Name: Indução de periodontite através de uma combinação de ligadura e injeção de lipopolissacarídeo em um modelo de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda a induzir periodontite experimental em ratos usando ligadura e injeção de lipopolissacarídeo. Este método permite avaliar a progressão da doença e testar intervenções terapêuticas de forma eficaz.

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Este trabalho contou com o apoio da Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Prova de conceito 2020), do Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, cofinanciado pelo FSE Fundo Social Europeu e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do FEDER (contrato com M.M.B; FI18/00104) e pela Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (contrato com a M.M.F.C; FPI/040/2020). Os autores agradecem à Dra. Anna Tomás e Maria Tortosa pela ajuda na cirurgia experimental e plataforma do IdISBa. Finalmente, obrigado à Faculdade de Odontologia da ADEMA pelo acesso ao scanner CBCT.

OBS: O protocolo experimental do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Pesquisa em Saúde das Ilhas Baleares (CEEA-UIB; número de referência 163/03/21).
1. Anestesia animal e preparo do procedimento
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (mordaças bucais de alumínio, explorador dentário, lança de diamante, tesoura cirúrgica, alicate microcirúrgico, um suporte de microagulha, um entalhador hollenback, um elevador microcirúrgico periosteal e uma tesoura microcirúrgica) (5 min a 135 °C) antes da cirurgia.</li>
	<li>Preparar todas as soluções necessárias para o procedimento em condições estéreis, conforme descrito:<ol><li>Preparar uma mistura de Cetamina (60 mg/mL) e Xilazina (8 mg/mL) misturando 1,6 mL de Cetamina com 1 mL de Xilazina diluída em Solução Tampão de Fosfato (PBS)/soro fisiológico. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Diluir o atipamezol até uma concentração final de 0,25 mg/mL em PBS/solução salina. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Diluir a buprenorfina até uma concentração final de 0,03 mg/mL em PBS/solução salina. Conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar 1 mL de Pg-LPS (1 mg/mL) em solução salina estéril. Conservar o stock a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Para o experimento, utilizaram-se ratos Wistar fêmeas e machos, com idade de 12 semanas e peso entre 210 e 350 g no momento da cirurgia. Manter os animais alojados em grupos sob ambiente adequado e condições constantes (20-24 °C, ciclos claro-escuro de 12 h por dia), com ração e água padrão, oferecidos ad libitum.</li>
	<li>Para induzir a anestesia, pesar o rato e administrar a mistura de cetamina/xilazina na concentração de 80/10 mg/kg por via intraperitoneal (IP), utilizando uma agulha hipodérmica estéril de 25 G e seringa de 1 mL.</li>
	<li>Após o rato estar anestesiado, colocar o animal de costas em uma plataforma cirúrgica aquecida; Durante o procedimento, cubra o corpo do animal para evitar a perda de calor. OBS: A profundidade da anestesia é avaliada pela perda do reflexo pedal durante o procedimento e pela monitorização dos sinais vitais. Se necessário, use um pequeno cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 2% em oxigênio a 100%. Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos após a indução da anestesia para proteger as córneas e evitar o ressecamento.</li>
	<li>Durante os procedimentos, administrar oxigênio a 100% usando um pequeno cone nasal e monitorar a frequência de pulso e a saturação de oxigênio por oximetria de pulso. OBS: Se a saturação de oxigênio e a frequência de pulso caírem abaixo de 95% e 190 bpm, respectivamente, interromper o procedimento e colocar o animal em decúbito lateral até atingir valores normais.</li>
	<li>Abra a boca do rato com uma mordaça de alumínio ao redor dos incisivos (superior e inferior), retraindo a língua com ela e estabilizando a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso aos molares inferiores. OBS: Caso o animal necessite ser colocado em decúbito lateral, retire a mordaça bucal antes de mudar de posição para favorecer a recuperação. Uma vez anestesiado o animal, coletar líquido crevicular gengival (GCF) antes da cirurgia (amostra em condições basais) (dia 0).</li>
	<li>Colete o GCF conforme descrito pelas seguintes etapas:<ol><li>Colocar o animal de costas sobre uma plataforma cirúrgica e estabilizar a maxila e a mandíbula em posição aberta com mordaças bucais de alumínio.</li>
