Sistema de detecção de vírus de DNA baseado em RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e aprendizado profundo

Nosso protocolo introduz um sistema de detecção rápido e altamente sensível para o vírus da rã 3. Significativamente, esse método permite a detecção de vírus de DNA no local de atendimento, desempenhando um papel crucial na prevenção da ocorrência de doenças pandêmicas. A principal vantagem dessa técnica está na integração do RPA com o sistema CRISPR/Cas12a, complementado por um microscópio portátil baseado em smartphone e classificação de IA.

Essa integração aumenta significativamente a eficiência e a precisão da detecção, ao mesmo tempo em que reduz os erros atribuídos a fatores humanos. Para começar, adicione as quatro principais enzimas RPA no tampão de reação. Em seguida, adicione os primers pré-projetados à mistura.

Vortex a mistura completamente. Adicione um microlitro do DNA alvo obtido do vírus 3 da rã a cada reação de RPA e vortex para misturar bem. Em seguida, pipete sete microlitros de cloreto de magnésio 100 milimolar para iniciar a reação.

Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos para completar o ensaio. Prepare a proteína CAS12a da bactéria Lachnospiraceae com RNA CRISPR para formar complexos funcionais. Misture a proteína bacteriana e 10 X tampão de reação CRISPR / Cas12a.

Agora adicione 500 nanomolares de sonda repórter de DNA de fita simples. Adicione um microlitro de produto de reação RPA à mistura de reação de RNA CRISPR / Cas12a. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Meça os sinais fluorescentes com um leitor de microplacas. Para detecção com um microscópio de smartphone, primeiro pipete a mistura de reação preparada em uma lâmina de vidro recuada. Em seguida, cubra-o com uma lamínula antes da incubação.

Coloque a lâmina no palco do microscópio do smartphone e ajuste a distância focal e a clareza. Capture uma imagem para medir os sinais fluorescentes. Use ImageJ para medir o valor médio de cinza de cada imagem e o desvio padrão do valor médio de cinza em um grupo de concentração.

Adote o modelo de aprendizado profundo AlexNet 33 para classificação. Agora use o Python para remodelar as imagens de entrada para 224 por 224 por três canais. Por fim, use uma rede de backbone pré-treinada com o conjunto de dados ImageNet para extrair recursos de imagem.

O sexto par de primers proporcionou a máxima eficiência de amplificação e foram selecionados. O CRISPR RNA-3 provou ser o mais eficiente para clivagem colateral. O uso de um sistema de detecção desenvolvido com primers RPA selecionados e RNA CRISPR resultou em diferenças significativas entre 10 aM FV3 e controle.

O ponto mais importante a ser lembrado é a etapa específica de detecção do CAS 12a. O RNA CRISPR da reação pode ser modificado ou redesenhado para atingir outros vírus de DNA com base na detecção de CAS 12a. O método proposto pode auxiliar na avaliação preliminar da quantidade do vírus alvo.

Com base nisso, outros métodos como qPCR podem ser empregados para obter uma carga viral mais precisa. Esta técnica fornece uma tentativa preliminar de detecção portátil de vírus de DNA. Quanto ao vírus da rã 3 usado neste protocolo, a detecção oportuna pode levar a medidas de proteção eficazes, reduzindo as perdas na indústria de criação.