaio sensível que pode detectar diretamente a transposição em células vivas e em tempo real e correlacionar essa atividade com a expressão de proteínas acessórias. Embora a taxa de transferência seja menor do que pode ser realizada por métodos a granel, este método alcança medições detalhadas da atividade de ET e da expressão de proteínas em células vivas individuais.
Uma ...

Elementos transponíveis (TEs) são elementos genéticos que se mobilizam dentro de seus genomas hospedeiros por excisão ou catalisação de cópia seguida de reintegração genômica. Os TEs existem em todos os domínios da vida, e a transposição reestrutura o genoma do hospedeiro, mutando regiões de codificação e controle1. Isso gera mutações e diversidade que desempenham um papel importante na evolução2,3, desenvolvimento4,5 e diversas doenças humanas6, incluindo o câncer7.
Usando novas construções genéticas que acoplam aspectos da atividade transposicional a repórteres fluorescentes, nosso trabalho anterior descreveu o desenvolvimento de um sistema experimental baseado na bactéria TE IS608, um representante da ampla família de TEs IS200/IS605, que permite a visualização em tempo real da transposição em células vivas individuais 8 (Figura 1). O sistema TE é exibido na Figura 1A. O TE compreende a sequência de codificação da transposase, tnpA, ladeada por repetições palindrômicas imperfeitas (IPs) da extremidade esquerda (LE) e da extremidade direita (RE), que são os locais de reconhecimento e excisão para TnpA. O tnpA é expresso usando o promotor PLTetO1, que é reprimido pelo repressor tet e é induzível com anidrotetraciclina (aTc)9. O TE divide as sequências -10 e -35 de um promotor constitutivo PlacIQ1 10 para o repórter azul mCerulean311. Como mostra a Figura 1C, quando a produção de tnpA é induzida, o TE pode ser extirpado, levando à reconstituição do promotor. A célula produzida expressa mCerulean3 e fluoresce azul. O N-terminal de TnpA é fundido ao repórter amarelo Vênus12, permitindo a medição dos níveis de TnpA por fluorescência amarela.
IS608 e outros membros da família de transposons IS200/IS605 também codificam tipicamente um segundo gene da função até agora desconhecida, tnpB13. As proteínas TnpB são uma família de nucleases tremendamente abundante, mas imperfeitamente caracterizadas, codificadas por vários TEs bacterianos e arqueais 14,15, que muitas vezes consistem apenas em tnpB 16. Além disso, estudos recentes renovaram o interesse no TnpB ao descobrir que o TnpB funciona como uma endonuclease guiada por RNA programável semelhante à CRISPR/Cas que produzirá quebras de dsDNA ou ssDNA sob diversas condições17,18. No entanto, ainda não está claro qual o papel que o TnpB pode desempenhar na regulação da transposição. Para realizar a visualização em tempo real dos efeitos do TnpB na transposição do IS608, foi criada uma versão do transposon, incluindo a região codificadora do TnpB com uma fusão N-terminal para a proteína fluorescente vermelha mCherry.
Complementando estudos mais detalhados em nível de volume realizados pelo laboratório Kuhlman19, é mostrado aqui como a imagem em tempo real da atividade do transposon pode revelar quantitativamente o impacto do TnpB ou de quaisquer outras proteínas acessórias na dinâmica transposicional. Ao fundir TnpB a mCherry, os eventos transposicionais individuais são identificados por fluorescência azul e correlacionados com os níveis de expressão de TnpA (fluorescência amarela) e TnpB (fluorescência vermelha).

<table><tbody><tr><td>2 Ton Clear Epoxy</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de anidrotetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Laser de Argônio</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Azul</td><td>Cubo Chroma</td><td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glicose</td><td>Microscópio Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Descontinuado</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Caixas e Bandejas de Recarga, Volume: 0.1 a 10 &micro; L, Comprimento: 3,4 cm, 1,33 pol., PP (Polipropileno)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Caixas e Bandejas de Recarga, Volume: 50 a 1000 &micro; L, Comprimento: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polipropileno)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato Ferroso Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Fiji (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Broth, Miller (Granulado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro Deslizante</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Aquecedor</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Estágio</td><td>Anterior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de Filtro Vermelho</td><td>Chroma</td><td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP Laser</td><td>Coherent</td><td>1170412</td><td></td></tr><tr><td>Slide, Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Lançamento a Laser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubo de Filtro Amarelo</td><td>Chroma</td><td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação em tempo real dos efeitos do tnpb associado à família is200/is605 na atividade do transposon

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Aqui, um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo e em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células bacterianas vivas usando um conjunto de repórteres fluorescentes acoplados à transposição. Em particular, demonstra como a imagem em tempo real pode ser usada para avaliar os efeitos da proteína acessória TnpB na atividade do elemento transponível IS608, um membro da família de elementos transponíveis IS200/IS605. A família de elementos transponíveis IS200/IS605 são elementos móveis abundantes conectados a um dos mais inúmeros genes encontrados na natureza, o tnpB. As homologias de sequência propõem que a proteína TnpB pode ser um precursor evolutivo dos sistemas CRISPR/Cas9. Além disso, o TnpB recebeu interesse renovado, tendo sido mostrado para atuar como uma endonuclease de DNA guiada por RNA semelhante a Cas. Os efeitos do TnpB sobre as taxas de transposição do IS608 são quantificados, e demonstra-se que a expressão do TnpB do IS608 resulta em ~5x maior atividade de transposon em comparação com as células sem expressão do TnpB.