		<li>Coletar GCF utilizando um total de quatro (dois para cada M1) ponto de papel absorvente nº 30 (0,03 cm de diâmetro x 3 cm de comprimento), inserindo-o na fenda gengival (espaço entre o epitélio gengival e o esmalte adjacente) ao redor do mesio-palatal de M1 até leve resistência. Mantenha o ponto de papel na mesma posição por um total de 30 s antes da remoção imediata.</li>
		<li>Após a coleta, transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco plástico e armazene a -80 °C até o desempenho do ensaio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Técnica de ligadura retentiva e injeção intragengival de Pg-LPS
OBS: O modelo de ligadura foi criado (dia 0) colocando-se uma ligadura de seda trançada estéril (5/0) ao redor do M1 bilateralmente dentro do sulco gengival com instrumental microcirúrgico e prendendo-a com os nós do cirurgião na superfície palatina. Os instrumentos microcirúrgicos utilizados foram um alicate microcirúrgico, um porta-microagulhas, um entalhador hollenback, um elevador microcirúrgico periosteal e uma tesoura microcirúrgica. Também foram utilizadas lupas cirúrgicas com fonte de luz LED (aumento de 3,6x).
<ol><li>Posicionar a cauda distal da sutura na face palatina da dentição e inserir o segmento proximal entre o contato de M1 e os segundos molares superiores (M2).</li>
	<li>Utilizar o elevador microcirúrgico periosteal para inserir a sutura dentro do sulco. Enrole a ligadura ao redor da superfície bucal do M1 com muito cuidado, pois os tecidos neste nível apresentam uma estreita zona de gengiva aderida. No aspecto palatino, certifique-se de que a sutura esteja apertada em ambas as extremidades para garantir que ela seja conduzida para o sulco gengival. OBS: Se for observada resistência ao inserir a sutura entre o M1 e o M2, o contato pode ser levemente aberto com um explorador dental e broca em forma de lança de diamante.</li>
	<li>Amarre as extremidades da sutura com um nó de cirurgião e corte as caudas o mais curto possível. Insira o nó no sulco. OBS: Pontas de instrumentos cirúrgicos podem causar trauma oral e sangramento. Prepare pequenos segmentos de gaze ou um cotonete para remover o sangue da cavidade oral e aplique pressão para parar qualquer hemorragia. O manejo cuidadoso dos tecidos moles com uma abordagem microcirúrgica minimiza as complicações cirúrgicas e leva a menos trauma tecidual.</li>
	<li>Após o posicionamento da ligadura, injetar 40 μL de Pg-LPS em solução salina estéril com agulha hipodérmica estéril 25 G e seringa de 1 mL no tecido subgengival (entre a raiz ou colo de um dente e a margem gengival) na face mesiopalatal do M1 bilateralmente (dia 0).</li>
</ol>3. Fim do procedimento
<ol><li>Após o posicionamento da ligadura e aplicação do Pg-LPS, solte o rato do estado cirúrgico e coloque-o em uma gaiola individual limpa sob uma lâmpada de calor.</li>
	<li>Injetar o antagonista Atipamezol (0,5 mg/kg por via subcutânea (SC)) com uma agulha hipodérmica estéril de 25 G e uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Para alívio da dor, injetar 0,03 mg/kg de Buprenorfina, SC.</li>
	<li>Monitore a recuperação do animal até que os efeitos da operação sejam completamente revertidos. Alojar individualmente cada rato no ambiente adequado em condições constantes (20-24 °C, ciclos claro-escuro de 12 h por dia). Ofereça comida e água deionizada ad libitum.</li>
	<li>Durante os primeiros 2 dias após o procedimento, pesar os animais e injetar Buprenorfina SC duas vezes ao dia para alívio da dor. NOTA: Buprenorfina pode ser administrada antes de iniciar o procedimento para eliminar o efeito de enrolamento.</li>
	<li>Durante o tempo do experimento, monitorar os animais por meio de avaliação de peso e comportamento geral uma ou duas vezes por semana.</li>
</ol>4. Seguimento pós-procedimento
OBS: A indução da DP foi mantida por 14 dias para promover o acúmulo de biofilme bacteriano e consequente inflamação. As ligaduras devem ser examinadas e ajustadas, e o Pg-LPS é injetado três vezes por semana (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12).
<ol><li>Examine e ajuste a ligadura (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12) da seguinte forma:<ol><li>Anestesiar com isoflurano a 2% em oxigênio a 100% com câmara de indução anestésica.</li>
		<li>Após anestesiar o rato, colocar o animal de costas e utilizar um pequeno cone nasal durante o procedimento com isoflurano a 1% em oxigênio a 100% para manutenção da anestesia do animal.</li>
