Name: In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio em neurônios sensoriais primários de gânglios da raiz dorsal em camundongos Pirt-GCaMP3. Este método permite monitorar até 1.800 neurônios simultaneamente para estudar respostas ao estímulo e alodinia.

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Este trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (para Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) e um Rising STAR Award da University of Texas system (Y.S.K.).

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
<li>Wessels, W. J., Marani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rostrocaudal+somatotopic+organization+in+the+brachial+dorsal+root+ganglia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology+and+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats.</a> Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+neurons+in+dorsal+root+ganglia+L4-L6+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat.</a> The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).</li>
<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
<li>Basbaum, A. I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pain.</a> Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+somatic+sensory+neuron+diversity+and+implications+on+sensory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Stucky, C. L., Mikesell, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+pain+in+disorders+affecting+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves.</a> Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+afferents+use+different+coding+strategies+for+heat+and+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold.</a> Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).</li>
<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A dor persistente está presente em uma ampla gama de distúrbios, debilitando e/ou reduzindo a qualidade de vida de cerca de 8% das pessoas29. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, e sua plasticidade contribui para a dor persistente8. Enquanto os neurônios podem ser estudados em cultura celular e explantes, fazê-lo os remove de seu contexto fisiológico normal. A exposição cirúrgica do DRG, seguida de Pirt-GCaMP3 Ca2+, permite o estu...

Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente a pele e transportam informações somatossensoriais de volta ao sistema nervoso central 1,2. Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são aglomerados de corpos celulares de 10.000-15.000 neurônios sensoriais primários 3,4. Os neurônios DRG apresentam diversos tamanhos, níveis de mielinização e padrões de expressão gênica e receptora. Neurônios de menor diâmetro incluem neurônios sensíveis à dor e neurônios de maior diâmetro tipicamente respondem a estímulos mecânicos não dolorosos 5,6. Distúrbios nos neurônios sensoriais primários, como lesão, inflamação crônica e neuropatias periféricas, podem sensibilizar esses neurônios a vários estímulos e contribuir para dor crônica, alodínia e hipersensibilidade à dor 7,8. Portanto, o estudo dos neurônios DRG é importante na compreensão da somatosensação em geral e de muitos transtornos de dor e coceira.
Neurônios disparando in vivo são essenciais para a somatosensação, mas até recentemente, ferramentas para estudar gânglios intactos in vivo eram limitadas a um número relativamente pequeno de células 9. Aqui, descrevemos um método poderoso para estudar os potenciais de ação ou atividades de neurônios em nível populacional in vivo como um conjunto. O método emprega imagens baseadas na dinâmica citoplasmática do Ca2+. Os indicadores fluorescentes sensíveis ao Ca 2+ são bons proxies para medir a atividade celular devido à concentração normalmente baixa de Ca2+ citoplasmático. Esses indicadores têm permitido o monitoramento simultâneo de centenas a vários milhares de neurônios sensoriais primários em camundongos 9,10,11,12,13,14,15,16 e ratos 17. O método de imagem in vivo de Ca2+ descrito neste estudo pode ser usado para observar diretamente as respostas em nível populacional a estímulos mecânicos, frios, térmicos e químicos.
A proteína de membrana ligadora de fosfoinositídeos, Pirt, é expressa em níveis elevados em quase todos (>95%) neurônios sensoriais primários18,19 e pode ser usada para conduzir a expressão do sensor Ca 2+, GCaMP3, para monitorar a atividade dos neurônios in vivo20. Neste protocolo, são descritas técnicas para a realização de cirurgia DRG in vivo, imagem por Ca2+ e análise no DRG lombar 5 (L5) direito de camundongos Pirt-GCaMP314 usando microscopia confocal de varredura a laser (LSM).

<table><tbody><tr><td>Injeção Anased (Xilazina)</td> <td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apocromático 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores com Ponta de Algodão</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Curvo</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>DC Controlador de Temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento do controlador de temperatura DC</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps revestido de cerâmica Dumont</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC Controlador de temperatura DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso (isoflurano)</td> <td>MWI Saúde Animal, Piramal Grupo</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (Cetamina)</td> <td>Zoetis</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Palco Verde Luminescente</td><td>JSITON/ Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 Vaporizador de Isoflurano</td><td>Midmark</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura de dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Micro mola de dissecação tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura de mola de dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sonda de Termistor Retal</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J ratos</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N / A</td><td>Ambos os sexos podem ser visualizados igualmente bem. Os camundongos devem ter pelo menos 8 semanas de idade devido à expressão fraca ou intermitente do promotor de Pirt em camundongos mais jovens.</td></tr><tr><td>Algômetro de pequenos animais SMALGO</td><td>Bioseb Instrumentos de pesquisa in vivo</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Kopf Modelo 923-B</td><td>923-B</td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL / 6J camundongos</td><td>Jackson Laboratory</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>Placa superior, 6 pol x 10 pol</td><td>Newport</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL / 6J camundongos</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Zeiss LSM 800</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