Este método de visualização da atividade de transposon em células vivas por microscopia de fluorescência, embora tenha menor rendimento do que as medições de fluorescência em massa, permite a visualização direta da atividade de transposon em células vivas individuais. Os eventos de excisão do transposon resultam na reconstituição do promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitindo a identificação de células submetidas à atividade do transposon por fluorescência azul brilhante (Figura 2, TnpB+...

Um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo em tempo real para quantificar como a proteína acessória TnpB afeta a dinâmica de transposição em células vivas individuais de Escherichia coli .

Quantificação em tempo real dos efeitos do tnpB associado à família IS200/IS605 na atividade do transposon

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Este protocolo nos permite quantificar as estatísticas de excisão em uma base de célula única, em vez de olhar para o comportamento em massa. Nesse nível, podemos rastrear o comportamento de células individuais ao longo do tempo, incluindo seus níveis de TnpA e TnpB para células que extirpam versus células que não o fazem, o que pode nos permitir, por exemplo, medir os efeitos de eventos mutacionais identificados na taxa de crescimento. Este método é uma maneira simples e de baixo custo de medir a dinâmica mutacional das células vivas.A abordagem geral é aplicável a qualquer sistema que exija imagens fluorescentes de células vivas. Prepare uma lâmina fervendo M63 com 0,5% de glicose e 1,5% de agarose no micro-ondas para derreter a agarose. Certifique-se de que o meio esteja completamente derretido e bem misturado.Deixe a mistura esfriar a 55 graus Celsius antes de adicionar antibióticos e indutores. Coloque uma lâmina de microscópio na bancada de trabalho. Empilhe um slide perpendicular ao primeiro.Verifique se há um espaço igual a uma espessura de slide entre o slide inferior e superior. Pipete um mililitro da mistura de agarose M63 no espaço entre a lâmina lentamente para criar um pequeno quadrado de gel. Uma vez que o gel tenha solidificado, deslize a parte superior para removê-lo.Apare a almofada de agarose com uma lâmina de barbear ou faca. Em seguida, pipete 2,5 microlitros da cultura bacteriana e coloque a tampa deslize por cima. Selar o espaço entre a lâmina e a tampa com epóxi.Deixe o epóxi secar e as células se depositem na almofada de agarose por uma hora a 37 graus Celsius. Coloque a amostra preparada em um microscópio de fluorescência em um ambiente aquecido e mantido a 37 graus Celsius. Para cada comprimento de onda, encontre o campo de visão que contém fluorescência mínima.Configure um protocolo para adquirir imagens em uma grade em diferentes comprimentos de onda e em intervalos de tempo regulares. Eventos de excisão de transposon resultam na reconstituição do promotor de mCerulean3, permitindo a identificação de células submetidas à atividade de transposon por fluorescência azul brilhante. O TnpB aumenta a taxa de excisão de transposon.As células que expressam a proteína acessória TnpB experimentam níveis quatro a cinco vezes mais altos de atividade de transposon em comparação com as células TnpB-negativas. Em células positivas para TnpB, as células submetidas a eventos de excisão de transposon têm níveis de expressão mais elevados de mCherry TnpB do que a população em geral. Além disso, para as células submetidas a eventos de excisão, as células positivas para TnpB expressam níveis apenas marginalmente mais elevados de TnpA-transposase venosa do que as células TnpB-negativas, que é superior à fluorescência amarela da população em geral.O lugar mais provável para lutar é na preparação da cultura de células para o experimento. Você deve certificar-se de que as células são cultivadas para a fase exponencial e que a lâmina é inoculada com um número apropriado de células. Lembre-se de tomar cuidado com as bolhas ao selar a lâmina para que o gel de agarose não seque.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Gerando bibliotecas de inserção de transposons em bactérias Gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento. J. Vis. (2020)Este vídeo demonstra a seleção, quantificação e preservação de bactérias receptoras Gram-negativas portadoras de inserções de transposons com base na resistência à canamicina.

Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.

Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .

Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

Este protocolo descreve um método para alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano pelo sistema transcriptionally regulado de Bela adormecida . Preparação da integração dos vetores de Lentivirus defeituosos, a transdução em vitro de células humanas e o ensaio molecular em células transduzidas são relatados.

Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Este é um método adaptado para identificar fatores de colonização de insetos candidatos em um simbionte benéfico da Burkholderia. O hospedeiro de besouro é infectado por uma biblioteca mutante aleatória gerada via mutagênese transposon, e a complexidade da biblioteca após a colonização é comparada a um controle cultivado in vitro.

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

Aprenda a quantificar em tempo real a atividade do transposon mediada por TnpB em células individuais de Escherichia coli usando microscopia de fluorescência. Este método revela dinâmicas genéticas celulares com alta resolução.

Quantificação em tempo real dos efeitos do tnpB associado à família IS200/IS605 na atividade do transposon

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