		<li>Abra a boca do rato com o gag boca de alumínio ao redor dos incisivos (superior e inferior), retraindo a língua com ela e estabilizando a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso às ligaduras.</li>
		<li>Aperte as ligaduras contra a gengiva com a ajuda de um elevador microcirúrgico periosteal e certifique-se de que a sutura das ligaduras seja inserida, criando inflamação ao redor da gengiva. NOTA: É possível que 7-10 dias após a cirurgia, ligaduras são perdidas. Se isso acontecer, siga o protocolo conforme explicado para a injeção de Pg-LPS (passo 2.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Após o ajuste da ligadura, injetar-se bilateralmente 40 μL de LPS-Pg com agulha hipodérmica estéril 25 G e seringa de 1 mL no tecido subgengival da face mesiopalatina do M1 (dia 2, dia 4, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12).</li>
	<li>Retire o cone nasal para anestesia e coloque o rato em sua gaiola. Monitorar a recuperação do animal até que os efeitos da anestesia sejam completamente revertidos.</li>
</ol>5. Sacrifício e análise de animais
NOTA: Existem diferentes opções para avaliar a progressão da DP. Aqui, a análise descrita consiste na avaliação de citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular gengival (GCF) e na avaliação da perda de osso alveolar.
<ol><li>No dia 14 do estudo (dia 14), sacrificar os animais com CO2 em uma câmara de dióxido de carbono. Uma taxa de deslocamento de 30% a 70% do volume da câmara/min é recomendada para roedores. NOTA: A falta de resposta do animal ao reflexo pedal e a ausência de sinais vitais devem ser verificadas para confirmar a eutanásia.</li>
	<li>Colete o GCF conforme descrito pelas seguintes etapas: NOTA: O GCC é coletado antes da indução da DP (antes da cirurgia) (dia 0) e após a indução da DP (após o sacrifício) (dia 14).<ol><li>Colocar o animal de costas sobre uma plataforma cirúrgica e estabilizar a maxila e a mandíbula em posição aberta com paligas bucais de alumínio.</li>
		<li>Coletar o GCF com papel adsorvente ponto nº 30 (0,03 cm de diâmetro x 3 cm de comprimento) inserindo-o na fenda gengival ao redor do mesiopalato do M1 até obter ligeira resistência. Mantenha o ponto de papel na mesma posição por um total de 30 s antes da remoção imediata.</li>
		<li>Após a coleta, transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco plástico e armazene a -80 °C até o desempenho do ensaio.</li>
	</ol></li>
	<li>Para avaliar as proteínas dentro do GCF, prepare as seguintes soluções e siga os passos do método de eluição conforme descrito: OBS: A IL-1β é avaliada no GCF (dia 14) por imunoensaio, de acordo com o protocolo do fabricante.<ol><li>Prepare o tampão de eluição fresco e mantenha-o no gelo durante todo o processo de extração para inibir a atividade da protease.</li>
		<li>Prepare todas as soluções necessárias para o buffer de eluição conforme descrito:<ol><li>Preparar 1 mL de Aprotinina (1 mg/mL) em água ultrapura.</li>
			<li>Preparar 10 mL de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) (200 mM) em metanol.</li>
			<li>Adicionar 125 μL de PMSF e 250 μL de Aprotinina a 24,5 mL de solução de PBS (pH = 7,4) para preparar o tampão de eluição.</li>
		</ol></li>
		<li>Dissolver um comprimido comercial de inibidor de fosfatase com 10 ml de tampão de eluição recém-preparado durante 10 minutos sob agitação a 4 °C. NOTA: A duração da eluição do GCF é limitada; Use imediatamente para centrifugações após a adição de comprimido inibidor de fosfatase dentro dos primeiros 30 min.</li>
		<li>Depois de adicionar o inibidor de fosfatase, adicionar 11 μL de tampão de eluição completo diretamente no tubo com os pontos de papel.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 452 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira o conteúdo eluído para um novo frasco para injetáveis de plástico. Repita este processo mais quatro vezes para obter um volume total de 50 μL.</li>
		<li>Após a última centrifugação, adicionar um volume total de 60 μL diretamente no ponto de papel e centrifugar uma última vez a 452 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Use o volume eluído necessário para avaliação de proteínas.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a eutanásia e coleta do GCF, com a ajuda de tesoura cirúrgica, corte a mandíbula superior dos ratos. Tente tirar a máscara do rato e deixar o mínimo de tecido mole possível.</li>
	<li>Posicione a mandíbula no estágio do microscópio para visualização e tire uma foto na ampliação desejada.</li>