A imagem por Ca 2+ pode ser usada como proxy da atividade celular, incluindo potenciais de ação e vários mecanismos de sinalização envolvendo a entrada de Ca 2+ no citoplasma ou a liberação de depósitos intracelulares de Ca2+. A imagem de Ca2+ baseada em Pirt-GCaMP3 de neurônios sensoriais primários do gânglio da raiz dorsal (DRG) em camundongos oferece a vantagem da medição simultânea de um grande número de células. Até 1.800 neurônios podem ser monitorados, permitindo que redes neuronais e processos somatossensoriais sejam estudados como um conjunto em seu contexto fisiológico normal em nível populacional in vivo. O grande número de neurônios monitorados permite a detecção de padrões de atividade que seriam difíceis de detectar usando outros métodos. Os estímulos podem ser aplicados na pata traseira do camundongo, permitindo que os efeitos diretos dos estímulos no conjunto de neurônios DRG sejam estudados. O número de neurônios produzindo transientes de Ca 2+, bem como a amplitude de transientes de Ca2+, indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. O diâmetro dos neurônios fornece evidências de tipos de fibras ativadas (fibras mecanas não nocivas vs. fibras dolorosas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Neurônios que expressam receptores específicos podem ser geneticamente marcados com td-Tomato e recombinases específicas de Cre juntamente com Pirt-GCaMP. Portanto, a imagem Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fornece uma poderosa ferramenta e modelo para a análise de modalidades sensoriais específicas e subtipos de neurônios atuando como um conjunto em nível populacional para estudar dor, coceira, toque e outros sinais somatossensoriais.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> Figura 4: Imagens representativas dos gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3. (A,D) Imagens de alta resolução de quadro único de gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3 são mostrados. (B,E) . Projeções de intensidade média de 15 quadros dos gânglios do Pirt-GCaMP3 L5 DRG...

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

O número de neurônios monitorados usando este método permite a coleta de dados da rede de neurônios que seriam impossíveis usando métodos mais antigos ou outros. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de monitorar quase 2.000 neurônios sensoriais primários de uma só vez, respondendo diretamente aos estímulos aplicados à pata traseira. Este procedimento é especialmente adequado para estudar intervenções terapêuticas para alodínia periférica e hipersensibilidade à dor.Este método pode ser adaptado para o estudo de gânglios trigeminais ou geniculados ou usado com sensores codificados geneticamente para moléculas de voltagem ou sinalização celular, como o AMP cíclico. É preciso prática para realizar essa cirurgia. Você pode praticar em até seis gânglios da raiz dorsal em um único animal.Quem demonstrará o procedimento será eu, com a ajuda de John Shannonhouse e do Sr. Ruben Gomez. Para começar, coloque o mouse em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Localize o aumento lombar sentindo o osso pélvico do rato.Em seguida, raspe a parte de trás do mouse acima da área de alargamento lombar. Usando tesoura, faça uma incisão retangular de trê

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

O presente protocolo descreve imagens de cálcio in vivo para medir as respostas de conjuntos de neurônios lombares-6 DRG a estímulos somáticos e viscerais. Comparações completas podem ser feitas entre neurônios que respondem a diferentes estímulos. Este protocolo é valioso para investigar mecanismos de dor visceral e estimulação somática, como a acupuntura.

in vivo Imagem de cálcio da resposta dos neurônios dos gânglios da raiz dorsal a estímulos somáticos e viscerais

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este estudo apresenta uma manipulação cirúrgica para expor o T-DRG em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo , juntamente com registros de ECG síncronos. Este método representa uma ferramenta de ponta para estudar a estimulação elétrica nervosa periférica e as entradas de órgãos viscerais torácicos, bem como suas interações no nível sensorial primário.

Imagem de cálcio dos gânglios da raiz dorsal torácica (DRG) in vivo e registro de ECG para estudar a estimulação de nervos periféricos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Atividade espontânea de desenvolvimento de redes neuronais podem ser medidos utilizando-AM éster formas de corantes de cálcio sensível indicador. Alterações de cálcio intracelular, o que indica a ativação neuronal, são detectados como alterações transitórias na fluorescência indicador com um ou dois fótons de imagem. Este protocolo pode ser adaptada para uma série de developmentally dependentes de redes...

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

Implantar matrizes organizados de microfios para utilização em gravações eletrofisiológicas unitárias apresenta uma série de desafios técnicos. Métodos para a realização desta técnica e os equipamentos necessários são descritos. Além disso, discute-se o uso benéfico de matrizes microfios organizados para gravar a partir de sub-regiões neurais distintos, com alta seletividade espacial.

Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

Aprenda a realizar imagem de cálcio em neurônios sensoriais primários de gânglios da raiz dorsal em camundongos Pirt-GCaMP3. Este método permite monitorar até 1.800 neurônios simultaneamente para estudar respostas ao estímulo e alodinia.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

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