Sistema de detecção de vírus de DNA baseado em RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e aprendizado profundo
10 de maio de 2024
Apresentamos um protocolo que combina amplificação da polimerase recombinase com um sistema CRISPR/Cas12a para detecção de traços de vírus de DNA e constrói microscopia portátil para smartphone com uma classificação assistida por inteligência artificial para detecção de vírus de DNA no local de atendimento.
Nosso protocolo introduz um sistema de detecção rápido e altamente sensível para o vírus da rã 3. Significativamente, esse método permite a detecção de vírus de DNA no local de atendimento, desempenhando um papel crucial na prevenção da ocorrência de doenças pandêmicas. A principal vantagem dessa técnica está na integração do RPA com o sistema CRISPR/Cas12a, complementado por um microscópio portátil baseado em smartphone e classificação de IA.
Essa integração aumenta significativamente a eficiência e a precisão da detecção, ao mesmo tempo em que reduz os erros atribuídos a fatores humanos. Para começar, adicione as quatro principais enzimas RPA no tampão de reação. Em seguida, adicione os primers pré-projetados à mistura.
Vortex a mistura completamente. Adicione um microlitro do DNA alvo obtido do vírus 3 da rã a cada reação de RPA e vortex para misturar bem. Em seguida, pipete sete microlitros de cloreto de magnésio 100 milimolar para iniciar a reação.
Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos para completar o ensaio. Prepare a proteína CAS12a da bactéria Lachnospiraceae com RNA CRISPR para formar complexos funcionais. Misture a proteína bacteriana e 10 X tampão de reação CRISPR / Cas12a.
Agora adicione 500 nanomolares de sonda repórter de DNA de fita simples. Adicione um microlitro de produto de reação RPA à mistura de reação de RNA CRISPR / Cas12a. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Meça os sinais fluorescentes com um leitor de microplacas. Para detecção com um microscópio de smartphone, primeiro pipete a mistura de reação preparada em uma lâmina de vidro recuada. Em seguida, cubra-o com uma lamínula antes da incubação.
Coloque a lâmina no palco do microscópio do smartphone e ajuste a distância focal e a clareza. Capture uma imagem para medir os sinais fluorescentes. Use ImageJ para medir o valor médio de cinza de cada imagem e o desvio padrão do valor médio de cinza em um grupo de concentração.
Adote o modelo de aprendizado profundo AlexNet 33 para classificação. Agora use o Python para remodelar as imagens de entrada para 224 por 224 por três canais. Por fim, use uma rede de backbone pré-treinada com o conjunto de dados ImageNet para extrair recursos de imagem.
O sexto par de primers proporcionou a máxima eficiência de amplificação e foram selecionados. O CRISPR RNA-3 provou ser o mais eficiente para clivagem colateral. O uso de um sistema de detecção desenvolvido com primers RPA selecionados e RNA CRISPR resultou em diferenças significativas entre 10 aM FV3 e controle.
O ponto mais importante a ser lembrado é a etapa específica de detecção do CAS 12a. O RNA CRISPR da reação pode ser modificado ou redesenhado para atingir outros vírus de DNA com base na detecção de CAS 12a. O método proposto pode auxiliar na avaliação preliminar da quantidade do vírus alvo.
Com base nisso, outros métodos como qPCR podem ser empregados para obter uma carga viral mais precisa. Esta técnica fornece uma tentativa preliminar de detecção portátil de vírus de DNA. Quanto ao vírus da rã 3 usado neste protocolo, a detecção oportuna pode levar a medidas de proteção eficazes, reduzindo as perdas na indústria de criação.
Visão Geral
Este estudo apresenta um sistema de detecção rápido e sensível para o vírus da rã 3, destacando a integração da amplificação mediada por recombinase (RPA) com o sistema CRISPR/Cas12a para permitir a detecção de vírus de DNA em ponto de atendimento. Este método inovador tem como objetivo aumentar a precisão e a eficiência da detecção, o que é crucial para prevenir surtos pandêmicos potenciais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia molecular
- Detecção de patógenos
- Diagnósticos na ponta da linha assistencial
Contexto
- A importância da detecção rápida de vírus na prevenção de pandemias.
- Integração de metodologias avançadas, como a tecnologia RPA e CRISPR.
- O papel de sistemas portáteis em avaliações diagnósticas prontas para o campo.
Métodos Utilizados
- Amplificação isotérmica mediada por recombinase (RPA)
- Sistema CRISPR/Cas12a
- Microscopia baseada em smartphone com classificação assistida por inteligência artificial
Resultados Principais
- Diferenciação significativa entre amostras de FV3 de 10 aM e amostras controle.
- Melhoria na precisão de detecção mediante o uso de iniciadores específicos e RNA CRISPR.
- Potencial para adaptar o método a outros vírus de DNA mediante modificação do RNA CRISPR.
Conclusões
- O estudo demonstra um método eficiente e portátil de detecção de vírus de DNA.
- Essa abordagem é relevante para medidas protetivas rápidas na indústria de criação, ilustrando sua importância na pesquisa biológica e na saúde pública.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Sistemas rápidos e portáteis de detecção de vírus de DNA são essenciais para intervenção precoce e contenção em ambientes de pesquisa e biotecnologia aplicada. A integração da RPA-CRISPR/Cas12a com microscopia baseada em smartphone e aprendizado profundo permite detecção sensível e específica por sequência no local de atendimento, reduzindo a dependência de laboratórios centralizados. Essa abordagem favorece a tomada acelerada de decisões e a mitigação de riscos ao longo dos processos de descoberta e tradução.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar rapidamente alvos de DNA viral para desvio de riscos mecanicistas.
- Apoia a validação funcional de reagentes de detecção e RNAs guia CRISPR.
- Facilita o triagem inicial de sistemas de detecção candidatos para avanço da carteira.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece uma leitura padronizada e quantitativa para a otimização e validação de ensaios.
- Permite fluxos de trabalho de detecção reprodutíveis e escaláveis, adequados para triagem em alta produtividade.
- Permite comparação robusta da eficiência de primers e RNA CRISPR para aprimoramento do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao permitir a detecção viral em campo.
- Garante continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de saídas quantitativas portáteis.
- Reduz o risco biológico ao possibilitar detecção e intervenção oportunas em modelos relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema integra a descoberta inicial, o desenvolvimento de ensaios e a pesquisa translacional ao fornecer uma plataforma portátil de detecção quantitativa adaptável a múltiplos vírus de DNA.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a validação de alvos por meio da detecção específica de sequência.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de fluorescência reprodutíveis para padronização de ensaios.
- Análises: Integra classificação baseada em aprendizado profundo para interpretação objetiva dos resultados com alta confiança.
- Pesquisa Translacional: Permite detecção rápida e pronta para campo, apoiando estudos pré-clínicos e de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a novos alvos virais mediante o redesenho de guias de RNA CRISPR.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na detecção viral.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de detecção.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço rápido de tecnologias de detecção.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em biologia molecular e no design de ensaios CRISPR.
- Necessita de acesso a dispositivos de imagem portáteis e infraestrutura computacional para análise com inteligência artificial.
- Requer padronização entre equipes no que diz respeito a protocolos de ensaio e interpretação de dados.
- Adaptável a diversos vírus de DNA mediante modificação das sequências de RNA CRISPR.
- Depende de validação preliminar antes da implantação em diferentes ambientes de campo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
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Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