	<li>Coloque a mandíbula diretamente em paraformaldeído (PFA) a 4% diluído em PBS. Atualize duas vezes por semana com o novo PFA por 12 dias para uma fixação completa. CUIDADO: As etapas que envolvem PFA devem ser realizadas em um exaustor de fumaça seguindo as recomendações da Ficha de Dados de Segurança.</li>
	<li>Após a fixação completa da mandíbula, avaliar a perda óssea com o aparelho de tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC), da seguinte forma:<ol><li>Abra o PC.</li>
		<li>Abra o programa de análise CBCT.</li>
		<li>Selecione Protocolo de varredura > Modo de varredura de prótese.</li>
		<li>Selecione Campo de visão (FOV) > ( 11x8) HIRes ( 90 kV de tensão e 3 mA de corrente).</li>
		<li>Coloque a maxila superior fixa dos ratos no pórtico.</li>
		<li>Clique em Avançar.</li>
		<li>Clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).</li>
		<li>Se necessário, realoque a maxila superior no centro do plano frontal pressionando o botão de controle e, em seguida, clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).</li>
		<li>Clique em Avançar.</li>
		<li>Clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante toda a duração da varredura).</li>
		<li>Se necessário, realoque a prótese no centro do plano sagital pressionando o botão de controle e, em seguida, clique no botão de disparo de raios-X (pressione o controle remoto de raios-X para fazer a emissão e mantê-la pressionada durante toda a duração da varredura).</li>
		<li>Clique em Avançar.</li>
		<li>Clique no botão Iniciar (pressione o controle remoto de raio-X para fazer a emissão e mantê-lo pressionado durante todo o exame). Aguarde até receber uma mensagem de processamento e siga as instruções mostradas.</li>
		<li>Uma exibição de janela é exibida. Regule o cinza em 65% e clique em Aplicar.</li>
		<li>Para salvar a digitalização, clique em Arquivo e salve-o no formato DICOM. Em seguida, clique em Todas as imagens e, na janela de seleção de exportação DICOM, selecione todos os parâmetros mostrados (imagem inicial, axial original, axial reformatado, multiplanar) e selecione o tipo predefinido.</li>
	</ol></li>
	<li>Processar as imagens representativas bidimensionais e sagitais dos molares superiores utilizando um programa de análise, da seguinte forma:<ol><li>Abra o software.</li>
		<li>Clique em Arquivo e Abrir e, em seguida, selecione a pasta com imagens no formato DICOM e clique em Abrir.</li>
		<li>Aguarde até que a janela "Converter para 8 bits" apareça, selecione o intervalo de 0 a 6.000 e clique em OK.</li>
		<li>Clique em Imagens brutas.</li>
		<li>Defina a parte superior e inferior da seleção para limitar a região de interesse. Procure a primeira e a última imagens onde o osso alveolar aparece e selecione-o com a parte superior da seleção e a parte inferior dos comandos de seleção . OBS: Imagens bidimensionais representativas do osso alveolar dos molares puderam ser exportadas, como na Figura 3A,B.</li>
		<li>Para imagens representativas do plano sagital, clique em Alternar barra de perfil.</li>
		<li>Desenhe uma linha sagital no meio do palato e clique em Modelo de recorte. Determine parâmetros para delimitar a região de interesse (espaçamento entre fatias: 1; número de fatias: 100) e clique em OK. Aguarde até que o modelo de refatiamento termine. Por fim, clique em Salvar imagens em fatias. OBS: Imaginações sagitais representativas do osso alveolar dos molares poderiam ser exportadas, como na Figura 3C,D.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assessment+of+alveolar+bone+destruction+in+adult+rats+using+CBCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT.</a> Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).</li>
<li>Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone-beam+computed+tomography+%28CBCT%29+imaging+for+the+assessment+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oral+Health+Reports%22%5BJournal%5D)">Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease.</a> Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Este método descreve a indução de DP em ratos após uma técnica combinada de injeções de Pg-LPS e colocação de ligadura ao redor do M1, revelando que alterações significativas nos tecidos periodontais e no osso alveolar poderiam ser induzidas em 14 dias após esse método.
Durante este procedimento, deve-se prestar atenção às diferentes etapas críticas. Durante a anestesia do animal e o preparo do procedimento, avaliar a anestesia adequada durante o processo cirúrgico é fundamental para ...

A periodontite (DP) é a sexta condição de saúde pública mais prevalente no mundo, afetando aproximadamente 11% da população total, sendo uma forma avançada, irreversível e destrutiva da doença periodontal 1,2. A DP é um processo inflamatório que afeta os tecidos gengival e periodontal, resultando em recessão gengival, migração apical do epitélio juncional com desenvolvimento de bolsa e perda de osso alveolar3. Além disso, a DP está associada a várias doenças sistêmicas, incluindo doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes e artrite reumatoide, para as quais fatores ambientais e específicos do hospedeiro desempenham um papelsignificativo4,5.
Assim, a DP é uma doença multifatorial iniciada primariamente pelo acúmulo de placa microbiana - resultante da disbiose das comunidades microbianas - e por uma resposta imune exagerada do hospedeiro aos patógenos periodontais, o que leva à quebra do tecido periodontal 4,6. Dentre as várias bactérias periodontais, a bactéria anaeróbia gram-negativa Porphyromonas gingivalis é um dos principais patógenos na DP4. P. gingivalis contém um complexo lipopolissacarídeo (LPS) em suas paredes, molécula conhecida por induzir infiltração leucocitária polimorfonuclear e dilatação vascularem tecidos periodontais inflamados7. Isso resulta na produção de mediadores inflamatórios, como interleucina 1 (IL-1), IL-6 e IL-8, fator de necrose tumoral (TNF) ou prostaglandinas, com subsequente ativação osteoclástica e reabsorção óssea, levando à destruição tecidual e perda dentária final3.
Entre as diferentes vantagens dos modelos animais estão a capacidade de mimetizar complexidades celulares como em humanos, ou de ser mais preciso do que estudos in vitro , que são realizados em superfícies plásticas com tipos celulareslimitados8. Para a modelagem experimental in vivo da DP, diferentes espécies animais têm sido utilizadas, como primatas não humanos, cães, porcos, furões, coelhos,camundongos e ratos9. No entanto, o rato é o modelo animal mais estudado para a patogênese da DP por ser de baixo custo e fácilmanuseio10. Seu tecido gengival dentário tem características estruturais semelhantes ao tecido gengival humano, com sulco gengival raso e epitélio juncional aderido à superfície dentária. Além disso, como em humanos, o epitélio juncional facilita a passagem de bactérias, materiais estranhos e exsudatos das células inflamatórias 9.
Um dos modelos experimentais de indução de DP em ratos mais relatados é a colocação de ligaduras ao redor dos dentes, o que é tecnicamente desafiador, masconfiável10. A colocação da ligadura facilita a placa dental e o acúmulo bacteriano, gerando uma disbiose nos sulcos gengivais, que causa inflamação e destruição do tecido periodontal11. A perda da inserção periodontal e da reabsorção do osso alveolar poderia ocorrer em 7 dias neste modelo derato8.
Outro modelo animal para DP consiste na injeção de LPS no tecido gengival. Como resultado, a osteoclastogênese e a perda óssea são estimuladas. As características histopatológicas desse modelo são semelhantes às da DP estabelecida pelo homem, caracterizada por maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias, degradação do colágeno e reabsorção óssea alveolar6,8.
Assim, o objetivo deste estudo foi descrever um modelo simples de DP experimental em ratos, baseado nas técnicas de injeção de P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), combinado com a colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares superiores (M1). Trata-se de um modelo com características semelhantes às observadas na DP humana, que poderá ser utilizado no estudo dos mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.

<table><tbody><tr><td>Ponto de papel adsorvente n&ordm; 30&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>8187</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>Dechra</td><td>573751.5</td><td>Revanzol 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Ligadura de seda trançada (5/0)&nbsp;</td><td>Laboratorio Arago Sl</td><td>613112</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Scanner de</td> tomografia computadorizada de feixe cônico (CBCT) Bupaq <td>578816.6</td><td>Bupaq 0.3 mg/mL</td>da Richter pharma</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MyRay</td><td>hyperion X9</td><td>Modelo Hyperion X9</td></tr><tr><td>CTAm software</td><td>SkyScan</td><td></td><td>Versão 1.13.4.0</td></tr><tr><td>Explorador dental&nbsp;</td><td>Proclinc</td><td>99743</td><td></td></tr><tr><td>Broca em forma de lança de diamante&nbsp;</td><td>Dentaltix</td><td>IT21517</td><td></td></tr><tr><td>Dieta de manutenção de alimentos</td><td>Sodispain research</td><td>ROD14&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma cirúrgica aquecida</td><td>PetSavers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hollenback carver</td><td>Hu-FRIEDY&nbsp;</td><td></td><td></td>HF45234</tr><tr><td>Agulha hipodérmica&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>25G X 5/8" - 0,5 X 16 MM</td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Karizoo</td><td></td><td>Isoflutek 1000mg/g</td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Dechra</td><td>581140.6</td><td>Anesketin 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo&nbsp; derivado de P.Gingivalis&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>TLRL-PGLPS</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PB08</td><td></td></tr><tr><td>Micro agulha holter</td><td>Fehling Instrumentos Cirúrgicos</td><td>KOT-6</td><td></td></tr><tr><td>Alicate microcirúrgico</td><td>KLS Martin</td><td>12-384-06-07</td><td></td></tr><tr><td>tesoura microcirúrgica&nbsp;</td><td>S& T instrumentos microcirúrgicos</td><td>SDC-15 RV</td><td></td></tr><tr><td>Monitor iMEC 8 Vet</td><td>Mindray&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imunoensaio multiplex</td><td>Procartaplex, Thermo fisher Scientific</td><td>PPX-05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)&nbsp;</td><td></td> Elevador microcirúrgico periosteal <td>Sigma-Aldrich</td> 8187151000 <td></td></tr><tr><td></td><td>Dentaltix</td><td>CU19112468</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF)&nbsp;</td><td>Solução</td> Tampão de Fosfato <td>Roche 10837091001</td><td></td></tr><tr><td>(PBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP&nbsp;</td><td>Comprimido Roche</td><td>4906845001</td><td>Commercial para inibidor de fosfatase&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco de plástico</td><td>SPL Lifesciencies</td><td>60015</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Cinfa</td><td>204024.3</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo&nbsp;</td><td>Lupas cirúrgicas Zeiss</td><td></td><td>Model SteREO Discovery.V12</td></tr><tr><td>com luz led</td><td>Tesoura cirúrgica Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Seringa Zepf Surgical</td><td>08-1701-17</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD plastipak</td><td>303172</td><td>1mL</td></tr><tr><td>Micromotor odontológico veterinário</td><td>Eickemeyer</td><td>174028</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Calier</td><td>20102-003</td><td>Xilagesic 20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

indução de periodontite através de uma combinação de ligadura e injeção de lipopolissacarídeo em um modelo de rato

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

A periodontite (DP) é uma doença imuno-inflamatória crônica de alta prevalência do periodonto, que resulta em perda de tecido mole gengival, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar. Neste estudo, um método simples de indução de DP em ratos é descrito. Fornecemos instruções detalhadas para a colocação do modelo de ligadura ao redor dos primeiros molares superiores (M1) e uma combinação de injeções de lipopolissacarídeo (LPS), derivado de Porphyromonas gingivalis na face mesio-palatal do M1. A indução da periodontite foi mantida por 14 dias, promovendo o acúmulo de biofilme bacteriano e inflamação. Para validar o modelo animal, a IL-1β, um mediador inflamatório chave, foi determinada por imunoensaio no fluido crevicular gengival (GCF), e a perda óssea alveolar foi calculada por meio da tomografia computadorizada de feixe cônico (TCFC). Esta técnica mostrou-se eficaz em promover recessão gengival, perda óssea alveolar e aumento dos níveis de IL-1β no GCF ao final do procedimento experimental após 14 dias. Esse método mostrou-se eficaz na indução da DP, podendo ser utilizado em estudos sobre mecanismos de progressão da doença e futuros possíveis tratamentos.

Uma linha do tempo das etapas experimentais é apresentada na Figura 1. A Figura 2A mostra uma imagem da mandíbula após a intervenção cirúrgica, com colocação de ligadura ao redor do sulco de M1 no tempo 0 do experimento. A Figura 2B mostra como, após 14 dias do procedimento, a ligadura ao redor do M1 entra no sulco gengival, causando inflamação da gengiva e acúmulo infiltrativo.
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Neste estudo, um modelo de indução de periodontite em ratos é apresentado através de uma combinação de ligadura retentiva e injeções repetitivas de lipopolissacarídeo derivado de Porphyromonas gingivalis, durante 14 dias ao redor dos primeiros molares superiores. As técnicas de ligadura e injeção de LPS foram eficazes na indução de peridontite, resultando em perda óssea alveolar e inflamação.

Indução de periodontite através de uma combinação de ligadura e injeção de lipopolissacarídeo em um modelo de rato

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, ...

Este é um modelo de periodontite experimental em ratos, baseado nas técnicas de injeção de lipopolissacarídeos combinados com a colocação de ligaduras, oferecendo um método eficaz para estudar a progressão da doença e avaliar tratamentos para periodontite. A combinação de ambas as técnicas com métodos individuais culmina em uma rápida indução da doença, amplificando a resposta inflamatória destrutiva e aumentando a perda de tecido conjuntivo e reabsorção óssea alveolar. Este método fornece uma oportunidade valiosa para avaliar o impacto dos tratamentos de periodontite.Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Oscar Villa, PhD. Comece esterilizando todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Prepare uma mistura de cetamina e xilazina misturando 1,6 mililitros de cetamina com um mililitro de xilazina, diluído em PBS ou soro fisiológico, e armazene o estoque a quatro graus Celsius.Diluir atipamezol para uma concentração final de 0,25 miligramas por mililitro e buprenorfina para uma concentração final de 0,03 miligramas por mililitro em PBS ou soro fisiológico, e armazenar os estoques a quatro graus Celsius. Prepare um mililitro de PG-LPS em soro fisiológico estéril e armazene o estoque a menos 20 graus Celsius. Use ratos Wistar fêmeas e machos para o experimento.Manter os animais alojados em grupos em ambiente adequado, com ração e água padrão oferecidas ad libitum. Após o rato ser anestesiado, coloque o animal de costas em uma plataforma cirúrgica aquecida. Cubra o corpo do animal durante o procedimento para evitar a perda de calor.Administrar oxigênio a 100% usando um pequeno cone nasal e monitorar a frequência de pulso e a saturação de oxigênio por oximetria de pulso. Agora, abra a boca do rato usando uma mordaça de boca de alumínio ao redor dos incisivos. Retrair a língua com ela e estabilizar a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso aos molares inferiores.Coletar GCF utilizando um total de quatro papel absorvente ponto número 30, inserindo-o na fenda gengival ao redor do mesiopalatal do M1 até obter ligeira resistência. Mantenha o ponto de papel na mesma posição por 30 segundos antes da remoção imediata. Após a coleta, transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco plástico e armazene a 80 graus Celsius negativos até o desempenho do ensaio.Posicionar a cauda distal da sutura na face palatina da dentição e inserir o segmento proximal entre o contato de M1 e os segundos molares superiores. Utilizar o elevador microcirúrgico periosteal para inserir a sutura dentro do sulco. Enrole a ligadura ao redor da superfície bucal do M1 com muito cuidado, pois os tecidos neste nível apresentam uma estreita zona de gengiva aderida.Certifique-se de que a sutura seja apertada em ambas as extremidades para ser conduzida para o sulco gengival. Em seguida, amarre as extremidades da sutura com um nó do cirurgião e corte as caudas o mais curto possível. Insira o nó no sulco.Após o posicionamento da ligadura, injetar 40 microlitros de PG-LPS em solução salina estéril no tecido subgengival na face mesiopalatal do M1 bilateralmente. Para examinar e ajustar a ligadura, colocar o animal anestesiado de costas e utilizar um pequeno cone nasal durante o procedimento com isoflurano a 1% e oxigênio a 100% para manutenção da anestesia do animal. Abra a boca envolvente com o engasgo bucal de alumínio ao redor dos incisivos, retraindo a língua com ela e estabilizando a maxila e a mandíbula em uma posição de trabalho aberta e confortável, permitindo o acesso às ligaduras.Aperte as ligaduras contra a gengiva com a ajuda de um elevador microcirúrgico periosteal e certifique-se de que a sutura das ligaduras seja inserida, criando inflamação ao redor da gengiva. Após o ajuste da ligadura, injetar-se bilateralmente 40 microlitros de PG-LPS no tecido subgengival da face mesiopalatal de M1, conforme demonstrado anteriormente. Após sacrificar o animal no 14º dia, coletar GCF como mostrado anteriormente.Transfira o ponto de papel imediatamente para um frasco de plástico e armazene a menos 80 graus Celsius até o desempenho do ensaio. As imagens bidimensionais do osso alveolar dos molares superiores mostram maior volume ósseo no controle basal e maior perda óssea alveolar após o estabelecimento da periodontite. A análise das imagens sagitais destaca uma perda óssea alveolar mais significativa na área óssea inter-radicular de M1 e M2 após o estabelecimento da periodontite, em comparação com o grupo controle basal.Após o sacrifício, o palato apresentou diferenças na recessão gengival em M1 entre os diferentes grupos. O grupo periodontite apresenta migração gengival apical e inflamação da gengiva ao redor dos molares superiores mais acentuada quando comparado ao grupo controle basal. Além disso, o grupo periodontite mostrou uma liberação significativamente maior de citocina pró-inflamatória 1L-1 beta do GCF do que o grupo controle.Etapas cruciais no procedimento são o correto posicionamento da sutura e nó no sulco, ajuste adequado da ligadura e injeção precisa de lipopolissacarídeo durante o protocolo de 14 dias.

induction-periodontitis-via-combination-ligature-lipopolysaccharide

Research

JoVE Journal

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